This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW - Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.

注：AGSは、廃水処理プラントユトレヒト、オランダでNeredaパイロット反応器から回収しました。反応器は、都市下水を供給しました。グラニュール汚泥は59.5ミリリットル/ gでのVSSの汚泥容量指標（SVIの5分）を有していました。汚泥は好気性サイクルの終わりに4月に採取しました。サンプリング後、スラッジを直ちに研究室に輸送篩い分け、使用するまで-20℃で保存しました。 1. EPSの抽出注：4000×gで、20分間4℃で遠心分離粒状汚泥、上清をデカント。抽出のためのペレット中の顆粒を収集します。顆粒の全固形分（TS）及び揮発性固体（VS）は、標準的な方法23によって決定されました。ペレットから直接採取した顆粒の重量 - - 顆粒湿重量との間の変換係数とTSを抽出前に測定しました。すべての抽出は三連で行われました。 注：3グラムのウェットグラムranules各抽出方法のために使用しました。三連で測定され、それらのTSとVSの値（0.39グラムTS 0.34 gでVS）は、抽出収率を計算しました。 <ol><li>遠心分離抽出11 <ol><li>遠心分離管に顆粒の3グラム（湿重量）を転送し、脱イオン水で50mlに遠心チューブを埋めます。 </li><li>少し手で遠心チューブを振ります。 </li><li>遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含有する遠心管。 </li><li> 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。 </li></ol></li><li>超音波処理抽出10 <ol><li>遠心分離管に顆粒の3グラム（湿重量）を転送し、脱イオン水で50mlに遠心チューブを埋めます。 </li><li>混合物に40 Wで2.5分間氷上にパルス状の超音波処理を適用します。 </li><li>遠心分離を遠心20分間の4000×gおよび4℃で混合物を含有するチューブ。 </li><li> 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。 </li></ol></li><li>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の抽出11 <ol><li> 100mlのガラスボトルに顆粒の移送3グラム（湿重量）および2％（w / v）のEDTA溶液で50mlにボトルを埋めます。 </li><li>少し手でボトルを振るし、3時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。 </li><li> 50ミリリットルの遠心分離管に混合物を転送します。 </li><li>遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含有する遠心管。 </li><li> 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。 </li></ol></li><li>ホルムアミド-水酸化ナトリウム抽出（NaOHで）13 <ol><li> 100への顆粒の転送3グラム（湿重量）mlのガラス瓶や脱イオン水で50mlにボトルを埋めます。 </li><li> 0.3ミリリットル99％ホルムアミドを追加します。 </li><li>少し手でボトルを振る、1時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。 </li><li>顆粒懸濁液に20ミリリットル1MのNaOHを追加します。 </li><li>少し手でボトルを振るし、3時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。 </li><li> 2 50ミリリットルの遠心分離管に均等に混合物を転送します。 </li><li>遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含む遠心分離チューブは</li><li> 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。 </li></ol></li><li>ホルムアルデヒド- NaOHを抽出11 <ol><li> 100ミリリットルのガラスボトルに顆粒の転送3グラム（湿重量）と脱イオン水で50mlにボトルを埋めます。 </li><li> 0.3ミリリットル37％ホルムアルデヒドを追加します。 </li><li>少し手とストアによってボトルを振ります1時間4℃で冷蔵庫でそれ。 </li><li>顆粒懸濁液に20ミリリットル1MのNaOHを追加します。 </li><li>少し手でボトルを振るし、3時間、4℃の冷蔵庫に保管してください。 </li><li> 2 50ミリリットルの遠心分離管に均等に混合物を転送します。 </li><li>遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含む遠心分離チューブは</li><li> 、ガラスビーカーに上清を収集し、ペレットを廃棄して、セクション1.7で説明したように、上清を続行します。 </li></ol></li><li>高温-炭酸ナトリウム抽出し（Na 2 CO 3）、9,22,24 <ol><li>予熱150は80°Cまでマグネチックスターラーで1,000ミリリットルのガラス製ビーカーに水道水mLです。 </li><li>フラスコを250mlバッフル内顆粒の転送3グラム（湿重量）と脱イオン水で50mlにフラスコを埋めます。 </li><li> 0.25グラムのNa 2 CO 3、無水または0.67グラムのNa 2 CO 3•10Hを追加<sNa 2 CO 3濃度（w / v）の0.5％を得るために、フラスコにUB&gt; 2 O。 </li><li>水浴に混合物を含むフラスコを置きます。蒸発を防ぐためにアルミホイルで別々にフラスコ、ビーカーガラスを覆います。 </li><li> 400回転および80℃で35分間、混合物を撹拌しました。 </li><li> 50ミリリットルの遠心分離管に混合物を転送します。 </li><li>遠心分離機20分間4,000×gで、4℃で混合物を含有する遠心管。 </li><li>上清を収集し、ペレットを捨てます。 </li></ol></li><li> TSと標準的な方法23に従って、すべての抽出物のVS測定。 <ol><li>上清を取り、千ミリリットル超純水（カットオフ3500ダ分子量（MWCO）で透析バッグ）11,12に対する24時間のためにそれを透析。透析の効果を高めるために、12時間後に透析水を変更します。 </li><li>透析上清（1/3程度）に合理的な割合を転送TSとVS測定23用のアルミ皿。 注：一晩105℃でサンプルを乾燥させます。空のアルミニウム皿および乾燥した試料を含むアルミニウム皿の重量差は、TSコンテンツです。その後、2時間550℃でサンプルを含む同じアルミニウム皿を焼きます。空のアルミニウム皿て燃焼サンプルを含むアルミニウム皿の重量差は灰分です。 TSと灰分との差がVSコンテンツです。 </li><li>各抽出物について、10ミリリットルのガラスビーカーに透析した上清の残留割合を移します。上清中のポリマー濃度を増加させる1〜2 mlの最終容積に60℃で2日間、上清を厚く。 </li></ol></li></ol> 2.アルギン酸のような細胞外ポリマー（ALE）の抽出<ol><li>ステップ1.7.1に従ってステップ1.6.8で得られた抽出液を透析。 </li><li> 250mlのガラスビーカーに透析した抽出物を転送します。スローlyが100rpmで、室温で抽出をかき混ぜます。酸性形態でALEを得るために、2.2±0.05の最終pHに1 M塩酸（HCl）を添加しながら絶えず、pH電極でpHの変化を監視します。 </li><li> 2.2にpHを調整した後、4,000×gで50mlの遠心管遠心に抽出物を転送し、20分間、4°C。 </li><li>上清を捨て、ゲル状のペレットを収集します。ゲル状のペレットは、酸性形態でALEです。 </li><li> pHが8.5になるまで手でガラス棒でゆっくりとゲルを混合しながら、ゆっくりと、ステップ2.4で得られたゲルを、0.5MのNaOH（または0.5 M水酸化カリウム）を追加し、ナトリウム（またはカリウム）ALEの形を得るために。 </li></ol> 3.イオン性ハイドロゲル形成試験注：抽出されたEPSは、イオン性ヒドロゲル形成特性を有していたかどうかを確認するために、 の Ca 2+イオンとビード形成試験は、25を使用しました。 <ol><li>ステップ1.7.3での抽出物の増粘にした後、1〜2ミリリットルの容量は、ゆっくりとガラス棒で混合物を攪拌し、0.5M NaOHで8.5に、そのpHを調整します。 </li><li>ステップ3.1の抽出物またはステップ2.5のナトリウムALEを取り、ゆっくりと2.5％にパスツールピペットでエキスを滴下塩化カルシウム（CaCl 2）溶液（w / v）の。 注：抽出されたEPSプロパティを構成するイオン性ハイドロゲルがある場合、ドロップ状（球状）ビーズが形成されます。抽出されたEPSは、プロパティを形成イオン性ハイドロゲルを持っていない場合、抽出物は、 塩化カルシウム溶液中に分散します。 </li></ol>イオン性ハイドロゲルの4安定性試験注：さらにAGS構造形成におけるイオンEPSヒドロゲルの役割を理解するために、安定性試験はステップ3.2に収集し 、Na 2 CO 3抽出のイオン性ハイドロゲルビーズで行いました。 <ol><li> CaCl 2溶液中で30分間ハイドロゲルビーズを保管してください。 </li><li> CaCl 2からのハイドロゲルビーズを取り出すためにスプーンを使用して</sub&gt;の溶液と、4つの等しい画分にビーズを分割します。 </li><li> 10ミリリットルに保管画分1〜4℃で4時間脱塩水。 1.5 - 抽出法1.3に記載したように以下の安定性試験は、同じ様式で行いました。 </li><li> 4℃で3時間、EDTA溶液（w / v）のストアフラクション2 2 10mlの中で％。 </li><li> 7.15ミリリットルに保管して画分3、4℃で1時間60μlの99％ホルムアミド脱塩水。その後、4℃で3時間、2.85ミリリットルの1M NaOHおよび店舗画分3を追加します。 </li><li> 7.15ミリリットルに保管して画分4 4°Cで1時間60μlの37％ホルムアルデヒド脱塩水。その後、4℃で3時間、2.85ミリリットルの1M NaOHおよび店舗画分4を追加します。 </li><li>ビーズは、抽出条件に耐えるかどうかを評価するために4.6から4.3に記載された条件の下で貯蔵中のビーズの目に見える崩壊があるかどうかを監視。 </li></ol>

