私たちは親切に優れた技術支援やサポートのためのザビーネReckingerに感謝します。

1.準備<ol><li> 試料捕集 注：磁気攪拌方法は、単一のまたはプールされた筋肉試料のために使用することができます。 <ol><li>適切な好みのサイトからサンプルを収集し、適切な量の9インチ国の要件やICT、OIEやISOの勧告を参照してください。 <ol><li>欧州連合（EU）のために、例えば、国内の豚の筋張った部分への移行でダイアフラム柱から1グラムのサンプルを取ります。すべての筋肉サンプルは、すべての脂肪と筋膜の自由であることを確認してください。 </li></ol></li><li>舌がテストされている場合は、試験前に表面層を除去します。 </li><li>サンプルが凍結している場合は注意してください、ほとんどの旋毛虫の幼虫として耐凍結されていないと死の後ほどく、消化に耐性が低いと減少し、アッセイ感度が得られ、容器の壁に固執する傾向があります。 注：凍結した場合は、lのサンプルサイズを倍増沈降時間を東と増加（下記参照）。 </li></ol></li><li> 消化液の調製 <ol><li> 3Lのガラスビーカーに48°C - 46で予熱水道水の2リットルに25％塩酸（16±0.5ミリリットル）を追加します。不完全消化の温度結果の低すぎます。温度が高すぎるペプシンの酵素特性を無効にします。 </li><li>ビーカーに攪拌棒を置き、予熱したプレート上のソリューション攪拌（46から48°C）を。 </li><li> （1：10,000 NF、1：12,500 BP、2000 FIP 1）酸性溶液にペプシンの10±0.2グラムを追加します。 注：ペプシンの品質が最も重要と酵素活性がプロデューサーによって認定されなければならないのです。実験室の安全上の理由及びペプシン活性を維持するために、消化液の成分を添加する順序は、に付着されなければなりません。 </li></ol></li><li> 筋肉試料調製 <ol><li>ブレンダーやグラインダーで筋肉サンプルの100グラムに切り刻みます。 BLENを容易にするために鼎は、サンプルに2 mLの水を予熱追加し、2のための最大速度でブレンド - 3秒。 </li><li>第二ブレンドする前に、ブレンダーを開き、下部にブレンドボウルエッジマージンの一番上にある任意の筋肉のサンプルを転送し、ブレンド繰り返します。肉の目に見える片がなくなるまで3秒 - 2のバーストとブレンド進みます。 注：あまりにも多くのブレンドは、サンプル6における旋毛虫の幼虫の存在を損傷することができますが少なすぎるとブレンドは、不完全な消化をもたらす可能性があります。 </li></ol></li></ol> 2.手順<ol><li> マッスルサンプル消化 <ol><li>シリンダ内に消化液の1 Lを転送します。ビーカーにひき肉を移し、スプーンやフォークでの消化液に広めます。徹底的に3Lのビーカーに予熱した消化液500mLでブレンダーの蓋、ブレードとブレンダーボウルをすすぎます。 注：不完全なすすぎは、SENSの損失につながることができますitivity。 </li><li>アルミホイルでビーカーを覆い、44の一定温度に保つ - 46°Cを、温度計を監視します。 </li><li>肉粒子が消えるまで飛散することなく、深い渦を作成するために、30分間の消化液を攪拌します。試験された肉の種類（野生動物の肉など ）に応じて、60分の最大まで消化時間を増加させます。 </li></ol></li><li> 濾過および消化液の沈降 <ol><li>未消化組織の量を決定するために、ゼロにスケールを調整し、使用前にふるいを計量し、その重量に注意してください。ふるいは、沈降漏斗に到達する旋毛虫の幼虫を妨げる可能性があり、清潔で、任意の組織粒子を欠いているでなければなりません。分離漏斗を垂直に平準化されていることを確認してください。 </li><li>消化後、慎重に分離ガラス漏斗に180μmの篩を通して消化液を注ぎます。分離ガラス漏斗の幅はbはしないでください良い幼虫の沈降を可能にする長さの55％よりも電子も大きいです。任意のオーバーフローを避けるように注意してください。 </li><li>感度の損失を回避するために、徹底的にスクイズ洗浄瓶から水道水の約200ミリリットルのガラスビーカーやふるいをすすぎ、沈降ガラス漏斗にすすぎ水を移します。慎重に3リットルのビーカーの縁を洗浄するために注意してください。ふるいを持ち上げて、徹底的にふるい下の面積をすすぎます。 </li></ol></li><li> 未消化組織量の決意 注：メソッドの実行中にエラーが原因で、筋肉組織が十分に筋膜と難消化性である結合組織として、篩上に残ることができます。未消化組織の量は、最初の10分間の沈降段階（2.5参照）の間に決定されます。残留水は、未消化の組織の決定された重量に影響を与えることができるので、これは、ふるいを乾燥させるために約30分を許可します。 <ol><li>規模で紙タオルを置き、undigesでふるいの重量を量りますテッド組織。 </li><li>未消化の組織とのふるい重量からろ過する前にふるいの重量を引きます。出発試料の重量の5％以下がふるい（ 即ち 、5 gで/ 100gで、出発物質）のままであれば、消化プロセスが十分考えられます。 </li><li>未消化組織の量が5％を超える場合は、新鮮な筋肉サンプルを使用してテストを繰り返して。残りの組織は、主に未消化の筋肉組織と新鮮なサンプルで構成されている場合は利用できません、再び未消化の遺骨を消化し、元のサンプルに加えて調べます。 </li></ol></li><li> 消化液の沈降 <ol><li> 30分間分液漏斗中で濾過消化液を保管してください。放置した場合、 旋毛虫の幼虫は、漏斗の底に沈降します。 </li><li>凍結したサンプルを使用する場合、60分の最大沈降時間を増加させます。 </li><li>沈降が完了したら、完全にストップコックを開き、（筋肉サンプルは、以前に凍結していた場合は80 mL）で消化液の少なくとも40 mLの迅速測定シリンダーにオフに実行させるための分液漏斗の。 </li><li>まず、シリンダ内に流体の半分をさせ、その後、完全に消化液10mLを通過できるように反対方向にコックを開きます。最後に、別の10 mLのための反対方向にコックを開きます。この手順は、 旋毛虫の幼虫は、活栓の中に閉じ込めていないことを保証します。 注：十分な速度、感度を低下させる、分液漏斗中に残っている幼虫を回避するために必要とされます。 </li></ol></li><li> シリンダ内の消化液の沈降 <ol><li>幼虫が沈降することを可能にするために10分間シリンダー内の堆積物を残します。 10 mLの堆積物を乱すことなくピペットで吸引することにより、30 mLの上清を取り除きます。 </li><li>試料中の組織の繊維の量を減少させるために、沈殿物を30mLの水道水を追加し、さらに10メートル残します液体が透明になるまでに。繰り返します。 </li><li>上清を除去し、10 mLのを転送するグリッドペトリ皿や幼虫計数盆地に堆積物を洗浄しました。 10mLの水道水でシリンダーを洗浄した後、サンプルに水を追加します。 注：サンプル中の破片の大量旋毛虫幼虫 （ 図1）の識別を防止することができるように必要であれば、さらなる洗浄工程が行われるべきです。 </li></ol></li><li> 顕微鏡検査 <ol><li>すぐに洗浄工程後の試料を検査するために15 20Xの倍率で調節可能な強度のサブステージ送信光源とtrichinoscopeまたはステレオ顕微鏡を使用してください。 </li><li>グリッドペトリ皿に試料を注いだ後、グリッドによって系統的グリッドディッシュ/盆地を調べます。何の容疑者構造が見つからない場合は、静かに任意の旋毛虫ラを可能にするために、循環方式でグリッド化ペトリ皿や幼虫計数流域内の流体を移動させます潜在的に見過ごされたrvaeは、ペトリ皿の中心に蓄積します。検査を繰り返します。 </li><li> 100X - 疑わしい構造が見つかった場合、40に倍率を上げます。ピペットでシャーレ/盆地から旋毛虫の幼虫を削除し、90％エタノールでチューブに集めます。 </li><li>完全な皿が検討された後、シャーレ/盆地の穏やかに振盪から出発し、手順を繰り返します。少なくとも3回、またはそれ以上の幼虫までの手順を繰り返します発見されました。 </li><li>幼虫の数をカウントします。筋組織の量に相関は、試験の結果、グラム（LPG）あたりの幼虫として存在します。 </li><li>あまりにも多くの幼虫が確実に幼虫の数を決定するために、消化液中に存在している場合は、メスシリンダーに幼虫を含む流体を返すスクイーズ洗浄瓶から水道水ですすぎ、そして底に沈殿する幼虫を残します。 </li><li> 10分間の沈降時間の後、所定容量の上清を低減する（ 例えば10mL）で。正確な量を決定するために、ピペットで新しいシリンダーに上清を移します。 </li><li>激しく振盪による流体に均一に幼虫を一時停止します。揺れ運動中に、ペトリ皿に20μLの幼虫の懸濁液の12滴を追加します。 </li><li>顕微鏡で各液滴を調べます。 240μL中の幼虫の数を決定し、最高と最低のカウントを削除します。上清の総容量（ 例えば 10ミリリットル）に幼虫の数を推定。 注：ステレオ顕微鏡の品質は、 旋毛虫幼虫の同定のために最も重要です。 </li><li>幼虫はピペットでチューブに回収された場合、幼虫はピペット壁に固執しませんでしたが、チューブに移していることを慎重に確認してください。 注：プールされたサンプルからの正旋毛虫の発見は、起源のカーカスに戻ってプールからトレースする必要があります。正の死体がアイデンなるまでここでは、プールのサイズを徐々に減少させるべきですtified。サンプルサイズはまた、感度を高めるために、このプロセスの間に増加することができます。集団サンプルの検査が陽性または不確実な結果を生成する場合には、さらに20グラムのサンプルは、各ブタから採取されます。 5匹のブタから​​20gのサンプルをプールし、記載された方法を用いて検査されます。このように5匹のブタの20グループからのサンプルを検討します。 旋毛虫は 5匹のブタからのプールされた試料中に検出されたときに、20gのサンプルは、グループ内の個々のブタから収集され、原点のプラスのカーカスが検出されるまで、それぞれを別々に検討します。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

