אנו מבקשים להודות סבין Reckinger לקבלת סיוע טכני מעולה ותמיכה.

1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף דוגמאות הערה: השיטה הבוחשת המגנטית יכולה לשמש דגימות שריר בודדות או תקווינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות מאתרי הנטייה המתאימים בסכום מתאים 9. עיין בדרישות המדינה או להמלצות של ICT, OIE או ISO. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור האיחוד האירופי, למשל, לקחת דגימת 1 גרם מתוך עמוד סרעפת על מעבר החלק השרירי של חזירים מקומיים. ודא שכל דגימות שריר הן ללא כל שומן fascia. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הלשון נבחנת, להסיר את שכבת פני השטח לפני הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשמור על עצמך אם דגימות קפואות, כמו רוב זחלי Trichinella אינם להקפיא עמידים uncoil לאחר מותו, הם עמידים פחות עיכול נוטים להיצמד קירות מכל, וכתוצאה מכך רגיש assay ירד. הערה: אם קפוא, להכפיל את גודל המדגם ב lמהמזרח ולהגדיל את זמן השקיעה (ראה להלן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת נוזל עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25% HCl (16 ± 0.5 מ&quot;ל) ל -2 ליטר של מי ברז שחומם מראש ב 46 - 48 ° C לתוך כוס זכוכית 3 L. נמוך מדי של תוצאות טמפרטורה לעיכול שלם; גבוה מדי של טמפרטורה מנטרל את המאפיינים האנזימטית של פפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מוט בחישה בכוס, ומערבבים הפתרון על צלחת שחומם מראש (46 - 48 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 ± 0.2 גרם של פפסין (1: 10,000 NF, 1: 12,500 BP, 2,000 FIP) לפתרון חומצי. הערה: איכות פפסין היא פעילות חשיבות ואנזים עליונות חייבות להיות מאושר על ידי היצרן. מטעמי בטיחות במעבדה ועל מנת לשמור על פעילות פפסין, הרצף של הוספת רכיבים נוזלים עיכול חייב להיות דבק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שריר מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצץ עד 100 גרם של דגימות שריר בבלנדר או במטחנה. כדי להקל blenדינג, להוסיף 2 מ&quot;ל שחומם מראש מים על דגימות ומערבלים במהירות מקסימלית עבור 2 - 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המיזוג השני, פתח את הבלנדר ולהעביר כל מדגם שרירים בחלק העליון של מרווח קצה מיזוג קערה על המיזוג התחתון וחזור. המשך מיזוג עם התפרצויות של 2 - 3 שניות עד אין חתיכות גלויות של בשר להישאר. הערה: ערבוב מעט מדי עלול לגרום עיכול לא שלם, תוך ערבוב מדי יכול לפגוע בהווה הזחלים Trichinella בדגימות 6. </li></ol></li></ol> נוהל 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול שרירי מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1 ליטר של נוזל העיכול לגליל. מעבירים את הבשר הטחון לתוך כוס ולהפיץ בנוזל העיכול בעזרת כף או מזלג. לשטוף ביסודיות את המכסה בבלנדר, להב בבלנדר קערה עם 500 מ&quot;ל של נוזל עיכול שחומם מראש לתוך כוס 3 L. הערה: שטיפת Incomplete יכולה לגרום לאובדן של sensitivity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הכוס עם רדיד אלומיניום ולשמור על טמפרטורה קבועה של 44 - C ° 46 ולפקח עם מדחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את נוזלי העיכול למשך 30 דקות כדי ליצור מערבולת עמוקה בלי מתיז עד חלקיקי הבשר להיעלם. בהתאם לסוג של בשר הנבדק (בשר למשל של חיות ברות), להאריך את משך זמן העיכול עד למקסימום של 60 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון ושיקוע של נוזל העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את כמות הרקמה מעוכלת, להתאים את קנה המידה לאפס, לשקול את המסננת לפני השימוש, ושימו לב משקליו. המסננת צריכה להיות נקיה ונטולה כל חלקיקי רקמות, אשר יכול לעכב את זחלי Trichinella לכת משפך השקיעה. בדוק כי משפך ההפרדה מפולס אנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול, בזהירות לשפוך את נוזל העיכול דרך מסנן 180 מיקרומטר לתוך משפך זכוכית הפרדה. רוחבו של משפך זכוכית הפרדה אסור bדואר גדול מ -55% מאורך לאפשר שקיעת זחל טובה. תשמור על עצמך כדי למנוע הצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע אובדן של רגישות, לשטוף ביסודיות את כוס זכוכית ואת המסננת עם כ 200 מיליליטר של מים ברז מבקבוק לשטוף לסחוט ולהעביר את מי שטיפה לתוך משפך זכוכית שקיעה. תשמור על עצמך כדי לשטוף את הקצוות בקפידה את כוס 3 L. הרם את המסננת ולשטוף את האזור תחת המסננת ביסודיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת כמות רקמה מעוכלת הערה: בשל טעויות בביצוע של השיטה, רקמת שריר יכולה להישאר על המסננת, כמו fascia גם ורקמות חיבור שהן בלתי ניתנות לעיכול. כמות הרקמה מעוכלת נקבעת במהלך שלב שקיעת 10 הדק &#39;הראשון (ראה 2.5). זה מאפשר כ -30 דקות עבור המסננת להתייבש, כמו מים שיורית יכולים להשפיע על המשקל הנחרץ של הרקמות המעוכלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מגבת נייר בסולם, ולשקול את המסננת עם undigesרקמות טד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת המשקל המסנן לפני הסינון מן המשקל המסנן עם רקמות מעוכלות. תהליך העיכול נחשב משביע רצון, אם לא יותר מ -5% ממשקל פתיחה לדוגמא נשארים על המסננת (כלומר 5 גר &#39;/ 100 גרמו חומר מוצא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כמות רקמה מעוכלת עולה על 5%, לחזור על הבדיקה באמצעות דגימות שריר טריות. אם הרקמה הנותרת מורכבת בעיקר של רקמות שריר מעוכלות דגימות טריות אינן זמינות, לעכל את השרידים המעוכלים שוב ולבחון בנוסף הדגימות המקוריות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקיעה של נוזל העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את נוזל העיכול המסונן במשפך separatory למשך 30 דקות. אם נותר ללא הפרעה, זחלי Trichinella יישבו בתחתית המשפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות קפוא משמשות, להאריך את משך זמן השקיעה עד למקסימום