TGKは彼らの財政支援のためにミュンヘン工科大学の理工学国際大学院（IGGSE）を認めています。 HKは、彼らのサポートのための統合されたタンパク質科学ミュンヘンセンター（CIPSM）を認めています。

注：すべての試薬および溶媒は、商業的供給業者から入手し、さらに精製することなく使用しました。 注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。化学合成（ 例えば、ドラフトチャンバー、安全メガネ、手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴を）実行するときに、すべての適切な安全装置を使用してください。 グアニジニル前駆体の合成<ol><li> アルキル化種 <ol><li> メチル化された種 <ol><li> N、N &#39; -ジのBoc- 1 H -ピラゾール-1-カルボキサミジン（3.2ミリモル、1当量）及びトリフェニルホスフィン1.0gを1.0gの溶解（のPPh 3、3.8ミリモル、1.2当量）の乾燥10mLの室温（RT）で、ゴム隔膜を用いて不活性雰囲気中で50 mLの丸底フラスコにテトラヒドロフラン（THF）。シリンジ（4.8ミリモル、1.5当量）及びLを用いて乾燥メタノール194μLを加えますら、それはRTで攪拌。 </li><li>別々に、小さなガラスバイアル中の乾燥THF 2mL中のジイソプロピルアゾジカルボキシレートの747μL（DIAD、3.8ミリモル、1.2当量）の溶液を調製します。撹拌しながら、シリンジ（15分にわたって）を使用して、N、N &#39; -ジのBoc- 1 H -ピラゾール-1-カルボキサミジン、PPH 3、及びメタノールの溶液にTHFを滴下でDIADの溶液を加えます。 RTで2時間のためのソリューション攪拌をしてみましょう。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去し、1mLのジクロロメタン（DCM）中の粗生成物を溶解させます。ペンタン溶液中の10％酢酸エチルでシリカ100gの（EtOAc）でフラッシュカラムインチ（2.5cm×20 cm）を読み込みます。カラムに溶解した粗生成物をロードし、圧力（1.5バール）下で溶媒を加えます。 </li><li>画分（溶媒系：ペンタン中の定組成の10％EtOAc）を収集し、薄層クロマトグラフィー（TLC）により、所望の化合物スポットを特定し、（R F = 0.4、酢酸エチル/ペンタン1：9、UV）を集めます。コンバイン希望画分を黄色の粘性油状物（2.6ミリモル、81％収率）として表題化合物0.85 gを得たロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させ、。さらに使用するために室温で得られた化合物を保管してください。 </li></ol></li><li> ヘキシルアミン修飾種 <ol><li> N、N &#39; -ジBOC-1 H -ピラゾール-1-カルボキサミジン1.0gを溶解し（3.2ミリモル、1.0当量）、DDE-6-アミノヘキサノール0.9gの（3.8ミリモル、1.2当量）、および1.0グラムRTにゴム隔膜を用いて不活性雰囲気中で50 mLの丸底フラスコ中の乾燥THF 10mL中のPPh 3（3.8ミリモル、1.2当量）の。 </li><li>別々に、小さなガラスバイアル中のDIADの747μL（3.8ミリモル、1.2当量）の乾燥THF 2mL中の溶液を調製します。攪拌しながら、Nの溶液にTHFを滴下でDIADの溶液を加え、シリンジを用いてN &#39; -ジのBoc- 1 H -ピラゾール-1-カルボキサミジン、PPH 3、及びDDE-6-アミノヘキサノール（オーバー15分） 。 RTで2時間のためのソリューション攪拌をしてみましょう。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去し、DCM 1mL中の粗生成物の最大を取ります。ペンタン/酢酸エチルの溶液にシリカ100gをフラッシュカラムインチ（2.5cm×20 cm）をロードする（2：1）。カラムに溶解した粗生成物を適用し、圧力（1.5バール）下で溶媒を加えます。 </li><li>画分を収集する（溶媒系：定組成2：1つのペンタン/ EtOAc）で、TLCで所望の画分を同定し、それらを収集する（式中、R f = 0.66、2：1つのペンタン/酢酸エチル、UV）。所望の画分を合わせ、黄色の粘性油状物（2.8ミリモル、88％収率）として表題化合物1.6gを得るために、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させます。