磁気撹拌法を容易に行うことができますが、厳密に技術的な詳細に付着していないと、このように消費者の健康を危険にさらす、感度不足につながります。重要管理点は、上記のテキストで強調表示されています。また、適切な機器の使用は、テストの成功した結果のために重要です。すべての血管が表面に幼虫の付着を低減するために、シリコンでコーティングされたガラスピペットの先端で作られるべきです。 消化法の感度は、筋肉の幼虫密度とテストした筋肉試料の量に依存します。 3の幼虫密度について-筋肉組織の5 LPG、100％の感度が報告されたが、1 LPGの下の感度は40％13に低下しました。試験された宿主動物種に応じて、試験の感度は、使用されるサンプルの量を増加させることによって改善することができます。私野生生物におけるnfection負担は、したがって、より大きなサンプルサイズが14を使用している、通常低いです。好発部位はまた、宿主動物によって異なります。ここでは、そのような舌のようないくつかの筋肉組織の下部消化は、より大きなサンプルサイズ15をもたらすことができ、考慮される必要があります。 また、磁気撹拌法は、内部統制が含まれていないことを理解することが重要です。したがって、ドキュメントへのサンプリングから、品質保証管理が正確かつ正確な結果を得ることが不可欠です。筋肉試料中の旋毛虫の幼虫を検出するための実験室での性能の品質は、習熟度テストで各アナリストの定期的な参加によって監視されるべきです。 方法のさらなる制限は、顕微鏡による筋肉の幼虫の最終識別ステージは非常に主観的とょんであること、調べアナリストによる幼虫の形態の知識にvily依存。 この問題を回避するための興味深い代替法は、ラテックス凝集試験によって幼虫検出したフィルタの分離に磁気攪拌方法/です。しかし、EUの法律に従って、この方法は、そのようなイノシシ4として、国内の豚のではなく、感染のリスクが高い動物用食肉のテストのために同等とみなされています。モノクローナル抗体を用いた幼虫抗原の同定は、試験より客観的になりますが、研究室に肉16グラム当たり幼虫の数を決定する可能性を否定しています。 磁気攪拌方法のさらなるバリエーションは、機械的補助プールされた試料分解法/沈降技術、機械的補助プールしたサンプルの発掘を含みますフィルタ分離技術、および最大35グラムの技術のプールされたサンプルの自動消化法上のestion法/。これらの技術は、すべての肉や旋毛虫の幼虫の視覚化および計数の人工消化に基づいていますが、濾過および沈殿の工程に使用される装置が異なるされています。 孤立した幼虫は、さらに分子検査（ 例えば 、マルチプレックスPCR）17によって種レベルで同定することができます。 EU法によると、全ての陽性サンプルは、 旋毛虫種の決意のための国家リファレンス研究施設やEURLPに転送する必要があります。

