Name: applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair
Uploaded: 2016-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
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The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.

すべての動物を人道的に処理し、すべてのプロトコルがバージニアIACUCの大学によって承認されました。 1.機器の準備<ol><li>すべてのマシンが正しく接続されていることを確認してください。 </li><li>ハイパワーバイフェーズ刺激とデュアルモードレバーシステムに続いて、コンピュータの電源を入れます。 </li><li>このとき、2％イソフルランで麻酔供給室に動物を配置し、プラットフォームを37℃に加熱するように加熱素子をオン。 </li><li>ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）コーティングされた先端が水没され、デバイスとソフトウェアの設定中に消毒されるように70％エタノールに電極を配置します。 </li><li>見つけて、デスクトップ上のレバーシステム制御ソフトウェアを開きます。 注：これは、機能テストを実行するのに必要なソフトウェアとなります。 </li></ol> 2.ソフトウェアのセットアップ<ol><li>プログラムは、（ 図1A）が開放されると、パラメータを変更します所望の値に設定メニューの下のインスタントスティミュラスのための。 注：このプロトコルでは、すべてのパラメータが180秒（ 図1B）に変更され、「ファイル名を指定して実行時間（s）」は例外で、予め設定された水準にとどまります。 </li><li>セットアップメニューの下の自動保存フォルダを作成します。 </li><li> 「自動保存ベース」と表示された型可能なウィンドウの位置を確認します。入力サンプルの名前、例えば「RAT1-日付時点」。直接「自動保存ベース」型可能なウィンドウの左側に、するボックスをクリックし、「自動保存を有効にします。」 </li><li>コントロール画面の上部には、「シーケンサ」を選択します。新しいウィンドウが開きます。新しいウィンドウの下部に、「オープンシーケンス」を選択します。新しいウィンドウが開きます。既成のシーケンスを選択し、[OK]をクリックします。シーケンスエディタ（ 図1C）：周波数、刺激の持続時間、および残り時間を含むシーケンスパラメータとプロトコルのリストは、名前付きウィンドウに開発します。 「ロード・シーケンス」をクリックしてください - &gt;＆＃34;ウィンドウを閉じます」。 </li><li>リアルタイム電流と刺激を表示するには、「ファイル」を選択 - &gt;「ライブデータモニタ」。新しいウィンドウが開きます。 </li><li>新しいライブデータウィンドウ、オートスケール機能を使用して、テスト用のフォーマット画面、または手動で画面に表示される最大値と最小y値を入力します。 </li></ol> 3.動物セットアップ注：すべての力の測定値は、11週齢のルイスラットのものです。筋肉量と（ニュートン）の力の生産との間に線形相関があります。したがって、ラットの増加の時代のように、脚部によって生成される力の値も同様に増加するはずです。 <ol><li>動物が麻酔室から取り出す前に、麻酔の適切な平面内にあることを確認してください。完全に電気バリカンを用いた実験脚の足首と骨盤の間に横側の全ての毛を削除します。 注：麻酔の適切な面が達成されたときに、動物の私つま先のピンチに応答しませんよ。各機関の動物実験委員会によって出すガイドラインに従うことが必要です。 </li><li>それは麻酔の十分な深さのままので、動物の鼻は確実に麻酔ノーズコーン内で確保し、仰臥位で動物を置きます。 </li><li>三つの独立のノブ（ 図2）により、ペダル装置の位置を調節します。ノブ（A及びB）を使用して、フットペダルを調整し、それぞれ、その左端と最も低い位置にペダル装置を配置します。後で操作のための余地を残しながら、これは、動物の足の正確な位置決めを可能にします。この位置では、動物の足がまっすぐ平面上に位置するように向かって、またはさらに離れ実験者からのいずれかの装置を移動させるためにトラックの左側のノブを使用しています。 </li><li>ヨウ素とアルコールの3変化で脚をきれいにしてください。ヨウ素は、30秒間の足に残っている必要があります。 </li><li>動物またはプラットフォームを調整します（ 図2A、D）、拡張足は足の裏とフットペダル間の完全な接触を確保するようにします。 </li><li>医療用テープを使用して、フットプレート（ 図2D）に対する動物の足を確保します。かかとがペダルの下部にぴったりで、足全体が平坦であり、テスト中にプレートから外れるないことが重要です。 </li><li>足を安定させるためのクランプ機構の位置を確認します。六角レンチを回して、脚の動きを減少させ、所定の位置にロックする十分で安定化ピンを押してください。 </li><li>この位置では、向かってまたは離れ実験者からの直線（ 図2C）で足首、脛骨、大腿骨の嘘ように、いずれかの装置を移動させるために、ノブCを使用します。足がフットペダルと平行であることを確認してください。足と脛骨が90°の位置にあるので、ゆっくりと足首を移動するには、もちろん、装置の背面に記載されてい微ノブに調整してください。 </li><li> Continuそのように、大腿骨および脛骨の足を移動する電子は、90度の垂直角度（ 図2B）です。この時点で、動物は、電極の準備ができています。 </li></ol>電極の4配置<ol><li> 「インスタントスティミュラス」と表示されたオレンジ色のボタンをクリックして、「インスタントスティミュラス」を有効にします。 </li><li>前脛骨の近位端に表面的に両電極を配置し、スパイクは、ライブモニターに見られるまで、周りの電極チップを移動します。理想的には、スパイクは約0.4 N.すべきです 注：電極が順番に、膝と脛骨に対して垂直から横方向に実行されます腓骨神経の面に隣接して直交配置する必要があります。 </li><li>ピアス真皮に十分、とかろうじて筋層に一方の針を挿入します。スパイクは0.6 N.挿入針の周りのライブモニターに見られるまで、周りの他の電極を移動し、趣味のクランプや医療用テープを使用して所定の位置にそれらをクランプ。 </li><li> A最大の力出力を見つけるためdjust粗微調整。 </li><li>ハイパワーバイフェーズ刺激では、中心部の2つのノブがあります。一つは「RANGE」と表示されたもう一方は「ADJUST」されています。所望の最大アンペア数に「RANGE」ノブを回します。 注：ピークが徐々に大きさが大きくなり、最大アンペア数は、3つの連続した刺激が同一の収縮応答を生じるするレベルとして決定されます。必要以上に高いアンペア数を回すレジスト。最大アンペア数は、契約に全体の筋肉を刺激しますが、任意のより高い電流は、同様に筋肉や潜在的アンタゴニスト隣接の募集になります。 </li><li>筋肉を刺激するために使用される「RANGE」の割合を設定するには、「ADJUST」ノブを回します。この時点で、力は約1.0 Nでお読みくださいこれは、電流の増加または減少を必要とするかもしれません。 </li><li>彼らが安全であることを確認するために、電極を再確認してください。やめるインスタントスティミュラス。 </li><li> 「ライブデータ」ウィンドウで、「シーケンスを開始します。」をクリックします</li><li>バックコントロール画面に行くと、オレンジ色の「インスタントスティミュラス」ボタンの上に位置する「分析」ボタンをクリックすることで、曲線を監視し続けます。強縮曲線は、60 Hzの刺激の周りに形を取り始めるべきです。 </li></ol> 5.刺激とクリーンアップを仕上げ<ol><li>シーケンスが完了した後、電極を除去し、70％アルコールで拭いてください。カバーに電極を配置します。 </li><li>膝のクランプを外すと、麻酔をオフにします。麻酔ガスから動物を削除し、加熱パッド上まだ、腹臥位で動物を配置します。イソフルランガスが酸素ラットを保つためにオフにされた後、数分間100％O 2にラットを維持します。動物は、最初に移動することができるが、動物が意識を取り戻すまで戻ってケージに動物を返しません。筋肉痛が注目されている場合あなたの動物管理委員会によって指定されるように、回復時に、NSAIDの用量が与えられるべきです。 </li><li>ステップ1.2に記載されているすべての機器の電源をオフにし、ソフトウェアを終了し、データ分析に進みます。 </li><li>プラットフォームとフットペダルを拭いてください。 </li></ol> 6.