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Biotechnol. 188, 130-135 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

プロトコルセクションの備考 EPS / ALEの抽出を50mlの体積および顆粒3gのために記載されています。これらの値は指針として意図されています。高い顆粒濃度の抽出は、抽出されたEPSの収量を減少させることができます。 ALEの抽出中に温度を30分間80℃に一定に維持されるべきです。加熱するために混合するのに必要な時間（約5分）プロトコルに含まれています。また、抽出効率は、フラスコ底部の直径と同じ大きさの磁気撹拌棒を用いて強化されます。これは、EPSの抽出を促進し、良好な混合特性及び粉砕効果をもたらすであろう。 その後プロトコルセクションで、すべての抽出（ステップ1.1から1.6で回収した上清）のTSとVS収率が決定されます。透析は、抽出に使用される化学物質の存在によるエラーの可能性を減少させる前にTSとVS測定を行う必要があります。 A3500ダのMWCOは、透析バッグ内のEPSの高分子を保持しながら、これらの化学物質を除去することをお勧めします。透析バッグは、抽出物の体積よりも大きな体積を有していなければなりません。抽出物の量は、（最大40％の体積増加にEDTAを抽出するため、例えば ）透析中に増加するので、これは、必要です。透析による化学的除去の程度は、前及び透析後のサンプルのpHを測定することによって決定することができます。代替として、透析水の導電率の測定は、イオン除去の程度を示します。 総抽出EPSからALEを得るためには、（1.6ステップ2）透析工程は任意です。それにもかかわらず、透析三の利点を有している：それは沈殿のために必要とされるHClの量を減少させる、その抽出物中の酸性物質移動を向上させ、得られたALEの灰分含有量を減少させます。 ALEの沈殿のためには、extracよりもはるかに大きい容量のガラスビーカーを使用することをお勧めしますトン。 Na 2 CO 3の場合は通常、抽出に過剰投与されています。試料は発泡に、前に透析されなかった場合、最初のNa 2 CO 3と反応する追加のHClを、二酸化炭素の形成をもたらす、抽出物中に放置し。 HClの添加の際に、抽出物は、ビーカーの底部と同じ大きさの磁気撹拌棒を用いてゆっくりと攪拌されるべきです。このサイズと低速攪拌の攪拌棒があっても沈殿物の構造を壊すことなく混合になります。酸性ゲル塊が抽出物中に形成されている場合は、ビーカーを手でわずかに旋回する必要があります。沈殿は、依然として、サンプル中の酸の均一な分布を得ながら抽出物の大量の増加を回避するために、1 Mの酸濃度を用いて行われます。より高い酸濃度は、地域のpH低下と酸性のゲル塊形成をもたらすことができます。 2.0より低いpHは、おそらく構造的な変化に、回収することができるALEの量を減少させます低いpHでのポリマー。 2.20±0.05で、最終pHを維持することが重要です。 制限事項 ALEの抽出方法は、一般に、AGS又はバイオフィルムからEPSの構造細胞外ポリマーを抽出することを目的とし、すべての現在EPSを抽出するように意図されていません。すべてのEPSを抽出するために、複数の抽出方法の組み合わせが必要です。また、ダブル、4人の抽出を適用することにより、VS EPS収量の増加で示すように、一つの抽出は、全ての構造EPSを抽出しません。 ALE抽出は熱とアルカリ条件下で一定の混合を組み合わせ、過酷なEPS抽出法です。この理由のため、いくつかの細胞内物質がEPSと共に抽出されることが可能です。細胞溶解は、物理的および化学的抽出技術（超音波処理31,32、NaOHを31,32、EDTA 11,32、CER 32、熱32及び高せん断速度mだけが原因で発生することができますが19）ixing回収EPSにおける細胞内物質の存在は、まだ検証される必要があります。