属旋毛虫の線虫は、世界中の肉食動物と雑食哺乳類、鳥類、爬虫類の横紋筋で検出することができます。これらの人獣共通線虫は、豚、馬から人間の生または半生肉や肉派生した製品を達することができ、ゲームの動物が摂取されています。この人獣共通感染症は疾病の徴候や症状、 例えば下痢、発熱、眼窩周囲浮腫および筋肉痛や、心筋炎、血栓塞栓症や脳炎1できるだけ合併症によって特徴づけられる、ヒトに重篤な疾患であることができます。 旋毛虫は野生と家畜における旋毛虫感染の最も普及している病原体であると世界中のヒトへの感染の大部分の原因となります。ヨーロッパ、北と西アフリカ、西アジアでは、 旋毛虫britoviは、ヒトへの感染の別のソースです。また、10他の分類群は、あまり一般的原因として報告されています<html>およびヒト疾患の薬剤は、通常、野生動物2に、世界のさまざまな地域で発見されています。そのようなイノシシ、クマ、セイウチやアナグマなどの野生動物に加えて、豚肉は、世界中のヒトへの感染の最も重要なソースを表します。 旋毛虫症を防ぐための最善の方法は、のコアに茶色にピンクから肉の色を変更するには、すなわち 、1分間&gt; 65°C（安全な温度に生の肉製品を食べることを控えるようにし、任意の肉を調理するために、特にゲームの肉であります肉製品）3。欧州連合（EU）と米国農務省は肉4、5でのT. spiralisの幼虫を殺すために使用することができ豚肉製品の冷凍調理時間と温度を指定しました。また、肉と肉製品中の旋毛虫の不活性化のための提言は、旋毛虫症に関する国際委員会によって発行されました&quot;外部参照&quot;&gt; 6。ヨーロッパでは、 旋毛虫感染のリスクが無視できる商業豚の群れにおける制御住宅事情の導入に加えて、人間の旋毛虫症の予防は、感受性動物4から筋肉サンプルの臨床検査に基づいています。 食品の安全性のために、消化アッセイは肉3,7における旋毛虫幼虫の直接検出のための唯一の信頼性のある手順です。消化アッセイのいくつかのバリエーションがあっても、磁気攪拌方法は、国際的に認められた基準法3、4、7です。このアッセイは、横紋筋組織における旋毛虫の幼虫の検出に基づいています。筋肉サンプルとその後の濾過および沈殿段階の酵素消化した後、 トライchinella幼虫を顕微鏡で識別されます。貿易債務と国内法に応じて、磁気撹拌法の一般的なプロトコルの小さな変動が多数あります。ここでは、技術的な詳細は、EUの要件4、ISO仕様8、ICTガイドライン6、および寄生虫（EURLP）のための欧州連合（EU）のリファレンス研究所の経験や旋毛虫のためのドイツのリファレンスラボラトリーに基づいています。

<table><tbody><tr><td>Knife, Scissors, Tweezers</td><td></td><td></td><td>Cutting samples and removing non-digestible tissue</td></tr><tr><td>Blender&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>With a sharp chopping blade</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td></td><td></td><td>With thermostatically controlled heating plate</td></tr><tr><td>Stirring Rod</td><td></td><td></td><td>Teflon-coated, approximately 5 cm long</td></tr><tr><td>Conical glass separation funnel</td><td></td><td></td><td>Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation.</td></tr><tr><td>Stands, rings and clamps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieve</td><td></td><td></td><td>Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh</td></tr><tr><td>Funnel</td><td></td><td></td><td>Internal diameter not less than 12&amp;nbsp;cm, to support the sieves</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td></td><td></td><td>Capacity 3 L</td></tr><tr><td>Glass measuring cylinder</td><td></td><td></td><td>Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td></td><td></td><td>With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td></td><td></td><td>9 cm diameter, marked on their undersides into 10 &amp;times; 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope</td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td>Alternatively a lid to cover the beakers</td></tr><tr><td>25% hydrochloric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td></td><td></td><td>Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (F&amp;eacute;d&amp;eacute;ration internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>70-90% ethyl alcohol</td></tr><tr><td>Tap water</td><td></td><td></td><td>Heated to 46-48 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Balance</td><td></td><td></td><td>Accurate to at least 0.1 g</td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td>Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice</td></tr><tr><td>Pipettes and pipette holder</td><td></td><td></td><td>Different sizes (1, 10 and 25 mL)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Accurate to 0.5 &amp;deg;C, temperature range at least from 20 &amp;deg; C to 70&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Siphon</td><td></td><td></td><td>For tap water</td></tr></tbody></table>

magnetic stirrer method for the detection of trichinella larvae in muscle samples