さらに使用するために室温で得られた化合物を保管してください。 </li></ol></li></ol></li><li> アシル化種（2つの反応工程） <ol><li> Sの -methylisothiuroniumヘミ硫酸を1.4g（10ミリモル、1.0当量）及びジ（tert-ブチル ）ジカーボネート2.2gの溶解（10ミリモル、1.0当量）を、激しく撹拌中DCMの二相性溶液をリング/ 座っ。水溶液 。 NaHCO 3およびそれをRTで24時間撹拌しましょう。 </li><li>分液漏斗中で層を分離し、DCMで水性相を3回抽出します。有機相を結合し、Na 2 SO 4でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。ヘキサン1mL中の粗生成物を上に取ります。 </li><li> 1ヘキサン/ EtOAc：4の溶液中でシリカ100gをフラッシュカラムインチ（2.5cm×20 cm）を読み込みます。カラム上の溶解した粗生成物をロードします。圧力下で溶媒を追加します。 4：1定組成ヘキサン/ EtOAc（UV検出：254 nm）を、それらを収集する（式中、R f = 0.30）TLC（溶媒系で所望の画分を同定します。 </li><li>所望の画分を合わせ、黄色の粘性油状物（5.8ミリモル、58％収率）として表題化合物1.1gを得るために、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させます。試薬、Nを保管- （tert-ブチルブトキシカルボニル） - S -meさらに使用するために室温でthylisothiourea、。 </li><li> Nの250 mgの溶解-不活性雰囲気中で50 mLの丸底フラスコのS -methylisothiourea（1.3ミリモル、1.0当量）の乾燥N、N-ジメチルホルムアミド（DMF）10mL中で- （tert-ブチルブトキシカルボニル） RT。シリンジを用いてN、N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）の440μL（2.6ミリモル、2当量）を加えます。撹拌しながら、（5.2ミリモル、4.0当量）のAc 2 Oの245μLを加える注射器を用いて滴下し、室温で1時間撹拌しましょう。 </li><li>注射器を用いて混合物に過剰のメタノール（2 ml）を追加し、室温で15分間撹拌しましょう。ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。 DCM 1mL中の粗生成物を上に取ります。 </li><li> 1つのヘキサン/ EtOAc：3：3の溶液中のシリカ60gを用いたフラッシュカラムインチ（2.5cm×20 cm）を負荷1。カラムに溶解し、粗生成物を適用します。追加溶媒（3：1つのヘキサン/ EtOAc）及び圧力（1.5バール）。 （1：1ヘキサン/ EtOAc、UV：220nmの3）、およびCOL TLCで所望の画分を同定それら（R F = 0.62）をLECT。 </li><li>所望の画分を合わせ、（0.9ミリモル、70％収率）を白色の固体として表題化合物210 mgを得ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させます。さらに使用するために室温で化合物を保管してください。 </li></ol></li></ol>環状ペプチド前駆体の合成2。 <ol><li> ロードとTCP樹脂をキャッピング <ol><li>フリット付きプラスチック20mLの注射器に2-chlortriylクロリド（CTC）樹脂（0.9ミリモル/ g）およびのFmoc-Glyを-OH（1.2当量）の320 mgの1.00グラムを加えます。乾燥DCM 5mLにDIPEAの313μL（2当量）の溶液を調製し、注射器に追加します。それは、回転ユニットを用いてRTで1時間回転させましょう。 </li><li> （;キャッピング溶液v / v）の1つのメタノール/ DIPEA：一方、5の2 mL溶液を調製します。注射器にキャッピングソリューションを追加し、さらに15分間回転させてみましょう。 DCM（5×）およびDMF（3×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> Fmoc脱保護、樹脂上<ol><li> 10分間DMF中の20％ピペリジンを用いて樹脂結合のFmoc-Glyをを治療し、次いで5分間。 