של 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקיעה תושלם, מלא לפתוח את השסתוםשל משפך separatory לתת לפחות 40 מיליליטר של נוזל עיכול במהירות לברוח לתוך גליל מדידה (80 מיליליטר אם דגימות שריר שהוקפאו בעבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, בואו וחצים של הנוזל לתוך הצילינדר ולאחר מכן מלא לפתוח את השסתום בכיוון ההפוך כדי לאפשר 10 מיליליטר של נוזל עיכול לעבור. לבסוף, פתח את השסתום בכיוון ההפוך עוד 10 מיליליטר. הליך זה מבטיח כי הזחלים Trichinella אינם לכודים ברזלים. הערה: מהירות מספקת נדרשת על מנת להימנע זחלים שנותרו משפך separatory, הפחתת רגישות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקיעה של נוזל עיכול בצילינדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המשקע בצילינדר במשך 10 דקות כדי לאפשר זחלים משקעים. הסר 30 supernatant מ&quot;ל ידי שאיבת עם טפטפת מבלי להפריע משקעים 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את כמות סיבי רקמות במדגם, להוסיף ברז מיליליטר 30 מים משקעים ולהשאיר למשך עוד 10 מ &#39;ב. חזור על פעולה עד שהנוזלים ברורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ולהעביר את 10 מ&quot;ל שטף משקעים לצלחת פטרי gridded או אגן ספירת הזחל. שוטף את הגליל עם 10 מ&quot;ל מים ברז ולאחר מכן להוסיף את המים המדגמים. הערה: כפי כמויות גדולות של פסולת במדגם יכולות למנוע זיהוי של זחלי Trichinella (איור 1), צעדי כביסה נוספים צריכים להתבצע, אם נדרשו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש trichinoscope או-מיקרוסקופ סטריאו עם מקור אור המועבר תת-שלב בעצמה מתכווננת בהגדלה 15 עד 20X לבחון דגימות מייד לאחר שלבי הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמזג מדגם לתוך צלחת פטרי gridded, לבחון את המנה / אגן הרשת באופן שיטתי על ידי הרשת. אם אין מבנים חשודים נמצאים, בעדינות להזיז את הנוזל בצלחת פטרי gridded או אגן ספירת זחל בצורה מעגלית כדי לאפשר לכל Trichinella larvae, שהיו מתעלמים באופן פוטנציאלי, לצבור במרכז צלחת פטרי. חזור על הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מבנה חשוד נמצא, להגדיל גדלה ל -40 - 100X. הסר הזחלים Trichinella מצלחת / אגן עם טפטפת ולאסוף בתוך שפופרת עם אתנול 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המנה המלאה נבדקת, לחזור על התהליך, החל הרעד העדין של המנה / אגן. חזור על התהליך לפחות שלוש פעמים או עד שלא זחלים יותר נמצאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת הזחלים. כדי לתאם את כמות רקמת שריר נבדק ובהווה כזחלים לגרם (גפ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יותר מדי זחלים נמצאים בנוזל העיכול כדי לקבוע את מספר הזחל באופן מהימן, להחזיר את הנוזל המכיל את הזחלים אל גליל המדידה, יש לשטוף במים ברז מבקבוק לשטוף לסחוט, ולהשאיר זחלים ליישב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן שקיעה 10 דקות, מנמיכים את supernatant לנפח מוגדר (למשל10 מ&quot;ל). כדי לקבוע את הנפח המדויק, להעביר את supernatant לגליל חדש עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות זחלי homogenously בנוזל על ידי טלטול נמרץ. במהלך התנועה הרועדת, להוסיף 12 טיפות של 20 μL השעית זחל לצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון כל טיפה ידי מיקרוסקופ. לקבוע את מספר זחלי 240 μL ולמחוק את הספירה העליונה לעשירונים תחתונה. לחיץ במספר הזחלים לסך נפח (למשל 10 מ&quot;ל) של supernatant. הערה: איכות מיקרוסקופ סטריאו היא בעלת חשיבות עליונה לזיהוי זחלי Trichinella. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הזחלים נאספים צינור ידי טפטפת, לבדוק היטב כי הזחלים לא מקל על הקיר פיפטה אך מועברים הצינור. הערה: ממצאי Trichinella החיובי ממדגמים ונקוו חייבים להיות נעוצים מהברכה אל הפגר מוצא. הנה, את גודל הברכה צריך להיות ירידה בהדרגה עד הפגר החיובי היא iDENtified. גודל המדגם יכול גם להיות מוגבר במהלך תהליך זה כדי להגביר את הרגישות. איפה בדיקת מדגם קולקטיבי מייצרת תוצאה חיובית או לא בטוחה, מדגם 20 גרם עוד לקוח מתוך כל חזיר. 20 הדגימות גרמו מחמישה חזירים הם אספו ובדקו באמצעות השיטה המתוארת. בדרך זו דגימות מ -20 קבוצות של חמישה חזירים תיבחנה. כאשר Trichinella מזוהה מדגם נקווה מחמישה חזירים, 20 דגימות גרמו נאספות החזירים הבודדים בקבוצה וכל אחד מהם נבחן בנפרד עד הפגר מהמוצא החיובי מזוהה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gottstein, B., Pozio, E., N&#246;ckler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+Diagnosis,+Treatment,+and+Control+of+Trichinellosis.">Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control of Trichinellosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 127-145 (2009).</li><li>Pozio, E., Murrell, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematics+and+epidemiology+of+Trichinella.">Systematics and epidemiology of Trichinella.</a> Adv. Parasitol. 63, 367-439 (2006).</li><li>9 CFR Part 318.10 - Prescribed treatment of pork and products containing pork to destroy trichinae. U.S. Government Publishing Office Available from: <a target="_blank" href="https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf">https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf</a> (2012)</li><li>Gamble, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Commission+on+Trichinellosis:+recommendations+on+methods+for+the+control+of+Trichinella+in+domestic+and+wild+animals+intended+for+human+consumption.">International Commission on Trichinellosis: recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption.</a> Vet. Parasitol. 93 (3-4), 393-408 (2000).