回収されたEPSは、細胞内物質を分析しなかった含まれているかどうかを抽出したEPSのイオン性ゲル形成性は、この研究の主な焦点です。今後の研究では、抽出されたEPSに細胞内物質を特定することに焦点を当てます。 AGSのヒドロゲルマトリックスを可溶化することは構造的なEPSを抽出することが重要です EPSは、AGSで密でコンパクトなハイドロゲルマトリックスを形成します。 EPSは、それらのすべてではない多糖類、タンパク質、核酸、（リン）脂質、腐植物質および一部の間ポリマー7,5,8、などの有機高分子の様々なクラスが含まれていますが、ゲルを形成します。のみがゲル形成ポリマーは、ここEPSの構造ポリマーとして考えられています。 EPS抽出の目的は、最初のEPSを可溶化するために、次に可溶化EPSを収集することです。構造EPS（ すなわち、トン場合彼）は、ヒドロゲルを形成することAGSのゲルマトリックスを最初に可溶化されなければならない抽出の対象であるEPS。ゲルマトリックスを可溶化することができる唯一の方法は、構造的EPSを抽出することが可能です。本研究では、このような遠心分離10のようないくつかの頻繁に使用されるEPS抽出法- 15、超音波処理10,14,15、EDTA 10 - 12,14,15、ホルムアルデヒド+ NaOHの10から15とホルムアミド+ NaOHの13を効率的に構造的に分離することができませんでしたEPS。これは、好気性顆粒のヒドロゲルマトリックスは、これらの方法によって可溶化されなかったという事実によるものです。このため、セクション4における安定性試験のみEDTA、ホルムアミド+ NaOHおよびホルムアルデヒド+ NaOHを抽出中に存在する条件で実施しました。これらの3回の抽出は、構造EPSを単離することができなかったが、それでものNa 2 CO 3抽出のほかに最高VS EPS収率を得ました。条件OFのNa 2 CO 3抽出は、明らかにAGS行列を可溶化し、この抽出方法として適用されませんでした。したがって、安定性試験の間に適用される条件は、代表的と考えられました。 CERとEPS抽出に関するこれまでの研究では、ここで使用される化学抽出よりも良い結果を得られなかったとして、陽イオン交換樹脂（CER）で抽出し、別の頻繁に使用されるEPS抽出方法は、この比較のために考えられませんでした。 AGSにおけるゲル形成EPS ゲル形成EPSはAGSのヒドロゲルマトリックスの構造EPSとして考えられています。このようなイオン性ゲル、温度によるゲル及びpH誘発性ゲルなどのヒドロゲルの様々な種類があることを指摘する価値があります。本研究では、イオン性ゲルを形成EPSに焦点を当てています。抽出された構造のゲル材料の大部分については、これは支配的な構造上のEPSである可能性が高いです。可能性EPSの他の種類は確かにあります。そのフォームヒドロゲルの異なる種類（ 例えば 、pH誘発されるゲル28）は 、好気性顆粒の同じまたは他のタイプの中に存在します。それにもかかわらず、関係なくヒドロゲルの種類は、EPSゲルマトリックスは、ゲル形成EPSを抽出するための最も重要なステップである可溶化、標的にされていません。 現在、ほとんどの研究は、グラニュール汚泥の構造EPSに行われています。このプロトコルに記載ALE抽出はAGSからゲル形成EPSを抽出することができ、構造的EPSを特徴付けるために、将来の研究に使用されます。さらなる研究は、より良好な造粒及びEPSのプロセスおよび機能を理解するためにAGS、構造的EPSおよび非構造EPSで行われる必要があります。微生物はEPSの正確な組成であり、どのようにEPSの組成物は、環境の変化に応じて変更されているものEPSのような大規模な量を生成する理由：特に以下の3点を検討する必要があります。関連するすべての化合物およびそれらのinteractiの検出と分析アドオンは、バイオフィルムとどのように我々の利点にそれらを使用するを理解するのに役立ちます。