DMF（3×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> 樹脂上のFmoc-Ornで（DDE）の結合-OH <ol><li> Fmoc-L-Ornでの934 mgの（DDE）-OH（2当量）、1- [ビス（ジメチルアミノ）メチレン]の684 mgの追加-1 H -1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3- OXIDニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）（2当量）、および1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）の245 MG（2当量）を小さなガラスバイアルへとDMF 5mL中に溶解します。 DIPEAの814μLを追加します。 </li><li>オイル、Fmoc脱保護し、洗浄し、樹脂結合のGlyにこのソリューションを追加し、それを1時間回転させてみましょう。 DMF（3×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> Fmoc脱保護、樹脂上 <ol><li> 10分間DMF中の20％ピペリジンで-Gly樹脂結合のFmoc-Ornで（DDE）を処理し、次いで5分間。 DMF（3×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> Fmoc-のVal-OHの樹脂上の結合 <ol><li> Fmoc-のVal-OHの610 mgの追加（2当量）、6HATUの84 MG（2当量）、及び245小さなガラスバイアルへのHOAtのMG（2当量）およびDMF 5mL中に溶解します。 DIPEAの814μLを追加します。 </li><li>この溶液を追加したFmoc脱保護洗浄し、樹脂結合Ornで（DDE）-Gly、それは1時間回転させ。 </li></ol></li><li> Fmoc脱保護、樹脂上 <ol><li> 10分間DMF中の20％ピペリジンで-Gly樹脂結合のFmoc-のVal-Ornで（DDE）を処理し、次いで5分間。 DMF（3×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> オン樹脂N-メチル <ol><li> DCM（3×）で樹脂を洗浄します。 DCM中2 - nitrobenzenesulfonylchloride（O -NBS-Clで、4当量）の887ミリグラムを溶解し、2,4,6-コリジンの1.2 mLを加える（10当量）。 </li><li>樹脂結合ペプチドにソリューションを追加し、室温で20分間インキュベートしましょう。 </li><li> CH 2 Cl 2（3×）で及びTHF（5×）で樹脂を洗浄します。 PPh 3 1.18gの（5当量）及びTHF中のメタノールの365μLの溶液を調製します。このソリューションを追加注射器。 </li><li> THF 2mLにDIADの883μLの溶液を調製し、注射器に追加します。それが15分間インキュベートしてみましょう。 THF（5×）で及びDMF（5×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> O -Ns脱保護 <ol><li>メルカプトエタノール570μL（10.0当量）およびDMF 2mL中diazabicycloundecenの672μL（DBU）の溶液を調製します。シリンジにこのソリューションを追加し、5分間インキュベートしましょう。 </li><li>脱保護工程を繰り返し、次いで、DMF（5×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> Fmoc-D-Pheを-OHの樹脂上の結合 <ol><li> Fmoc-D-Pheを-OHの697 mgの追加（2当量）、HATUの684 mgの（2当量）、及び小さなガラスバイアルへのHOAt（2当量）の245ミリグラムとDMF 5mL中に溶解。 DIPEAの814μLを追加します。 </li><li>オイル、Fmoc脱保護し、洗浄し、樹脂結合ペプチドにこのソリューションを追加し、それを1時間回転させてみましょう。 </li></ol></li><li> Fmoc脱保護、樹脂上 <ol><li>樹脂Bを治療しますound DMF中20％ピペリジンで10分間、次いで5分間有するペプチド。 DMF（3×）で樹脂を洗浄します。 </li></ol></li><li> Fmoc-ASP（m BU）-OHの樹脂上の結合 <ol><li>のFmoc- Aspで（m BU）-OH（2当量）、HATUの684ミリグラムの741 mgの追加（2当量）、およびHOAtを245 MG（2当量）を小さなガラスバイアルに5 mLのそれを溶かしますDMFの。 