</li><li>Gajadhar, A. A., Forbes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internationally+recognized+quality+assurance+system+for+diagnostic+parasitology+in+animal+health+and+food+safety,+with+example+data+on+trichinellosis.">An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis.</a> Vet. Parasitol. 103, 133-140 (2002).</li><li>N&#246;ckler, K., Kapel, C. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Detection+and+surveillance+for+Trichinella:+meat+inspection+and+hygiene,+and+legislation.">Chapter 3, Detection and surveillance for Trichinella: meat inspection and hygiene, and legislation.</a> FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis. , 69-98 (2007).</li><li>Boch, J., Schnieder, T., Supperer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Veterin&#228;rmedizinische Parasitologie. , (2006).</li><li>Despommier, D. D., M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stichosome+and+its+secretion+granules+in+the+mature+muscle+larva+of+Trichinella+spiralis.">The stichosome and its secretion granules in the mature muscle larva of Trichinella spiralis.</a> J. Parasitol. 62 (5), 775-785 (1976).</li><li>Marucci, G., Interisano, M., La Rosa, G., Pozio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+nematode+larvae+different+from+those+of+the+Trichinella+genus+detected+by+muscle+digestion.">Molecular identification of nematode larvae different from those of the Trichinella genus detected by muscle digestion.</a> Vet Parasitol. 194, 117-120 (2013).</li><li>Forbes, L. B., Gajadhar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+Trichinella+digestion+assay+and+an+associated+sampling+and+quality+assurance+system+for+use+in+testing+pork+and+horse+meat.">A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat.</a> J. Food Prot. 62, 1308-1313 (1999).</li><li>Malakauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+Trichinella+spp.+in+three+Baltic+countries:+Lithuania,+Latvia,+and+Estonia.">Molecular epidemiology of Trichinella spp. in three Baltic countries: Lithuania, Latvia, and Estonia.</a> Parasitol. Res. 100 (4), 687-693 (2007).</li><li>Kapel, C. M., Webster, P., Gamble, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+distribution+of+sylvatic+and+domestic+Trichinella+larvae+in+production+animals+and+wildlife.">Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife.</a> Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).</li><li>Interisano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+latex+agglutination+test+for+the+detection+of+Trichinella+infections+in+pigs.">Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs.</a> Vet. Parasitol. 194, 121-124 (2013).</li><li>Pozio, E., La Rosa, ., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-derived+methods+for+the+identification+of+Trichinella+parasites+from+animal+and+human+samples.">PCR-derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples.</a> Methods Mol. Biol. 216, 299-309 (2003).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות ששיטת הבוחש המגנטית יכולה להתבצע בקלות, לא הקפדה על פרטים טכניים מובילה רגישות מספק, ובכך מסכנת את בריאות צרכנים. נקודות הבקרה הקריטיות הודגשו בטקסט לעיל. בנוסף, השימוש בציוד מתאים הוא קריטי עבור התוצאה המוצלחת של המבחן. כל הכלי צריך להיות עשויים טיפי זכוכית פיפטה מצופים סיליקון להפחית דבקות של זחלים אל פני השטח. הרגישות של שיטת העיכול תלוי צפיפות הזחל בשרירים וכמות מדגם שריר הנבדקת. עבור צפיפות זחל של 3 - 5 גפ&quot;מ רקמות שריר, רגישות של 100% נמסרה, אך מתחת גפ&quot;מ 1 הרגישות ירדה ל -40% 13. בהתאם מינים של בעלי החיים מארחים נבדקים, הרגישות של הבדיקה ניתן לשפר על ידי הגדלת כמות מדגם. האנינטל nfection חיות בר הוא בדרך כלל נמוך, ולכן גדלים מדגמים גדולים משמשים 14. אתרי נטייה גם להשתנות בין בעלי חיים מארחים. הנה, את הנעכלות הנמוכות של כמה רקמות שריר כגון הלשון צריכה להילקח בחשבון, אשר יכול גם לגרום מדגם גדול יותר בגדלי 15. יתר על כן, חשוב להבין כי שיטת הבוחש המגנטית אינה כוללת בקרות פנימיות. לכן, ניהול אבטחת איכות מדגימה בתיעוד חיוני להשיג תוצאות מדויקות ומדויקות. איכות ביצועי מעבדה כדי לזהות זחלי Trichinella בדגימות שריר צריך להיות במעקב על ידי השתתפות סדירה של כל אנליסט במבחני בקיאות. הגבלות נוספות של השיטה הן ששלב זיהוי הסופי של זחלים שרירים על ידי מיקרוסקופ הוא סובייקטיבי מאוד heavily תלוי בידיעת מורפולוגיה זחל על ידי המטפל לבחון. שיטה חלופית מעניינת לעקוף בעיה זו היא השיטה בוחשת המגנטית / על בידוד המסנן ואחריו זיהוי זחלים על ידי מבחן התלכדות לטקס. עם זאת, לפי חוקי איחוד שיטה זו נחשבת רק שווה ערך עבור הבדיקות של בשר חזירים מקומיים אך לא עבור בעלי חיים אשר נמצאים בסיכון גבוה יותר של הידבקות כגון חזיר בר 4. זיהוי של אנטיגן הזחל עם נוגדנים חד שבטיים עושה המבחן אובייקטיבי יותר, אך מכחיש במעבדה אפשרות קביעת מספר הזחלים לגרם בשר 16. וריאציות נוספות של השיטה הבוחשת המגנטית כוללות את טכניקת שיטה / שקיעת עיכול מדגם נקווה בעזרת מכשור המכאני, חפירה המדגמת ונקווית בעזרת מכשור המכאנישיטת estion / על טכניקת בידוד מסנן, ושיטת העיכול האוטומטית עבור דגימות משולבות של עד 35 טכניקה גרם. טכניקות אלו מבוססות כולם על העיכול המלאכותי של הבשר להדמית ספירת Trichinella הזחלים, אך נבדלות הציוד המשמש את צעדי הסינון ושיקוע. הזחלים המבודדים ניתן לזהות נוסף ברמת המין על פי מבחן מולקולרי (למשל, רב מפלסי PCR) 17. לפי תקנות איחוד אירופאיות, כל הדגימות החיוביות יש להעביר למעבדת ההתייחסות הלאומית או EURLP לקביעת מיני Trichinella.