データ解析注：データ分析は、このラボによって設計され、ラボのプロトコルに従ってシーケンスに合わせて行われます。分析値、重要度のデータ点、および手順の他の態様は、ユーザの意図に応じて変化します。 <ol><li>データ解析ソフトウェアを開きます。 </li><li>一度に複数のデータファイル（サンプル）の分析を可能にするために高スループットのメニューをクリックします。 「強制頻度」の分析を選択します。 </li><li> 「ファイルを選択してください」ボタンをクリックし、必要な数保存したデータファイルを開きます。 </li><li>カーソル配置手法ボックスで「手動」を選択します。 注：これにより、ユーザは、DATの全てを分析することを可能にします自動的にプログラムとは対照的に、所望のタイムスタンプ、内の分析位置を選択します。 </li><li> 2.に終了カーソルタイムスタンプ値を変更し、「分析」ボタン（ 図1D）をクリックします。 </li><li>テーブルを保存し、スプレッドシートを使用してデータを分析し、ボタンをACSIIする「テーブルの保存をクリックする。これにより、ファイルが保存されます、それは後でスプレッドシートで開くことができます。 </li><li>スプレッドシートで保存されたデータファイルを開きます。 </li><li> 「絶対最大」と表示された追加の列を作成し、ベースラインと、各サンプルの最大値の差を決定します。これは、各周波数で生成合計最大の力を提供します。 </li><li>トルクを決定するために、レバーアームの長さによって、各力の値を掛けます。 注：この場合には、動物の足の長さで表されることになります。このプロトコルは、30ミリメートルの平均実験的に決定された値を使用しています。ユーザーは今ミリアンペアの値を決定しました各周波数で生成ximumトルク。 </li><li>トルク周波数曲線、または、すべての刺激周波数を横切る動物によって産生さ最大トルクとして、これらの値をグラフ化。 注：これは、サンプル間の比較の一点として特定し、使用することができます。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、ラット後肢の前方下腿コンパートメントに生体内筋機能テストで実行するための比較的簡単な方法を示しています。 ex vivoで およびin situプロトコルを含めて筋機能検査の他の形態は、また、筋生理学に関する重要な情報を提供することができます。しかし、 インビボ機能試験の重要性は、非侵襲的な性質にあり、それは最も正確筋刺激の内因性のメカニズムを再現するという事実。両方のex vivo およびin situテストでは、腱および/または筋肉が露出しているため、湿った保たまたは41,42を沈めなければならない。 生体内試験が必要な外科的手技によって引き起こされる可能性外傷や炎症の交絡変数を削除します以下のためのその場筋機能検査で 、実験の目的は、炎症性および細胞プロセスを研究する場合、これは特に重要です<s&gt; 43アップ。また、in vivo試験 筋肉がその周囲から分離されないと筋肉/腱の滑りを低減するために、正確なノットを必要としないように少し外科的スキルを必要とする41（の場合のように、その場またはex vivo試験で ）。また、十分な練習で、正しい電極配置とすぐに筋肉の最大の力の生産を達成するための調整を行う能力の速度は、そのプロトコルの完了が迅速であることを確認し、動物内および同じ装置39の異なるユーザ間の両方reproducible- 。 TA筋のより直接的な調査を前にアクセスしにくい相乗筋肉（EDLとHL）の切除に、示されているように全体を前方下腿コンポーネントの評価を開始することは有益です。このアプローチを使用して、一方がかなり速く技術の習得を達成することができます。本明細書に記載された手順を示し、力frの有用性を強調しながら、破傷風を誘導し、筋肉によって生成される最大の力を決定するためにequencyプロトコル、ユーザーは、最高の自分の具体的な実験（複数可）と研究目標を知らせることになる機能テストのタイプ（複数可）を決定する必要があります。 注意深く刺激パラメータの様々な最適かつ再現可能な実験結果、すなわち、筋肉によって一貫した最大の力の生産を確保するために実行されるべきいくつかの重要なステップがあります。主要な機能のいくつかは、図2に概説されている。しかし、刺激電極の適切な配置と安定性は、腓骨神経の再現可能な最大刺激のための絶対必要条件です。この点において、電極は、表面的に配置する必要があります。電極配置が深すぎる場合には、一つは、このように前方下腿コンパートメントの観察された収縮反応の大きさを減少させる、拮抗筋の直接電気刺激をリスクです。また、2つの電極は、周囲の皮膚および結合組織の電気抵抗を低減することが可能として互いにように近接して配置されるべきです。一般に、直接それは腓腹筋を満たしている場所に前脛骨筋のエッジをトレース脚に膝に近く、内側電極の位置は、多くの場合、十分な力の生産をもたらします。これはまた、電極が順番に、脛骨に対して垂直および横方向に膝から脚の下に実行されます腓骨神経の面に隣接し、直交に配置されることが保証されます。しかし、動物間の解剖学における自然変動は、電極配置は、ケースバイケースで最適化されていることを確認するために、一定の警戒が必要です。このように、かなりのユーザの経験によって減少する電極配置に関連した試行錯誤の特定のレベルがあります。私を減少させる電極は皮膚が腫れや炎症を軽減するために最小化されるべきである貫く回数、asured力発生。これは、針が最初に置かれている場所に依存しているが、特に膝蓋骨の周囲の領域に針を2回以下に移動することをお勧めします。電極は、動物の脚部に配置されたら最後に、微調整は脚部の位置決め及び電極を介して供給される電流にすることができます。同時に、単一の単収縮から生じる力を監視しながら、これは行われるべきです。電極配置に加えて、調整は、電極を横切って供給される電圧にすることができます。しかし、ここで説明するセットアップでは、力出力を増加させる方法として、電圧を増加させたときに、増加電圧は、その神経支配拮抗薬筋肉の神経を刺激するので、注意して使用することが重要です。 電極配置が最適なままであることを保証するために監視されなければならない3つの重要な技術的な問題があります。まず、麻酔動物の足が確実にある必要があります筋力の製造（ 図2）を測定するフットペダル装置に固定。足をしっかりと固定されていない場合は、筋肉によって生成される真の力は、不完全に力変換器に変換することができます。不安定な足の固定はまた、（ すなわち足が離れて踏み板から移動する）、その表面的な位置から電極の変位を引き起こしたり、それらを完全に取り除くことができ、通常の筋収縮を超えた運動として、電極の最適な配置を失うリスクを紹介します。どちらのシナリオは、測定された力が減少します。第二に、動物の体は完全に仰臥位とストレート面（ 図2）に整列する必要があります。動物の体の正確な位置決めは、呼吸による脚のわずかな動きを防止し、また、より良い配置と刺激電極の連続的な接触を可能にする、脚や骨盤のねじれを最小限に抑えることができます。膝の第三に、正確な位置決めと固定がcritiです脚部が安定のままであり、従って、腓骨神経の一貫性の活性化を可能にするために、刺激電極の最適な配置を安定化に役立つことを保証するために校正。 強調されるべきであるいくつかの追加のポイントがあります。まず、商業筋レバーシステムは、左脚のテストを実行するように設計されているが設定も右脚のテストを実行するように変更することができます。ユーザが使用するプラットフォームが選択した動物モデルによって生成される力を測定し、支持するのに十分であることを保証するべきであるので、第二、筋肉レバーシステムは、動物の大きさに基づいて選択することができます。機器プラットフォームのテスト可能な筋肉が足の足底の延長や背屈を誘発するものに限定されています。第三に、再び電極配置は挑戦することと忍耐を必要とし、技術を習得するために練習できることを強調すべきです。電極はまた、定期的に使用してすぐに鈍くなるので、いくつかの予備のを持っていると便利ですそれは表面的に肌を刺すすることが困難になるとのためにETS。第三に、このレポートに記載されているプロトコルは、特定の刺激系列とデータ分析手順を利用しています。筋肉レバーシステム制御ソフトウェアおよびデータ解析ソフトウェアとそれが提供するデータは、他の多くの実験的な質問に答えることができ、したがって、その有用性は、本明細書に概説されているものを越えて延びています。このように、ユーザーは、本論文でソフトウェアプロトコル（複数可）の限界を超えて探求することをお勧めします。それは低侵襲性であり、同じ動物で、延長時間枠にわたって、複数回行うことができますので、これらのマイナーな制限があるにもかかわらず、in vivoでの筋機能のテストは、骨格筋の健康と収縮能力を決定するための強力なアプローチです。要するに、修理可能ユーティリティのこのタイプは、ラット後肢骨格筋の損傷または疾患のための新規治療法の効果を試験でシステムが特に得意となります。