DIPEAの814μLを追加します。 </li><li>オイル、Fmoc脱保護し、洗浄し、樹脂結合ペプチドにこのソリューションを追加し、それを1時間回転させてみましょう。 </li></ol></li><li> 樹脂から線状ペプチドの切断 <ol><li> DCM中のヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）の溶液10mlを調製し、続いてDCM（3×）で樹脂を洗浄し（1：4、v / v）でした。 </li><li>樹脂にソリューションを追加し、それを15分間回転させてみましょう。丸底フラスコ内の溶液を集めます。切断を繰り返し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させます。 </li></ol></li><li> 線状ペプチドの環化 <ol><li>ディssolveのNaHCO 3（5.0当量）の384ミリグラムとジフェニルホスホリルアジド（DPPA）の582μL（3.0当量）のDMF 50mL中の、粗生成物に追加します。それは一晩または全く線形ペプチドがESI-MS（10時間）17を用いて観察されなくなるまで攪拌してみましょう。 </li><li>減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて小容積に溶剤を減らします。塩化ナトリウム（ブライン）の飽和水溶液を調製。パスツールピペットを用いて、遠心分離管中のNaClの飽和水溶液の40 mLに環化ペプチドを滴下して加えます。 </li><li>懸濁液（5,000×gで、5分間）遠心分離し、HPLC等級の水（2x）で沈殿物を洗浄します。製品を凍結乾燥。 </li></ol></li></ol>ソリューション3.グアニジニル及び脱保護<ol><li> テーラーメイド前駆体とグアニジニル <ol><li> 2M、例えば、（DMFの小容積に直交脱保護環状ペプチドの少量（ 例えば、25 mg）を溶解L）。 2当量を追加します。グアニジニル前駆体と2当量の。溶液へのDIPEAのと、それはRTで2時間撹拌してみましょう。 </li><li> HPLC-MSとの反応の進行状況を監視します。反応が完了した後、アセトニトリル中guanidinylated環状ペプチドを再溶解し、溶媒を除去し、半分取HPLC精製16を実行します。 </li></ol></li><li> 酸に不安定な側鎖保護基の除去 <ol><li>トリフルオロ酢酸（TFA）、水、およびトリイソプロピルシラン（TIPS）を含有する溶液の2mLの準備（95 / 2.5 / 2.5、v / v / v）です。小さなガラスバイアルに精製された生成物にこのソリューションを追加し、それは少なくとも1時間室温で攪拌しましょう。 ESI-MS 17との完全な脱保護を観察します。 </li><li>少量に減圧下で溶媒を蒸発させます。氷冷エーテルを調製し、50mLの遠心管中で10 mLを加え。それを追加することにより、パスツールピペットを用いて氷冷エーテルで脱保護されたペプチドを沈殿させます滴下しました。遠心分離ペレットを得た懸濁液（5,000×gで、5分間）。 </li><li> （5,000×gで、5分間、2×）氷冷エーテルで沈殿物を洗浄し、それを遠心分離。 HPLCグレードの水2mL中に生成物を溶解し、セミ分取HPLC 16でそれを精製します。 </li></ol></li></ol> 4.分析データおよび精製のためのパラメータ<ol><li> 分析的HPLC-ESI-MS <ol><li> C18カラム（12 nmの細孔サイズ3μmの粒子サイズ、2.1ミリメートル×125ミリメートル）またはC8カラム（20 nmの細孔サイズ、5μmの粒子を用いたLCQ質量分析計を用いて分析的HPLC-ESI-MSを行いますサイズ、溶離液としてH 2 O（0.1％v / vのギ酸）/アセトニトリル（0.1％v / vのギ酸）と250ミリメートル×2.1ミリメートル）。 </li></ol></li><li> セミ分取HPLC <ol><li> ODSカラム（20×250ミリメートル、5μm）を、8 mL /分の流速、及び線形勾配を用いて分取HPLC機器を使用してセミ分取HPLCを行いますH 2（TFA V 0.1％V /）O（0.1％TFA V V /）およびアセトニトリル。 </li></ol></li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