近年では、好気性グラニュール汚泥（AGS）プロセスが正常にいくつかの本格的な下水処理場1で適用された人気の生物学的廃水処理プロセス、となっています。従来の活性汚泥法とは対照的に、AGSが処理中の微生物ではなく、フロック2の顆粒を形成します。これらの顆粒は、より良いsettleabilityを持っている高い有機物負荷率に耐えることができる、と活性汚泥フロック3よりも毒性の高い耐性を有します。 バイオフィルムとは異なり、AGSは、任意の担体材料4の関与なしに自然に形成されています。 6 - AGSでは、バイオフィルムのように、微生物は、それらが自己固定化4である、ヒドロゲルマトリックスを形成するために、高度に水和した細胞外ポリマー物質（EPS）5を大量に生成します。 EPSはphosp（多糖類、タンパク質、核酸からなる、複雑な混合物でありますホ）脂質、腐植物質および一部の間ポリマー5,7,8。これらの高分子物質は、緻密かつコンパクトな三次ネットワーク構造を形成し、静電気力、水素結合、魅力的なイオン力及び/又は生化学的反応、 等 5を介して相互作用します。ヒドロゲル4,9を形成し、第三のネットワーク構造の形成に寄与することが可能であるEPSにおけるポリマーは、構造EPS、合計EPSのサブセットとして考え、この点にあります。 EPSは、化学構造および顆粒5の物理的性質の原因です。各EPS化合物の機能を理解することが重要です。 15 -様々なアプローチがEPS 10を抽出するために適用されます。しかしながら、それらの極端な複雑さのために、単一の方法で、すべてのEPSの成分を抽出することはほとんど不可能です。現在まで、EPS抽出のための方法 &quot;ワンサイズはすべてに適合していない」があります。 20 -抽出方法の選択は、合計金額が、また、回収されたポリマー13,16の組成だけでなく、影響を与えます。汚泥の種類に応じて、関心の異なる方法のEPSが必要とされています。 、ゲル形成ポリマーを抽出し、それらの特性を特徴付けるし、お互いにそれらの相互作用を調査し、非ゲル形成とEPSは好気性グラニュール汚泥形成におけるEPSの役割を明らかにするのに役立ちます。また、ゲル形成ポリマーはまた、工業用途において有用生体高分子です。一つの可能なアプリケーションは、既に紙21の耐水性を高めるためにコーティング材料としてAGSからのゲル形成ポリマーを使用することによって示されました。 したがって、ゲル形成EPSに特異的な抽出方法は、必要とされています。本研究の目的は、AGSからゲル形成EPSを抽出する方法を開発することです。シックス抽出方法10から1頻繁に文献で使用されている5,22は、AGSからEPSを抽出するために選択しました。総量抽出EPSのゲル形成特性は、各方法について比較しました。