נמטודות ממין Trichinella ניתן לאתר בשרירים מפוספסים של יונקים טורפים ו אומניבור, ציפור, וזוחל ברחבי העולם. נמטודות zoonotic אלה יכולים להגיע בני אדם כאשר גלם או חצי גלם מוצרים שמקורם בשר מן החזירים, סוס, וחיות המשחק מעובדים. זואונוסיס זה יכול להיות מחלה קשה בבני האדם מאופיינים בתסמינים פתוגנומוני, למשל שלשול, חום, בצקת periorbital ואת כאבי שרירים וסיבוכים אפשריים כגון דלקת שריר לב, מחלת תרומבואמבוליים ודלקת מוח 1. Spiralis Trichinella הוא סוכן אטיולוגי הנפוץ ביותר של דלקת Trichinella בטבע פראי ופנים וגורם למרבית של זיהומי אדם ברחבי עולם. באירופה, צפון ומערב אפריקה, ובמערב אסיה, Trichinella britovi הוא מקור נוסף של זיהומים האדם. בנוסף, עשרה מינים אחרים פחות מדווחים בכינויו סיבתי<html> סוכנים של המחלות האנושיות והן נמצאים באזורים שונים של העולם, בדרך כלל חיות בר 2. בנוסף חיות ברות כגון חזיר בר, דובים, סוסי ים וגיריות, חזיר מייצג את המקור החשוב ביותר של הידבקות בני אדם ברחבי העולם. הדרך הטובה ביותר למנוע trichinellosis היא להימנע מאכילת מוצרי בשר נאים לבשל כל בשר, בעיקר בשר משחק לטמפרטורות בטוחות (&gt; 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, כלומר לשנות את צבע בשר מורוד עד חום הליבה של מוצר בשר) 3. האיחוד האירופי USDA ציינו פעמי הקפאה ובישול וטמפרטורות עבור מוצרי בשר חזיר, שניתן להשתמש בם כדי להרוג זחלי ט spiralis בבשר 4, 5. יתר על כן, המלצות על האיון של Trichinella במוצרי בשר שפורסמו על ידי הוועדה הבינלאומית Trichinellosis&quot;Xref&quot;&gt; 6. באירופה, בנוסף המבוא של תנאי דיור נשלטו בעדרים מסחריים חזירים שבה סכנת זיהום Trichinella זניחה, למניעת trichinellosis אדם מבוססת על הבדיקה במעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות 4. למטרות בטיחות מזון, מבחני עיכול הנהלים האמינים רק לצורך זיהוי הישיר של זחלי Trichinella בבשר 3, 7. גם אם יש כמה וריאציות של assay העיכול, השיטה הבוחשת המגנטית היא שיטת ההתייחסות המקובלת בעולם 3, 4, 7. Assay זה מבוסס על זיהוי של זחלי Trichinella ברקמות שריר מפוספסים. לאחר העיכול אנזימטי של דגימות שריר וצעדי סינון ושיקוע עוקבים Triזחלי chinella מזוהים על ידי מיקרוסקופ. בהתאם חובות סחר וחקיקה לאומית, יש שפע של וריאציות קטנות בפרוטוקול הכללי של שיטת הבוחש המגנטית. הנה, הפרטים הטכניים מבוססים על דרישות האיחוד האירופי 4 מפרטים ISO 8, הנחיות ICT 6, והחוויה של מעבדת יחוס האיחוד האירופי עבור טפילים (EURLP) ובמעבדה הפניה הגרמני Trichinella.