グアニジニルの前駆体は、固相ペプチド合成（SPPS）の標準的なFmocプロトコルによって合成される直交脱保護環状ペプチド誘導体、（C（OrnD（m BU）GF（N Me）のV））です。オルニチンは、ペプチド骨格の環化後のDMF中のヒドラジンで脱保護することができる直交保護された誘導体、カルボニル（Fmoc-Ornで（DDE）-OH）として使用しました。ペプチド前駆体は、化合物の沈殿に?...

天然リガンドで最も豊富なファーマコフォア基のうちの複数の相互作用1,2に関与するグアニジン基、です。例えば、水素結合相互作用の潜在的な四重の水素供与体として機能し、そのような塩橋または陽イオンπ相互作用のような静電相互作用に関与しています。医薬品化学では、このグループは、多くの場合、非常に頻繁にグアニジンミメティック5、6などが、薬物および薬物候補4で発見されました。グアニジン模倣物の開発のための理由は、ユビキタス、正に荷電したグアニジン基の除去、ならびにリガンドの親油性の調整です。ペプチドリガンドでは、唯一のグアニジン基を有するアミノ酸は、したがって、多くの場合、ペプチドリガンドの生物活性領域に見出される、アルギニンです。 非常にPRアルギニン含有リガンドファミリーのためominent例は、RGD結合性インテグリンのファミリーです。一般的に、インテグリンは、すべての高等生物に重要な機能を引き継ぐ細胞接着受容体の一種です。これらの機能のいくつかは、細胞接着、移動、および細胞の生存を伴います。このように、彼らはまた、癌および線維症などの病理学的徴候、に関与しています。インテグリンは24の現在知られているインテグリンサブタイプを形成するα-及びβサブユニットからなる膜貫通ヘテロ二量体タンパク質です。それらの8は、それらのリガンド7のトリペプチド配列Arg-Gly-Asp（= RGD）を認識する。結合領域は、細胞外部分、いわゆるインテグリンヘッド群8におけるこれらの2つのサブタイプの間の界面に位置しています。ベータサブユニットおよびリガンドにカルボン酸を結合する（CHA側に配置された金属イオン依存性接着部位（MIDAS）領域：RGDは、2つの一般的な相互作用により認識されます）のAspの中。 αサブユニットに位置しているリガンドおよびグアニジン基、。インテグリンサブタイプのほとんどは無差別であり、その自然の細胞外マトリックス（ECM）9リガンドの少なくとも一部を共有します。このように、人工的インテグリンリガンドの開発のために、主要な焦点は、高い結合親和性、サブタイプ選択のほかに、です。グアニジン基：最近、我々はサブタイプ選択性リガンドを生成するための鍵となる要素を公開することができました。異なる修飾を介して、αv-およびα5含有インテグリンサブタイプbiselectiveリガンドは、異なるαサブユニット10を識別することができるグアニジン基、に単純な修飾により選択的化合物に変えることができます。 αVのポケットに、グアニジン基は、Asp218 11、12を有する二座塩橋を介してサイドに相互作用します。この相互作用のCまた、（α5でAsp227と、ここ）α5β1で観察されるが、さらに、 エンドオン Gln残基（Gln221）とグアニジン基の相互作用は、13が観察されます。 、グアニジンのメチル化と、ある場合には、グアニジン基のNδのメチル化とサイドでの相互作用をブロックすることにより、および他の場合にはNω：したがって、我々は2つの反対の方法でグアニジン基を修飾しましたエンド・オン相互作用をブロックします。驚くべきことに、この小さな変更は、リガンドで完全な選択のシフトにつながりました。アルキル化に加えて、新たな官能化方法はこの出版物に導入しました。 pentapeptidicリガンドのこのタイプの古典的な官能化方法は、結合に関与しないアミノ酸の側鎖のコンジュゲーションを介して（ 例えば、CにおけるK（RGDfK））14、15。ここに、結合のために重要である - - アシルまたはアルキル化されたリンカーを有する我々は、官能化は、グアニジンを変更することによっても可能であることを示しています。結合のために不可欠である正の電荷が保持され、モデルが一層リンカーの結合のための理想的な可能性を提供し、単位（ 例えば、蛍光標識または分子のためのキレート剤を標識し、結合ポケットのうち、長鎖ポイントことを示唆していますイメージング）。 本研究では、アルギニン含有配位子でグアニジン基の修飾のための取手順に専念します。これは、より長いリンカー単位を有するNω -メチル種の合成、ならびにグアニジンを含みます。異なる修飾は、アシルおよびアルキル基を含みます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">N,N&#8242;-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">434167&#160;ALDRICH</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triphenylphosphine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T84409&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran, &#62;99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diisopropyl azodicarboxylate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>225541&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethan, for synthesis, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica gel for flash chromtaography</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60738&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Pentane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Hexane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylacetate, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminohexanol, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A56353&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Methylisothiourea hemisulfate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M84445 ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Di-tert-butyl dicarbonate, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>205249&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamid, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamin, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydrid, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chlortrityl resin</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Gly-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidin, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>104094&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Orn(Dde)-OH</td>
			<td>Iris-Biotech</td>
			<td>FAA1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HATU, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HOAt, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Val-OH</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N11507&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,4,6-Collidine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27690&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mercaptoethanol, 99%&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diazabicycloundecen, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>139009&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-D-Phe-OH, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>47378&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexafluoroisopropanol</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC03056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diphenylphosphoryl azide, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>178756&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TFA, 99.9%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilan, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>233781&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN44</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification and functionalization of the guanidine group by tailor-made precursors