旋毛虫症は、ヒトにおける衰弱性疾患であり、属旋毛虫の線虫の幼虫に感染した動物の生や加熱が不十分な肉の消費によって引き起こされます。ヒトへの感染の最も重要な情報源は、世界中のゲーム肉と豚肉や豚肉製品です。多くの国では、人間の旋毛虫症の予防は、感受性動物の死骸からの筋肉試料の人工的な消化によって、感染動物の識別に基づいています。 肉の消化が、磁気攪拌法がゴールドスタンダードと考えられているに基づいていくつかの方法があります。この方法は、筋肉のサンプルとその後の濾過および沈殿段階の酵素消化後の顕微鏡による旋毛虫の幼虫の検出を可能にします。この方法は、特殊で高価な装置を必要としないが、内部対照を使用することができません。そのため、厳しい品質管理がapplieする必要がありますテストを通して、D。本研究の目的は、寄生虫のための欧州連合（EU）のリファレンス研究所と旋毛虫のためのドイツの国立リファレンス研究所の経験に基づいて、アナリストに詳細な取扱説明書及び方法の重要管理点を提供することにあります。

<html>消化の後、感染性筋幼虫の形状は、識別をより困難に、変えることができます。典型的な形はしっかり巻か幼虫、軽くコイル状幼虫またはC字形または完全に解か幼虫（ - 2C図2B）が挙げられます。グラム当たり見つかった幼虫の数は大幅に変えることができ、1幼虫から数百幼虫の範囲とすることができます。 感染筋幼虫の形態は、 図2Aに示されています。 旋毛虫の幼虫長く、幅約0.3ミリメートル0.7〜1.5mmです。食道が狭く、わずかに丸みを帯びた端部を有します。キューティクルがスムーズです。体腔、stichosomeの前半では、構造は、45〜55大細胞（stichocytes）の列に囲ま細長い管から構成され、観察することができます。直腸は、任意の突起なしにも丸みを帯びているか、10、11の付属します。 トン&quot;&gt;その他の構成は、 旋毛虫の幼虫のほか、筋肉の消化後に見つけることができるいくつかの例は、 図3Aに示されている- 。。3F野生動物は、多くの場合、他の寄生虫に感染しているか、テストのために利用可能な筋肉サンプルは、アニメーションによって摘出プロセス中に汚染されていますまたは構造/生物無生物。幼虫の長さは、前部と後部の外観が終了し、stichosomeヘルプの発生が異なる線虫属12を区別します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> 図1：（A） が不足し、（B）、十分なすすぎ工程後旋毛虫幼虫の顕微鏡検査。スケールバーは100μmで示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">大きい方がまし表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のrsion。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> 図2： 感染性旋毛虫幼虫の形態は、幼虫（A）の直腸、Stichosomeと食道を表示しています。 （B）きつく巻かれ、軽く幼虫と（C）の移動コイル状を示す消化後の筋肉の幼虫の可能な形状は、幼虫を解か。スケールバーは100μmで示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> 図3： マグネティックスターラー法による筋サンプルの消化後の偶発病変の例。 （A）の毛のような毛イノシシで見つかったミミズ。 （B）イノシシからAlariaアラタ 。 （C）イノシシから筋線維。 （D） ブタ肺虫属のsp。イノシシから。イノシシ（F）に見られる（E）植物繊維： 回虫属 。イノシシから幼虫。スケールバーは100μmで示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

多くの国で人間の旋毛虫症の予防は、世界的な磁気攪拌法がゴールドスタンダードと考えられるの消化、の方法による感受性動物から筋肉サンプルの臨床検査に基づいています。

の検出のための磁気スターラー方法<em&gt;旋毛虫</em筋肉試料中&gt;幼虫

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

magnetic-stirrer-method-for-detection-trichinella-larvae-muscle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

28.6K ビュー.  Federal Institute for Risk Assessment. 多くの国で人間の旋毛虫症の予防は、世界的な磁気攪拌法がゴールドスタンダードと考えられるの消化、の方法による感受性動物から筋肉サンプルの臨床検査に基づいています。 

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Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

ネズミ鞭虫感染症：腸内のタイプ2免疫と炎症のモデル

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

免疫・感染学

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

生物学

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

発生生物学

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

神経科学

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

の除去<em&gt;ショウジョウバエ</em感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫の切り身から&gt;筋肉組織

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

医学

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

ショウジョウバエの神経筋接合部および筋細胞における微小管ネットワークの表示

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

著者スポットライト:ショウジョウバエの神経筋接合部における微小管ネットワークの理解 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

の検出のための磁気スターラー方法

要約

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