<table><tbody><tr><td>Knife, Scissors, Tweezers</td><td></td><td></td><td>Cutting samples and removing non-digestible tissue</td></tr><tr><td>Blender&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>With a sharp chopping blade</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td></td><td></td><td>With thermostatically controlled heating plate</td></tr><tr><td>Stirring Rod</td><td></td><td></td><td>Teflon-coated, approximately 5 cm long</td></tr><tr><td>Conical glass separation funnel</td><td></td><td></td><td>Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation.</td></tr><tr><td>Stands, rings and clamps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieve</td><td></td><td></td><td>Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh</td></tr><tr><td>Funnel</td><td></td><td></td><td>Internal diameter not less than 12&amp;nbsp;cm, to support the sieves</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td></td><td></td><td>Capacity 3 L</td></tr><tr><td>Glass measuring cylinder</td><td></td><td></td><td>Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td></td><td></td><td>With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td></td><td></td><td>9 cm diameter, marked on their undersides into 10 &amp;times; 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope</td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td>Alternatively a lid to cover the beakers</td></tr><tr><td>25% hydrochloric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td></td><td></td><td>Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (F&amp;eacute;d&amp;eacute;ration internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>70-90% ethyl alcohol</td></tr><tr><td>Tap water</td><td></td><td></td><td>Heated to 46-48 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Balance</td><td></td><td></td><td>Accurate to at least 0.1 g</td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td>Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice</td></tr><tr><td>Pipettes and pipette holder</td><td></td><td></td><td>Different sizes (1, 10 and 25 mL)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Accurate to 0.5 &amp;deg;C, temperature range at least from 20 &amp;deg; C to 70&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Siphon</td><td></td><td></td><td>For tap water</td></tr></tbody></table>