グアニジン基は、医薬品化学において最も重要なファーマコフォア基の一つです。グアニジン基を有する唯一のアミノ酸はアルギニンです。この記事では、ペプチドリガンドにグアニジン基の修飾のための簡単な方法は、RGD結合性インテグリンリガンドの例に、設けられています。最近、これらのリガンドにグアニジン基の異なる修飾は、（αVサブタイプα5との間に、例えば ）サブタイプの選択的調節を可能にすることが示されました。また、グアニジン基を介して官能化するための以前不明戦略が実証された、および合成アプローチは、この文書に概説されています。本明細書に記載の修飾は、末端伴う（Nω）アルキル化及びアセチルグアニジン基。合成のために、オーダーメイドの前駆体分子は、次いで、プレを転送するために直交脱保護アミンとの反応に供され、合成され変性グアニジン基。アルキル化グアニジンの合成のために、N、N &#39; -ジのBoc- 1 H -ピラゾール-1-カルボキサミジンに基づいて前駆体を選択した前駆体はN -Boc- Sの対応するアシル化誘導体であり、アシル化化合物を合成するために使用されています-一次元及び二段階の反応で得ることができるメチルイソチオ尿素、。

環状ペプチド前駆体は、線状ペプチドとして合成環化、及び直交DDE-脱保護しました。沈殿後、化合物の純度は、HPLC-MS（ 図1）を用いて分析しました。反応の進行をモニターするために、HPLC分析は、2時間の反応時間（ 図2）の後に行きました。 グアニジン基上の大きな残基を、2時間の反応時間は?...

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Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

対応する前駆体の使用に基づくアルキル変性グアニジンの合成のためのプロトコルが提供されます。

オーダーメイドの前駆体によってグアニジン基の修飾と機能化

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

modification-functionalization-guanidine-group-tailor-made

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K ビュー.  Technische Universität München. 対応する前駆体の使用に基づくアルキル変性グアニジンの合成のためのプロトコルが提供されます。 