<table><tbody><tr><td>250 ml baffled flask</td><td>Kimble</td><td>25630-250</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml glass beaker</td><td>VWR</td><td>213-1128</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic, magnetic stirrer with thermometer</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>sodium carbonate decahydrate</td><td>Merck KGaA</td><td>1063911000</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifugation tubes</td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1 S-R, centrifuge</td><td>Heraeus/Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>hydrochloric acid, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L-GL-D</td><td></td></tr><tr><td>250 ml glass beaker</td><td>VWR</td><td>213-1124</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride dihydrate</td><td>Merck KGaA</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pasteur Pipette</td><td>Copan</td><td>201C</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

EPS抽出 異なるEPS抽出手順を適用した後、顆粒の外観は、図1に示されている。顆粒状、ゲル構造を遠心分離（ 図1a）およびEDTA抽出（ 図1c）の後に無傷でした。顆粒は超音波処理によって、異なるサイズの断片に分割されました。濁度は非常に遠心分離した後に減少したように、液相中の濁度が原因で小さな断片（ 図1b）の懸濁液にある可能性があります。ホルムアミドおよびホルムアルデヒド単独顆粒の形状およびそのゲル構造を変化させることに影響を及ぼさなかった（データは示さず）。 NaOHを添加した後、液相、黄色になりました。いくつかの綿毛状の物質は、顆粒の表面から剥離し、落ち着いた顆粒（ 図1d及び1eの ）の上に層を形成しました。それでも、の形状顆粒は変更されませんでした。 NaOHの添加は、明らかEPS可溶化を改善したが、ゲルマトリックスの構造に損傷を与えることができませんでした。比較では、顆粒は完全のNa 2 CO 3の抽出（ 図1F）の後に姿を消しました。代わりに、ゾル状の液体及び小さなゼリー状粒子の混合物は、実際に可溶化された顆粒のゲルマトリックスを示し、形成されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig1.jpg" /> 図1.好気性グラニュール汚泥のEPS抽出。顆粒上の各抽出法の影響をより見やすくするために、実験を25ミリリットルのガラス瓶中で行いました。抽出操作後、抽出物を浮遊物が沈降することを可能にするために室温で1時間維持しました。 （a）は、遠心分離、抽出、（b）は超音波処理抽出、（c）の EDTA抽出、（d）のホルムアミド- NaOHを余分ction、（e）のホルムアルデヒド-のNaOH抽出、（f）は、高温- 。のNa 2 CO 3の抽出<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54534/54534fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 各方法のVS画分に対するEPSの収率は、 図2に示されている。収量は顆粒 VSグラム初期あたりEPS VS MGに示されています。ホルムアルデヒド+のNaOHにより得られたEPSの量は、ホルムアミド+のNaOHおよびNa 2 CO 3 +熱+混合、遠心分離、超音波処理及びEDTA抽出よりも高かったです。アルカリ性条件は、EPS溶解26,27を強化することを示す13,15 -これらの抽出技術についての同様の結果は、以前の研究11で示されました。 Na 2 CO 3によって回収されたEPSの量<html>唯一の遠心分離により得られたものの20倍以上、最高でした。さらに、 の Na 2 CO 3抽出の合計EPS収率はさらに、複数の抽出によって増強することができます。