骨格筋は、損傷または疾患1,2に応じて、修理のための驚くべき本質的な能力を有しています。実験的には、この再生応答の頑健性がよく、たとえば、研究することによって、動物モデルにおいて報告されている、myotoxins（ 例えば 、心臓毒）3-7を適用した後の骨格筋損傷、修復および再生の時間経過。具体的には、大規模な心臓毒誘発性筋損傷（筋線維8の38から67までパーセント）以下、再生は、衛星細胞、最終的に機能的な筋線維4,9-13になるために成熟し、常駐幹細胞によって媒介されます。最終結果は、健康な、力生成筋肉組織14〜16の後損傷機能再生を増加させます。詳細はよく、この報告書の範囲を超えていますが、筋肉再生のための基本メカニズムはcanoniを利用し、複数の系統からの多数の細胞型の慎重画策イベントを反映していますCAL組織の発達と形態形成5,17-21の両方に重要なシグナル伝達経路を。重要なことは、myotoxin誘発性の再生は、細胞外マトリックス、神経細胞の神経支配および血管灌流は、心臓毒誘発性筋損傷3,8,22次構造的に無傷のままであるという事実で有効になっています。全く対照的に、これらの重要な組織構造および構成要素は、VML損傷の文脈において、定義により、まったく存在しません。ここで、さまざまな原因に起因する組織の率直な損失は、恒久的な機能および美容赤字23-25になります。 かかわらずmyotoxin誘発性筋損傷と比較してVMLの損傷後の筋肉の修復および再生に関連した追加の課題、骨格筋再生および修復のための基本メカニズムの理解向上の、様々な状況では、十分に生物学を利用して配信されることになり縦Aとの組み合わせで、関連する動物モデル該当する機能措置のssessments。本明細書中で議論されるように、ラットの後肢の研究は、この目的のために優れたモデル系を提供します。具体的には、足の背屈を担当している前方下腿コンパートメントの筋肉（前脛骨筋、長指伸筋（EDL）とhallicusの長い（HL））は、容易に識別され、操作されます。さらに、それらは、脚26-28の長さを実行している主要な血管（腸骨動脈との分岐）によってサービス提供されており、（腓骨を含む坐骨や枝、）神経によって神経支配されています。このように、一つは直接in vivoでの骨格筋機能/病理を評価するために、ラットの後肢モデルを使用することができ、または骨格筋機能に対応する上で、血管や神経における病理学関連の変化のより間接的な影響を評価します。いずれのシナリオでは、疾患の重症度、並びに治療の有効性は、筋力の生産（トルク）と対応する足mの関数として決定することができます29-34 ovement。 理想的には、力の測定は、組織学的研究を伴って、遺伝子発現は、より厳密に骨格筋の構造及び分子の状態を評価するために分析されます。基本的な組織学および免疫組織化学は、例えば、筋肉の大きさ、筋肉の繊維配列、細胞外マトリックス組成物、核の位置、細胞数、およびタンパク質の局在化についての質問にお答えすることができます。遺伝子発現解析は、順番に、/影響を及ぼす筋線維、疾患状態、および代謝活性の成熟を調節することができる分子機構を同定するために必要です。これらの方法は重要な情報を提供するが、それらは一般的に、端末エンドポイントを表し、そして最も重要なのは、それらが直接骨格筋の機能的能力に対処するために失敗し、したがって、むしろ原因よりも相関しています。しかし、組織学的研究および遺伝子発現分析は、機能measurに関連して評価されたときESは、次に、力の生産と機能的再生のメカニズムが最も正確に同定することができます。 この点で、筋肉の能力を生産力はその場で 、 またはインビボ 、 インビトロで測定することができます。すべての3つのアプローチは、利点と限界の両方を持っています。 in vitroの実験では、例えば、筋肉は完全に分離し、動物の身体から除去されます。筋肉を供給する血管及び神経の影響を除去することにより、組織の収縮能力が厳密に制御外部環境35で決定することができる。 その場での筋肉テストでは、しかしながら、 インビトロの製剤と同様に、筋肉を単離することができ、神経支配と血液供給はそのまま残ります。 その場での実験モデルの利点は、それが神経支配と血液供給が最小限36を摂動されている間、個々の筋肉が研究することを可能にすることです。両者にインビトロおよびインサイチュ実験において 、薬理学的治療は、任意の周囲の組織または測定収縮応答37の循環系への影響の影響を考慮することなく、より直接的に適用することができます。しかし、 インビボ機能試験において 、本明細書に記載のように、その天然の環境38において筋機能を評価するための最小侵襲性技術である（ すなわち 、長手方向）経時的に繰り返し行うことができます。このように、以下の議論の焦点です。 この点に関して、関心の筋肉、またはそれを提供してい運動神経の近くに挿入された経皮電極は、筋肉に電気信号を提供します。トランスデューサは、所定の、カスタマイズされたソフトウェアプロトコルによって指示されたように活性化した筋肉で得られた長さや力の変化を測定します。これらのデータから、筋肉の物理的特性を決定することができます。これらには、が挙げられますCE-周波数、最大破傷風、力 - 速度、剛性、長さの緊張、疲労。等尺性または等張筋肉が収縮するように、筋肉の長さや力も一定に保つことができます。重要なことは、これらの実験プロトコルを迅速に行うことができ、簡単に繰り返し、customized-すべての動物が麻酔されている間、数時間から数日の回復期間を持ちます。 1匹の動物は、このように疾患モデルまたは治療プラットフォーム/技術の評価の縦断的研究を可能にする、複数回のテストインビボ力で受けることができます。 本明細書に記載されるように、高出力と併せて商業筋レバーシステムは、バイフェーズ刺激は、刺激を介して足の背屈に対するラット後肢の前脛骨筋の寄与を評価するためにインビボで筋機能テストで実行するために使用され腓骨神経。我々は、具体的には、再生医療/ TIを評価するために設計されているプロトコルを開発しましたラットTA筋の外傷性VMLの損傷後の筋肉修復のための工学技術をssue。なお。 EDLとHLは、具体的には（彼らは腓骨神経刺激（コロナ以下の測定された全前脛骨トルクの15〜20％を占めるTA筋を評価するために、前方下腿コンパートメントから解剖する必要がら 、2013） ）。このアプローチは、筋生理学/機能の総合的な長手方向の分析を提供するので、それは、他の多くの生理学的な調査の種類だけでなく、疾患の様々なまたは治療領域39に重要なメカニズムの洞察を当てることができます。例えば、in vivoでの筋機能検査は、運動生理学、虚血/再灌流研究、ミオパシー、神経損傷/神経障害および血管障害の研究、サルコペニア、および筋ジストロフィー40にも適用可能です。