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

生化学

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane proteins and other molecules, and diverse luminal content inherited from a parent cell, which includes RNAs, proteins, and DNAs. The characterization of the hydrodynamic sizes of EVs, which depends on the size of the vesicle and its coronal layer formed by surface decorations, has become routine. For exosomes, the smallest of EVs, the relative difference between the hydrodynamic and vesicles sizes is significant. The characterization of vesicles sizes by the cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) imaging, a gold standard technique, remains a challenge due to the cost of the instrument, the expertise required to perform the sample preparation, imaging and data analysis, and a small number of particles often observed in images. A widely available and accessible alternative is the atomic force microscopy (AFM), which can produce versatile data on three-dimensional geometry, size, and other biophysical properties of extracellular vesicles. The developed protocol guides the users in utilizing this analytical tool and outlines the workflow for the analysis of EVs by the AFM, which includes the sample preparation for imaging EVs in hydrated or desiccated form, the electrostatic immobilization of vesicles on a substrate, data acquisition, its analysis, and interpretation. The representative results demonstrate that the fixation of EVs on the modified mica surface is predictable, customizable, and allows the user to obtain sizing results for a large number of vesicles. The vesicle sizing based on the AFM data was found to be consistent with the cryo-TEM imaging.&#160;

A step-by-step procedure is described for label-free immobilization of exosomes and extracellular vesicles from liquid samples and their imaging by atomic force microscopy (AFM). The AFM images are used to estimate the size of the vesicles in the solution and characterize other biophysical properties.&#160;

原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ratio and conformational changes of macromolecules and macromolecular complexes. A high quality SAXS dataset for structural modeling must be from monodisperse, homogeneous samples and this is often only reached by a combination of inline chromatography and immediate SAXS measurement. Most commonly, size-exclusion chromatography is used to separate samples and exclude contaminants and aggregations from the particle of interest allowing SAXS measurements to be made from a well-resolved chromatographic peak of a single protein species. Still, in some cases, even inline purification is not a guarantee of monodisperse samples, either because multiple components are too close to each other in size or changes in shape induced through binding alter perceived elution time. In these cases, it may be possible to deconvolute the SAXS data of a mixture to obtain the idealized SAXS curves of individual components. Here, we show how this is achieved and the practical analysis of SEC-SAXS data is performed on ideal and difficult samples. Specifically, we show the SEC-SAXS analysis of the vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.

SEC-BioSAXS measurements of biological macromolecules are a standard approach for determining solution structure of macromolecules and their complexes. Here, we analyze SEC-BioSAXS data from two types of commonly encountered SEC traces&#8212;chromatograms with fully resolved and partially resolved peaks. We demonstrate the analysis and deconvolution using scatter and BioXTAS RAW.

EFAデコンボリューションとスキャッタによるSEC-SAXSデータの分析

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and have the potential to influence the sensitization process either through directly stimulating the immune system or altering the biophysical properties of the allergenic protein. In order to control for these variables, techniques are required for the removal of endogenously bound ligands and, if necessary, replacement with lipids of known composition. The cockroach allergen Bla g 1 encloses a large hydrophobic cavity which binds a heterogeneous mixture of endogenous lipids when purified using traditional techniques. Here, we describe a method through which these lipids are removed using reverse-phase HPLC followed by thermal annealing to yield Bla g 1 in either its Apo-form or reloaded with a user-defined mixture of fatty acid or phospholipid cargoes. Coupling this protocol with biochemical assays reveal that fatty acid cargoes significantly alter the thermostability and proteolytic resistance of Bla g 1, with downstream implications for the rate of T-cell epitope generation and allergenicity. These results highlight the importance of lipid removal/reloading protocols such as the one described herein when studying allergens from both recombinant and natural sources. The protocol is generalizable to other allergen families including lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) and Uteroglobin (Fel d 1), providing a valuable tool to study the role of lipids in the allergic response.

This protocol describes the removal of endogenous lipids from allergens, and their replacement with user-specified ligands through reverse-phase HPLC coupled with thermal annealing. 31P-NMR and circular dichroism allow for the rapid confirmation of ligand removal/loading, and the recovery of native allergen structure.

脂質結合タンパク質およびアレルゲンからの内因性リガンドの除去と置換

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...