magnetic stirrer method for the detection of trichinella larvae in muscle samples

Trichinellosis היא מחלה מתישה בבני אדם והיא נגרמת על ידי צריכת בשר נא או שלא בושל של חיות נגועות עם הזחלים נמטודות מהמין Trichinella. המקורות החשובים ביותר של זיהומי אדם בעולם הם בשר משחק ומוצרי בשר חזיר או בשר חזיר. במדינות רבות, מניעת trichinellosis אדם מבוססת על זיהוי של בעלי חיים נגועים באמצעות העיכול המלאכותי של דגימות שריר מ פגרי בעלי חיים רגישים. ישנן מספר שיטות המבוססות על העיכול של בשר אבל השיטה הבוחשת המגנטית נחשבת תקן הזהב. שיטה זו מאפשרת זיהוי של זחלי Trichinella ידי מיקרוסקופ לאחר העיכול אנזימטי של דגימות שריר וצעדי סינון ושיקוע שלאחר מכן. אמנם שיטה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ויקר, בקרות פנימיות לא ניתן להשתמש. לכן, ניהול איכות מחמירים יש applieד לאורך כל הבדיקה. מטרת העבודה הנוכחית היא לספק הוראות טיפול מפורטות ונקודות בקרה קריטיות של שיטת אנליסטים, על סמך הניסיון של המעבדת תחוס האיחוד האירופי עבור טפילים ובמעבדת ההתייחסות הלאומית של גרמניה עבור Trichinella.

