この作品は、エネルギーバイオサイエンス研究所の助成金OO0G01によって賄われていた。

オリンプメソッドはglycosylhydrolaseとしてエンドグルカナーゼを用いて、双子葉植物、キシログルカンの細胞壁に存在する主要なヘミセルロースに例示される。方法は、植物組織の源としての全体シロイヌナズナ実生を用いて実証されています。酵素と細胞外マトリックス材料は、同じ手順を用いて所望の分析に応じて置換することができます。 1。細胞壁の分離<ol><li>収穫5人が、5日齢全体シロイヌナズナの苗や、ご希望の材料の相当額と1.5mlの反応管に移す。材料は、チューブの底部に配置されていることを確認します。 </li><li>液体窒素でのサンプルとスナップ凍結の上に反応管に2つ3ミリメートルの金属のボールを追加。 </li><li>ボールミル（2:30分、25Hzの）を使用して凍結サンプルを挽く。 </li><li>サンプルに1mLの70％水性エタノールを加えます。磁石を用いて金属球を取り外します。徹底的にボルテックス。 </li><li>ペレットに10分細胞壁物質を含有するアルコール不溶性残渣を14,000 rpmでサンプルを遠心分離します。 </li><li>慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。 </li><li>クロロホルム/メタノール（1:1 v / v）溶液1mLの追加。ペレットを再懸濁させる徹底的にボルテックス。 </li><li> 10分間14,000 rpmでサンプルを遠心し、慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。 </li><li>コンセントレータを使用してサンプルを乾燥させる。 </li></ol> 2。オリゴ糖の可溶化<ol><li>可溶化のために、そのオリゴ糖の形で特定の多糖類は、適切なバッファーの25μlのに乾燥したペレットを再懸濁します。エンドグルカナーゼ50mmのギ酸アンモニウム、pH4.5の場合は、使用されています。エンドグルカナーゼの0.2Uを追加。ダウン渦サスペンションとスピン液体。 </li><li> 37℃で16時間サンプルをインキュベート° Cのインキュベーターで、300rpmで振盪。 </li><li>コンセントレータを使用してダイジェスト（水）の溶剤を削除します。 </li></ol> 3。放出オリゴ糖のMALDI - TOF分析<ol><li> BioRex MSZ 501陽イオン交換樹脂ビーズは、消化サンプルから塩と酵素を除去するために使用されています。空のカラムに一定量を配置し、多量の水でビーズを洗浄することにより条件ビーズを。 </li><li>消化し、乾燥サンプルに5〜10 BioRexビーズを追加。その後、水の材料の5μlの少量を使用することができるために、10μlの水を加えます。簡単にチューブを回転させて、溶液中のビーズを浸す。室温で少なくとも10分間インキュベートする。 </li><li> MALDIターゲットプレートにスポット2μlのマトリックス（2,5 - ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、水で10mg/ml）。均一なマトリックスの化学物質の結晶につながる真空下で溶媒マトリックスを蒸発させる。 </li><li>ターゲットプレート上にマトリックスの結晶の上に脱塩試料溶液のスポット2μlの。 あなたが多数のサンプルを発見する場合のみ3分の最高のためにスポッティング続ける。この時間枠は、最初に斑点を付けられたサンプルがまだ乾燥していないことを保証します。最後の斑点のあるサンプルに再溶解し、マトリックスとサンプル糖鎖分子の完全な混合を確実にするために追加の2分間待ちます。その後、真空下でターゲットプレートを乾燥させる。 サンプル/マトリックス混合は、均質な結晶化を有効にするために1分も経たないうちに結晶化する必要があります。 </li><li> MALDI - TOF質量分析計への場所のターゲットプレート。マシンは、20000Vと350nmの遅延の加速電圧と正のリフレクトロンモードに設定する必要があり、選択されている質量範囲500から3000ダ（予想されるオリゴマーに依存して変更される可能性がある）はずです。レーザーを発射起動し、代表的な平均のスペクトル（図2A）を生成するためにコンパイルされているサンプル当たり100から200のスペクトルを、収集する。特定のオリゴ糖を表すイオンが電荷（m / z）比を、その質量によって識別することができます。関心のあるすべてのイオンのイオン強度（ピーク高さ）サンプル中の各オリゴ糖の相対量（図2B）、結果として100％まで追加する必要があります。 </li></ol> （4） その場オリンプの分析では オリンプは、任意の壁の準備手順を省略する組織に直接使用することができます。例として、植物組織の源としてシロイヌナズナの黄化胚軸が使用されます。再び、エンドグルカナーゼは、ヘミセルロースのキシログルカンの構造を決定するために使用されます。酵素と組織の材料は、同じ手順を用いて所望の分析に応じて置換することができます。 <ol><li>黄化苗を収穫し、空のMALDIターゲットプレート上に置き、苗を乾燥させて。 </li><li>所望の位置に乾燥させた苗を0.5μlエンドグルカナーゼを（50mmのギ酸アンモニウムに溶解0.4U/μl、、pH4.5）を追加します。酵素の低下が部分的にターゲットプレートに触れていることを確認してください。 </li><li>その酵素ドロップが乾燥を避けるために、飽和湿度で密閉容器にMALDIターゲットプレートを置きます。 1のチャンバー内にプレートをインキュベート37 6H℃、 </li><li>植物組織および真空下で酵素のドロップとMALDIターゲットプレートを乾燥させます。 </li><li>各乾燥酵素のスポットの上に、0.5μlの行列を（10mgの/ L DHB）を追加します。それが2分間放置する。 </li><li>真空下MALDIターゲットプレートを乾燥させます。 </li><li> MALDI - TOFのサンプルを分析する。 MALDI - TOF質量分析計への組織および酵素/マトリックススポット（複数可）でターゲット板を配置。マシンは、20000Vと350nmの遅延の加速電圧と正のリフレクトロンモードに設定する必要があり、選択されている質量範囲500から3000ダ（予想されるオリゴマーに依存して変更される可能性がある）はずです。 </li><li>組織へNEXTマトリックス/試料結​​晶にレーザーを発射開始。あなたのような分子のフライトの時はoffとなるような場合には、組織自体に該当していないことを確認してください。代表的な平均のスペクトル（図3）を生成するためにコンパイルされているスポット、当たり20から50前後のスペクトルを収集する。特定のオリゴ糖を表すイオンが電荷（m / z）比を、その質量によって識別することができます。イオン強度（イオンの高さ）が報告することができ、関心のすべてのイオンは試料中の各オリゴ糖の相対量で、その結果100％まで追加する必要があります。 </li></ol> 5。代表的な結果 シロイヌナズナ実生におけるヘミセルロースのキシログルカンの存在のオリンプ分析の例を図2に示されています。イオンの質量差と知られて十分に特徴付けられた酵素（エンドグルカナーゼ）特異性に起因するイオンは、特定のオリゴ糖の構造（図2A）に割り当てることができます。明らかに、構造異性体を区​​別することができます。様々なオリゴ糖の相対量の決定のための基本的な前提は、（図2B）、その質量分析の応答係数は、それらのオリゴ糖のために非常に似ていることです。ここに示すように、オリンプ定量化は非常に再現性です。しかし、メソッドの堅牢性は、様々なオリゴ糖のイオン対雑音比信号に大きく依存していることに注意してください。例えば塩またはオリゴ糖のより少量の混入は、その比率を減らすことができます。 組織自体のオリンプ分析は、（その場分析で）非常に小さいと定義されている領域の研究を可能にし、非常に少ないサンプル調製を含む。例では、定性的（同じイオン）（図3）ここで紹介しませんが、定量的な違いは、（イオン強度のばらつき） シロイヌナズナ実生の茎と根組織の間で観察された。オリンプ法の順列は、このように組織、&quot;イメージング&quot;につながる可能性があります。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="図1" /> 図1植物源として全体シロイヌナズナの苗を使用してオリンプ手順のフローチャート。最初に、組織が ​​漬けられ、細胞壁の材料は（写真は藤野らから変更。10）用意されています。その後、特定の壁の多糖類のオリゴ糖は、特定の加水分解酵素を使用して解放されています。最後に、水溶性オリゴ糖の相対的存在量をMALDI - TOF質量分析法を用いて決定されます。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。オリンプにより決定されたシロイヌナズナから黄化実生におけるキシログルカンのオリゴ糖の相対的な量。 A）代表キシログルカンオリゴ糖質量スペクトルを、それぞれのイオンは、特定の糖鎖構造を表し、構造異性体を区​​別することができます。相対的なオリゴ糖豊富な測定のためのB）対応するバーの図。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。例として、 シロイヌナズナの黄化実生を用いてその場オリンプの分析では 。それぞれの酵素/消化液滴（色付きの丸）が独立して分析することができ、対応するマススペクトルが得られ、分析することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="図4" /> キシラナーゼ（Megazyme）とススキの葉の材料を消化し ​​て得られたヘミセルロースのキシランの図4。オリンプスペクトル。