<table><tbody><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>05260-04-04</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill</td><td>Vet Equip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Inlet Adaptor for Vaporizer</td><td>Vet Equip</td><td>911124</td><td></td></tr><tr><td>Outlet Adaptor for Vaporizer</td><td>Vet Equip</td><td>911125</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Anaesthesia Machine</td><td>Vet Equip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>Compressed oxygen gas</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VaporGuard Activated Charcoal Filter</td><td>Vet Equip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Professional water heater</td><td>Stryker</td><td>N/A</td><td>set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature</td></tr><tr><td>Transpore Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1527S-1</td><td>rip in half to make thinner strips</td></tr><tr><td>A5 Golden animal clippers</td><td>Oster</td><td>078005-050-002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Solution</td><td>Aplicare</td><td>82-227K</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Swabs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol</td><td>Decon labs</td><td></td><td>diluted to 70% with deionized water</td></tr><tr><td>cotton tipped applicators</td><td>Puritan</td><td>836-WC</td><td></td></tr><tr><td>Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>111-725-24TP</td><td></td></tr><tr><td>servomotor</td><td>Cambridge Technology</td><td>Model 6650LR</td><td></td></tr><tr><td>Dual Mode Lever System</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 305C-LR-FP</td><td>contact manufacturer to order</td></tr><tr><td>Signal Interface</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 604A</td><td></td></tr><tr><td>High-Power, Bi-Phase Stimulator</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 701C</td><td></td></tr><tr><td>Data analysis software</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>DMAv5.110 software</td><td></td></tr><tr><td>Muscle lever system control software</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>DMCv5.400 software</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair

外傷、疾患および様々な先天性、遺伝的および条件を取得から生じる骨格筋の再生能力にもかかわらず、恒久的な機能および/または化粧品の欠損（ 例えば 、体積筋肉損失（VML）組織工学と再生医療の技術は巨大な持っている非常に一般的です。電位が治療ソリューションを提供する。しかし、適切な機能性対策の長手方向の評価と組み合わせて、生物学的に関連した動物モデルの利用はVMLのような損傷の治療のための改善された再生治療法の開発に重要である。その点では、商業筋レバーシステム骨格筋の長さ、張力、力と速度パラメータを測定するために使用することができる。我々は、前方大腿区画の活性化に応答してインビボ力生産に測定するために、ハイパワー、バイフェーズ刺激に関連して、このシステムを使用しますラットの後肢。我々はpreviを持っていますously前脛骨筋（TA）筋肉だけでなく、私たちの組織工学筋肉修復（TEMR）技術で負傷したTA筋の治療後の機能回復の程度にVML損傷の機能的影響を評価するために、この機器を使用します。このような研究のために、麻酔ラットの左足はしっかりとサーボモータに連結されたフットプレートに固定されており、総腓骨神経は筋肉の収縮と足の背屈を引き出すために、2つの経皮針電極によって刺激されます。腓骨神経刺激誘発性の筋収縮ピーク強縮力の正確な決意を可能にする力の生産の最終的な平坦域を確保するために、刺激周波数（1〜200ヘルツ）の範囲に渡って測定されます。 VML傷害の程度、ならびに治療後の機能回復の程度の評価に加えて、この方法は簡単に筋肉生理学及び病態生理学のさまざまな側面を研究するために適用することができます。このようなアプローチの笙筋肉の修復と再生のための改善された治療薬のより合理的な開発を支援ULD。