<html> לאחר עיכול, את הצורה של זחלי שריר התולעת יכולה להשתנות, מה שהופך זיהוי קשה יותר. צורות אופייניות כוללות זחלים מפותלים היטב, זחלים או ג בצורה מפותלת קל או זחלי uncoiled לחלוטין (2B ומספרים - 2C). מספר הזחלים מצא לגרם יכול להשתנות במידה ניכרת והוא נע בין זחל אחד לכמה מאה זחלים. המורפולוגיה של זחל שריר זיהומיות מוצגת איור 2 א. זחלי Trichinella הם 0.7 1.5 מ&quot;מ ארוך כ 0.3 מ&quot;מ רוחב. הוושט הוא צר ויש לו סוף מעוגל מעט. לציפורן היא חלקה. במחצית הקדמית של חלל הגוף, stichosome, מבנה היווה של צינור ארוך וצר מוקף בשורה של 45 עד 55 תאים גדולים (stichocytes), ניתן לצפות. פי הטבעת הוא גם מעוגלת ללא כל תחזיות או כספיחיהם 10, 11. t &quot;&gt; מבנים אחרים, מלבד זחלי Trichinella, ניתן למצוא לאחר עיכול שרירים כמה דוגמאות מוצגות איורי 3A -.. 3F חיות ברות נגועות לעתים קרובות עם טפילים אחרים או דגימות השריר הזמינות לבדיקה הם מזוהמים במהלך תהליך הוצאת הקרביים על ידי נפש או מבנים דוממים / אורגניזמים. אורכו של הזחלים, את המראה של קצוות הקדמי וגם האחורי לבין התרחשות לסייע stichosome להפלות בין סוגים שונים נמטודות 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> איור 1: בדיקה מיקרוסקופית של Trichinella זחלים לאחר (א) לא מספק ו (ב) שלבי שטיפה מספיק. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול ve</a>rsion של נתון זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> איור 2: המורפולוגיה של זיהומיים Trichinella זחלים מציגים הרקטום, Stichosome והוושט של הזחל (א). צורות אפשריות של זחלי שרירים אחרי הראה העיכול (B) מפותלות היטב מפותלות קלות העברת זחלים (C) נפרשו עד זחלים. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> איור 3: דוגמאות לממצאים אגב לאחר העיכול של שרירי דוגמאות עם שיטת סטירר המגנטית. (א) זיפים דמויי שיער שלתולעת מצאה אדמת חזיר בר; (ב) Alaria Alata מן חזיר בר; (C) סיבי השריר מן חזיר בר; (ד) Metastrongylus sp. מן חזירי בר; (ה) צמח סיבים נמצאים חזיר בר (F): sp Toxocara. הזחל מן חזיר בר. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples at JoVE.com

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

מניעת trichinellosis אדם במדינות רבות ברחבי העולם בוסס על בחינת המעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות בשיטות של עיכול, מתוכם שיטת הבוחש המגנטית נחשבת תקן הזהב.

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

magnetic-stirrer-method-for-detection-trichinella-larvae-muscle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

28.6K Views.  Federal Institute for Risk Assessment.  מניעת trichinellosis אדם במדינות רבות ברחבי העולם בוסס על בחינת המעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות בשיטות של עיכול, מתוכם שיטת הבוחש המגנטית נחשבת תקן הזהב. 

Video: Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Biology

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Developmental Biology

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Neuroscience

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Medicine

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

צפייה ברשתות מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים של דרוזופילה ובתאי שריר

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

מחבר זרקור: הבנת רשת מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים דרוזופילה 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video