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	<li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting.">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides.">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li><li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis.">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li><li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls.">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xyloglucan-specific+endo-beta-1,4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus:+expression+cloning+in+yeast,+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme.">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li><li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa:+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides.">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li><li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis.">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li><li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis.">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation:+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations.">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1,2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides.">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity.">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li><li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana.">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li><li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils,+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl.">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li><li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1.">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li><li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan,+a+major+primary+cell+wall+component.">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li><li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+liquid+chromatography,+capillary+electrophoresis,+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants.">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するオリンプ方法は、細胞外マトリックスに存在するポリマーの非常に敏感かつ迅速な分析が可能になります。オリンプは、後続のMALDI - TOF分析とオリゴマーの酵素的放出を兼ね備えています。 MALDI - TOFスペクトルの生成は、1分未満を受け取り、それ故にオリンプは、このような変異体の画面のようなハイスループット試験を含む広範囲のアプリケーションに適しています。オリンプは、植物の多糖類に限定されるものではなく、潜在的にのみ特異的加水分解酵素の利用可能性によって制限ポリマー、の広い範囲に適用することができます。しかし、オリンプの制限は、ポリマーの絶対的な豊かさが得られないということです。 オリンプが種の多様性の細胞外マトリックスに存在する多糖類の様々の構造を研究するために使用する前に、前述のとおり。例として、図4は、草種の主要なヘミセルロース、キシランのオリンプスペクトルを表しています。ここでは、温帯草ススキ由来の細胞壁の材料は、キシラナーゼを用いて消化した。