最初の抽出のステップ1.6.8（プロトコルセクション）で廃棄されたペレットを用いて第2の抽出は、四重抽出があっても46％、総収量を増加し、28％の合計収率が増加しました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig2.jpg" /> 図VS収率および灰分に対するすべての抽出方法の2。結果。それぞれについては、最初のバーは顆粒 VSグラムの初期mg当たりVS EPSにおけるVS収率を表し抽出。第二のバーは、抽出されたTS中の灰分の重量百分率を表します。エラーバーは、各抽出技術に行った3回の抽出の標準偏差を示します。&quot;_blank&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 アルギン酸塩のような細胞外ポリマー（ALE）の抽出 Na 2 CO 3抽出によって抽出されたEPSのpHを2.2に調整した後、合計VSの63％を沈殿させました。沈殿物は、酸性ALE 25です。残留画分を抽出条件の下で可溶化することができる可能性が高いEPSだったが、pHは2.2で沈殿物を形成することはできません。 イオン性ヒドロゲル形成試験 好気性顆粒はヒドロゲルと類似していると記載されています。造粒工程は、ゲル化剤4,9,25,28などの配糖体でゲル形成現象と考えられてきました。通常は、Ca 2+が排水中の最も一般的なカチオンの一つです。また、それは容易に酸性多糖類と結合する（ 例えば、おそらく、対イオンとしてのアルギネートおよびポリガラクツロン酸）、ゲル29を媒介します。こうしてイオン架橋ヒドロゲルが得られます。それは、Ca 2+イオンの添加は、好気性汚泥造粒30を加速することができることが観察されました。したがって、のCa 2+ -EPS（イオン性ヒドロゲル）は、好気性粒状スラッジ中のゲルマトリックス構造を構築する上で重要な役割を果たすことができます。この点において、抽出されたEPSかを抽出したEPSは、好気性粒状スラッジ9中のゲルマトリックスの形成に寄与し、構造ポリマーであるかどうかを確認するためのテストとして使用できるのCa 2+イオンとのイオン性ヒドロゲルを形成します。 本研究では、様々な方法によってAGS（ 図3a）から抽出されたEPSのために、のNa 2 CO 3で抽出された唯一のEPSは（w / v）の塩化カルシウム溶液中2.5％液滴の形状を保持し、安定したイオン性ハイドロゲルビーズを形成しました。また、このから得られたナトリウムALEは、追加のステップ（ALEポリマー抽出、 図3b）も同様に同じプロパティを表示することによりEPS。 Ca 2+ -ALEゲルビーズ（ 図3c）の色と形態は、好気性粒状スラッジ（ 図3a）に似ています。どうやら、のNa 2 CO 3の方法により抽出されたEPSは、好気性粒状スラッジ中のゲルマトリックスの形成に寄与する。このEPSの主成分であるALEは、イオン性のヒドロゲルを形成することができる構造のポリマーです。 イオン性ハイドロゲルの安定性試験 これは、EPSの抽出の間、好気性顆粒EDTA、ホルムアルデヒド+ NaOHおよびホルムアミド+ NaOHを（ 図1）にその球状の形状を維持することが観察されました。抽出された構造ポリマーが顆粒の安定性に役割を果たしている場合に理解するために、 の Ca 2+ -ALEビーズがありました抽出中に好気性顆粒とまったく同じように扱わ。興味深いことに、のCa 2+ -ALEビーズはAGSのものと同様の安定性を示した（ 図3d - 3F）、 すなわち 、のCa 2+ -ALEビーズはEDTAで非常に安定していました。 Ca 2+ -ALEビーズは、ホルムアルデヒド+ NaOHおよびホルムアミド中に浸漬されていたときのCaの表面から離脱し、ALEの少量2+ -ALEビーズ（ 図3Eに小さな茶色がかったフロックと3fが ）3時間+ NaOHであったが、 、それぞれ。 Ca 2+ -ALEビーズと好気性顆粒間の安定性の点で、この類似性は、ALEはAGSゲルマトリックスを形成する重要な構造ポリマーの一部であることを示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig3.jpg" /> 図3.好気性顆粒およびALEを抽出した。（a） の脱塩水PRに顆粒をIOR抽出。 4,000×gで遠心分離し、20分間4°Cの後（段落1.6および2に従って抽出）（b）の酸性ALE。イオン性ハイドロゲルの安定性試験の結果。 （C） の Ca 2+ -ALEビーズは4℃で4時間脱イオン水中に保存しました。 （D） の Ca 2+ -ALEビーズは、4℃で3時間、2％EDTAに格納されています。 （E） の Ca 2+ -ALEビーズは4℃で4時間のNaOH +ホルムアミドに格納されています。 （f）は 4°Cで4時間ホルムアルデヒド+ NaOH中に保存された Ca 2+ -ALEビーズを。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54534/54534fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