強縮曲線は次善の結果から最適な結果を区別するために使用することができます。この曲線は、通常、60ヘルツの周波数で形成するために開始されます。良い結果を得るための重要な要因は、その最大の力を発生し、破傷風中にその力を維持するように筋肉を刺激する能力です。理想的な曲線は、最小の振動とフラットプラトー相、および刺激の終了時中断のない、シャープな垂直下降期間（ 図4）に続いて、刺激の時点で中断のない、シャープ、垂直上昇を、持っている必要があります。理想曲線からの偏差は、筋肉を疲労さ指標（ 図5D）であるか、または筋肉が適切に最大の力を発生するように刺激されていないこと（ 図5B - C）。後者は、一般的にstimula中に筋線維の最大動員の故障につながる不正な電極配置から生じまする。非理想的な曲線は、誤った電極配置や筋肉への病理学的変化の結果である場合には、研究者が決定することを可能にする特徴は強直性の曲線が完全に（融合）または不完全（融合していない）であるか否かです。融合していない、不完全強縮曲線は最大収縮を経験していない筋肉で、その結果、電極が紛失していることを示しています。コントロール、またはより急速に疲労収縮反応と比較して最大収縮の減少として筋肉における病理学的変化の一例を観察することができます。 この手順の過程で得られたピークの3種類の異なる電極と脚の位置を示し、 図3に見ることができる。第一のピークは、0.4Nの周りにある、正しい電極配置は、皮膚上に表面的に判断された場合に発生する（ 図図3（a））。ピークの第2のセットは、時間を有しますigher振幅、通常約0.5-0.6N（ 図3B）と電極は真皮を貫通するときに発生します。これらが得られた後、脚と足が達成される力の生産を最大にするように調整される場合、約1N以上（ 図3C）のピーク振幅が増加します。この時点で、インスタントスティミュラスをオフにすることができ、シーケンスを開始することができます。これらのガイドラインは、正確で再現性のある結果を確保し、プロトコル全体でキーのチェックポイントです。 最終結果は、ユーザが力試験及び実験的設計から抽出された情報に応じて異なる方法で表現することができます。このプロトコルでは、最大の力は、刺激の周波数のすべてを横切って測定されるが、他のデータポイントは、特定の研究者またはアプリケーションのために重要であり得ます。一例としては、強直性曲線の形状を取ることを始める刺激の周波数です。 T彼のデータは、同じ動物で、または別の治療群間の比較のために、前または後の実験から得られた他の結果と比較することができます。力生産は等尺力を計算し、観察された最大収縮に対する年齢の影響をより公平な評価を提供するために、身体の質量正規化することができます。異なる体重と年齢の動物は様々な最大の力を生成しますが、強直性曲線の形状は、手順が正しく行われているすべてのグループ間で一貫している必要があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig1.jpg" /> 図1：レバーシステムの制御および分析のためのデータ解析ソフトウェアの概要制御ソフトの（A）の概要プログラムを開きます。 （B）は、のためのパラメータ「インスタントスティミュラス。」力-周波数刺激のための（C）の例のシーケンス。 （D </st栄&gt;）解析ソフトウェアで高スループット力周波数解析から代表的なデータ。例えばシーケンスデータ解析手順はこのプロトコルに特有のものであり、このソフトウェアによって提供された配列と出力の全範囲を表すものではないことに留意すべきである。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig2.jpg" /> 図2： 装置におけるラットのポジショニングと足の配置のための重要な側面 （A）ラットは、しっかりと踏み板に取り付けられた左足と仰臥位です。足、脚、太もも製の直角が丸で囲まれています。 （B）足首によって作成された直角が強調表示されます。 （C）脚べき<html>足から体にストレート面に整列すること。 （D）電極配置が平行と腓骨神経の平面に直交している。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig3.jpg" /> 図3： 最大フォース生産するために、正しい電極配置の重要性を実証する代表的ピーク （A）あまりにも表面的に配置された電極を用いて観察ベースラインピーク強縮の応答。正しい位置に挿入された電極を有する（B）より大きなピーク。脚と足の位置と最適なプレシーケンスのピーク振幅に対する正しい電極配置をシグナリングより大きなピークから（C）遷移が最適に調整されています。/ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig4.jpg" /> 図4：100 Hzで最適強直カーブこの曲線が上昇し、急激に低下し、平坦なプラトー相を有します。この例では、正しい電極配置と最大の力の刺激を示している。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig5.jpg" /> 図5：100 Hzで得られたサブ最適な強直性曲線 の代表例としては （A）の緩和に続いて、この曲線は、ベースラインを下回ります。これは、刺激の指標でありますアンタゴニストの。 （B - D）これらのグラフは、不適切な電極配置と筋線維の不等募集の結果です。プラトー相は上り坂（C）、または下り坂（D）、大きな振動（B）を示しています。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