<table><tbody><tr><td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10mg/mL in water</td></tr><tr><td>BioRex MSZ 501(D) Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>Endoglucanase</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Xylanase M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>3mm metal balls</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>Beat mill</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>MALDI target plate</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

oligo mass profiling (olimp) of extracellular polysaccharides

環境への細胞の直接接触は、細胞外マトリックスによって多くの生物に仲介されている。細胞外マトリックスの一つの一般的な側面は、彼らは複雑な糖の糖タンパク質の形で部分、プロテオグリカン、および/または多糖類を含んでいるということです。例としては、繊維状のタンパク質およびプロテオグリカンや植物と菌類の多糖類ベースの細胞壁を主とする人間と動物細胞の細胞外マトリックス、プロテオグリカン/細菌の糖脂質ベースの細胞壁が含まれています。すべてのこれらのglycostructuresは、細胞間および細胞 - 環境コミュニケーションとシグナル伝達において重要な役割を果たしている。 細胞外マトリックスの異常な複雑な例では、高等植物の細胞壁に存在しています。その壁は、最大75％乾燥重量に、糖からほとんど完全に成って、そしてこの地球上に存在する最も豊富に存在する生体高分子から構成されています。したがって、研究は化石燃料から得られる石油化学製品を置き換えるために、カーボンニュートラルな再生可能資源として最適なこれらの材料を活用する方法を実施しています。燃料転換のための主な課題は、このユニークなbiocompositeに存在するユニークなglycostructuresによる酵素的または化学的劣化に壁の反抗のまま。 ここで、我々は、植物細胞壁のglycostructuresの迅速かつ高感度分析法を提示する。このメソッドオリゴマスプロファイリング（オリンプは）特定のglycosylhydrolasesとマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MSを用いて可溶化したオリゴ糖混合物のその後の分析を容易にする壁材料からのオリゴ糖の酵素のリリースをベースにしています1）（図1）。オリンプは、完全な分析のためにのみ5000細胞の壁は、組織自体が2で実行できる必要があり、ハイスループット分析3に従順です。可溶化されたオリゴ糖の絶対量がオリンプによって決定することはできませんが、様々なオリゴ糖のイオンの相対量は、壁に存在する天然多糖の置換パターンについての洞察を与えるマススペクトルから線引きすることができます。 オリンプは、特定の酵素4の可用性によって制限壁ポリマー、多種多様な分析をするために使用することができます。例えば、植物細胞壁の酵素に存在するポリマーの分析のためにエンド -β-（1-4）-キシラナーゼ6,7を使用してキシログルカナーゼ5、11、12、13、キシランを用いたヘミセルロースのキシログルカンを分析するために用意されています、またはポリガラクツロナーゼおよびメチルエステラーゼ8の組み合わせを使用して、ペクチン多糖類のため。さらに、オリンプglycosylhydrolaseとさえ糖転移酵素活性のと同じ原理を使用しては監視し、9を決定することができます。

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OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

迅速な方法は、細胞外マトリックス中の多糖類の構造についての洞察を得るために説明されています。方法はglycosylhydrolasesの特異性と材料の微量を分析できるように質量分析の感度を利用しています。この手法は、組織自体に直接使用するための適応です。

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

13.6K ビュー.  University of California, Berkeley. 迅速な方法は、細胞外マトリックス中の多糖類の構造についての洞察を得るために説明されています。方法はglycosylhydrolasesの特異性と材料の微量を分析できるように質量分析の感度を利用しています。この手法は、組織自体に直接使用するための適応です。

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Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

化学

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). Using proteomics, we have previously identified more than 150 ECM and ECM-associated proteins in cardiovascular tissues. Notably, many ECM proteins are glycosylated. This post-translational modification affects protein folding, solubility, binding, and degradation. We have developed a sequential extraction and enrichment method for ECM proteins that is compatible with the subsequent liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of intact glycopeptides. The strategy is based on sequential incubations with NaCl, SDS for tissue decellularization, and guanidine hydrochloride for the solubilization of ECM proteins. Recent advances in LC-MS/MS include fragmentation methods, such as combinations of higher-energy collision dissociation (HCD) and electron transfer dissociation (ETD), which allow for the direct compositional analysis of glycopeptides of ECM proteins. In the present paper, we describe a method to prepare the ECM from tissue samples. The method not only allows for protein profiling but also the assessment and characterization of glycosylation by MS analysis.

This paper describes a methodology to prepare cardiovascular tissue samples for MS analysis that allows for (1) the analysis of ECM protein composition, (2) the identification of glycosylation sites, and (3) the compositional characterization of glycan forms. This methodology can be applied, with minor modifications, to the study of the ECM in other tissues.

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

生化学

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

免疫・感染学

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

生物学

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

要約

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この動画の章

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

マンナンペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

要約

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外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

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N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

マンナンペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析