プロトコルは、アルギン酸塩のような細胞外ポリマー（ALE）を抽出するために、好気性粒状汚泥を可溶化するための方法論を提供します。

好気性グラニュール汚泥からの構造細胞外高分子物質の抽出

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

22.5K ビュー.  Delft University of Technology. プロトコルは、アルギン酸塩のような細胞外ポリマー（ALE）を抽出するために、好気性粒状汚泥を可溶化するための方法論を提供します。 

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

環境学

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

上向流嫌気性スラッジブランケット炉内の海洋堆積物やトリクロロエチレンの削減からSulfidogenic汚泥の開発

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから<em&gt; Lysinibacillusスフェリカス</em&gt; JG-B53 - 生体分子金属研究のためのツールと​​して、QCM-D、ICP-MSおよびAFM

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

化学

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

生化学

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

生物工学

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

多様な微生物群集の高密度栽培のための新しいバイオリアクター

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

<meta charset="utf8"></head><body>メタン栄養生物ニッチのモデリング – グラジエントシリンジモデルエコシステム

Agarose-Based Model Ecosystem for Cultivating Methanotrophs in a Methane-Oxygen Counter Gradient

Aerobic methane-oxidizing bacteria, known as methanotrophs, serve important roles in biogeochemical cycling. Methanotrophs occupy a specific environmental niche within methane-oxygen counter gradients found in soils and sediments, which influences their behavior on an individual and community level. However, conventional methods to study the physiology of these greenhouse gas-mitigating microorganisms often use homogeneous planktonic cultures, which do not accurately represent the spatial and chemical gradients found in the environment. This hinders scientists' understanding of how these bacteria behave in situ. Here, a simple, inexpensive model ecosystem called the gradient syringe is described, which uses semi-solid agarose to recreate the steep methane-oxygen counter gradients characteristic of methanotrophs' natural habitats. The gradient syringe allows for the cultivation of methanotrophic strains and the enrichment of mixed methane-oxidizing consortia from environmental samples, revealing phenotypes only visible in this spatially resolved context. This protocol also reports various biochemical assays that have been modified to be compatible with the semi-solid agarose matrix, which may be valuable to researchers culturing microorganisms within other agarose-based systems.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:実験室でメタン酸化細菌を増殖させるためのシンプルで安価な技術の設計

A protocol is described for preparing a simple model ecosystem that recreates the methane-oxygen counter gradient found in the natural habitat of aerobic methane-oxidizing bacteria, enabling the study of their physiology in a spatially resolved context. Modifications to common biochemical assays for use with the agarose-based model ecosystem are also described.

メタン-酸素カウンターグラジエントにおけるメタン栄養生物の培養のためのアガロースベースモデル生態系

Aerobic methane-oxidizing bacteria, known as methanotrophs, serve important roles in biogeochemical cycling. Methanotrophs occupy a specific environmental ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

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好気性グラニュール汚泥からの構造細胞外高分子物質の抽出

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