13.8K ビュー.  University of Virginia. We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration. 

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An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and physical exam alone, however the clinical presentation can vary greatly depending on the extent of injury, the patient's pain tolerance, etc. In patients with muscle injury or muscle disease, assessment of muscle damage is typically limited to clinical signs, such as tenderness, strength, range of motion, and more recently, imaging studies. Biological markers, such as serum creatine kinase levels, are typically elevated with muscle injury, but their levels do not always correlate with the loss of force production. This is even true of histological findings from animals, which provide a "direct measure" of damage, but do not account for all the loss of function. Some have argued that the most comprehensive measure of the overall health of the muscle in contractile force. Because muscle injury is a random event that occurs under a variety of biomechanical conditions, it is difficult to study. Here, we describe an in vivo animal model to measure torque and to produce a reliable muscle injury. We also describe our model for measurement of force from an isolated muscle in situ. Furthermore, we describe our small animal MRI procedure.

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo animal model of injury is described. The method takes advantage of the subcutaneous position of the fibular nerve. Velocity, timing of muscle activation, and arc of motion are all pre-determined and synchronized using commercial software. Post injury changes are monitored in vivo using MR imaging/spectroscopy.

アン in vivoで</em収縮で誘起された損傷と回復の非侵襲的モニタリングの>齧歯類モデル

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

医学

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

生物工学

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across species, combined with the limited healing properties of this tissue, have prompted the search for cellular therapies and propelled the development of experimental models to study their efficacy. Umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells (UCM-MSC) are appealing candidates because they are abundant, easy to collect, circumvent the ethical concerns and risk of teratoma formation, yet resemble primitive embryonic stem cells more closely than adult tissue-derived MSCs. Significant interest has focused on chitosan as a strategy to enhance the properties of MSCs through spheroid formation. This paper details techniques to isolate UCM-MSCs, prepare spheroids on chitosan film, and analyze the effect of spheroid formation on surface marker expression. Consequently, creation of a bilateral patellar tendon injury model in rats is described for in vivo implantation of UCM-MSC spheroids formed on chitosan film. No complication was observed in the study with respect to morbidity, stress rising effects, or tissue infection. The total functional score of the operated rats at 7 days was lower than that of normal rats, but returned to normal within 28 days after surgery. Histological scores of tissue-healing confirmed the presence of a clot in treated defects evaluated at 7 days, absence of foreign body reaction, and progressing healing at 28 days. This bilateral patella tendon defect model controls inter-individual variation via creation of an internal control in each rat, was associated with acceptable morbidity, and allowed detection of differences between untreated tendons and treatments.

This paper describes the preparation and evaluation of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells spheroids with a bilateral patellar tendon defect model in a rat. This model was associated with an acceptable morbidity and was found to detect differences between untreated and treated tendons, and between the two treatments tested.

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

長指伸筋の筋機能の評価<em&gt;エクスビボ</em&gt;と前脛骨筋<em&gt;その場</em&gt;マウスの

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

生物学

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively affect skeletal muscle. This can result in a loss of muscle mass (atrophy) and/or loss of muscle quality (reduced force per unit of muscle mass), both of which are prevalent in chronic disease, muscle-specific disease, immobilization, and aging (sarcopenia). Skeletal muscle function in animals can be evaluated by a range of different tests. All tests have limitations related to the physiological testing environment, and the selection of a specific test often depends on the nature of the experiments. Here, we describe an in vivo, non-invasive technique involving a helpful and easy assessment of force frequency-curve (FFC) in mice that can be performed on the same animal over time. This permits monitoring of disease progression and/or efficacy&#160;of a potential therapeutic treatment.

Measurement of rodent skeletal muscle contractile function is a useful tool that can be used to track disease progression as well as efficacy of therapeutic intervention. We describe here the non-invasive, in vivo assessment of the dorsiflexor muscles that can be repeated over time in the same mouse.

マウスで内がえし筋機能の非侵襲的評価

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

ラットアキレス腱における腱鞘炎誘発のための周期的機械的負荷

A Passive Ankle Dorsiflexion Testing System for an In Vivo Model of Overuse-induced Tendinopathy

Tendinopathy is a chronic tendon condition that results in pain and loss of function and is caused by repeated overload of the tendon and limited recovery time. This protocol describes a testing system that cyclically applies mechanical loads via passive dorsiflexion to the rat Achilles tendon. The custom-written code consists of pre- and post-cyclic loading measurements to assess the effects of the loading protocol along with the feedback control-based cyclic fatigue loading regimen. 
We used 25 Sprague-Dawley rats for this study, with 5 rats per group receiving either 500, 1,000, 2,000, 3,600, or 7,200 cycles of fatigue loads. The percentage differences between the pre- and post-cyclic loading measurements of the hysteresis, peak stress, and loading and unloading moduli were calculated. The results demonstrate that the system can induce varying degrees of damage to the Achilles tendon based on the number of loads applied. This system offers an innovative approach to apply quantified and physiological varying degrees of cyclic loads to the Achilles tendon for an in vivo model of fatigue-induced overuse tendon injury.

著者スポットライト:腱鞘炎研究における機械的分析と生物学的分析の統合 

This protocol presents a testing system used to induce quantifiable and controlled fatigue injuries in a rat Achilles tendon for an in-vivo model of overuse-induced tendinopathy. The procedure consists of securing the rat's ankle to a joint actuator that performs passive ankle dorsiflexion with a custom-written MATLAB script.

使いすぎ誘発性腱鞘炎の in vivo モデルのための受動的足関節背屈試験システム

Tendinopathy is a chronic tendon condition that results in pain and loss of function and is caused by repeated overload of the tendon and limited recovery ...

疾患における細胞間相互作用を研究するためのマウス腱アッセンブロイドの作製

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell populations. This load-bearing core is encompassed, nourished, and repaired by a synovial-like tissue layer comprising the extrinsic tendon compartment. Despite this sophisticated design, tendon injuries are common, and clinical treatment still relies on physiotherapy and surgery. The limitations of available experimental model systems have slowed the development of novel disease-modifying treatments and relapse-preventing clinical regimes. 
In vivo human studies are limited to comparing healthy tendons to end-stage diseased or ruptured tissues sampled during repair surgery and do not allow the longitudinal study of the underlying tendon disease. In vivo animal models also present important limits regarding opaque physiological complexity, the ethical burden on the animals, and large economic costs associated with their use. Further, in vivo animal models are poorly suited to systematic probing of drugs and multicellular, multi-tissue interaction pathways. Simpler in vitro model systems have also fallen short. One major reason is a failure to adequately replicate the three-dimensional mechanical loading necessary to meaningfully study tendon cells and their function. 
The new 3D model system presented here alleviates some of these issues by exploiting murine tail tendon core explants. Importantly, these explants are easily accessible in large numbers from a single mouse, retain 3D in situ loading patterns at the cellular level, and feature an in vivo-like extracellular matrix. In this protocol, step-by-step instructions are given on how to augment tendon core explants with collagen hydrogels laden with muscle-derived endothelial cells, tendon-derived fibroblasts, and bone marrow-derived macrophages to substitute disease- and injury-activated cell populations within the extrinsic tendon compartment. It is demonstrated how the resulting tendon assembloids can be challenged mechanically or through defined microenvironmental stimuli to investigate emerging multicellular crosstalk during disease and injury.

著者スポットライト:細胞メカニズムを理解するためのマウスアッセンブロイドの開発による腱研究の進歩

Here, we present an assembloid model system to mimic tendon cellular crosstalk between the load-bearing tendon core tissue and an extrinsic compartment containing cell populations activated by disease and injury. As an important use case, we demonstrate how the system can be deployed to probe disease-relevant activation of extrinsic endothelial cells.

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アン in vivoで齧歯類モデル

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使いすぎ誘発性腱鞘炎の in vivo モデルのための受動的足関節背屈試験システム

使いすぎ誘発性腱鞘炎の in vivo モデルのための受動的足関節背屈試験システム

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腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

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