Name: intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles and fluorescent microbeads into the neonatal brain
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
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The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Animal Care Committee von Hamamatsu Universität School of Medicine zugelassen. 1. Herstellung von MCMV (Smith-Stamm) und rekombinante M32-enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) -MCMV <ol><li> Erzeugen rekombinante M32-EGFP-MCMV gemäß dem Verfahren wie folgt (1,2-1,9) und wie zuvor 8 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie abgeleitete rekombinante Viren aus dem Smith-Stamm von Wildtyp MCMV (Zugangsnummer: U68299). Insert EGFP (4361 Basenpaare; bp) zwischen 37.089 und 41.450 bp (M32 - M31 Locus) im MCMV Genom durch homologe Rekombination. </li><li> Amplify durch Polymerase - Kettenreaktion , die MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, links flankierende Sequenz und M31 (37.089 - 39.246 bp rechten flankierenden Sequenz Genorte unter Verwendung der folgenden Primer: M32, 5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(Vorwärts - Primer), 5 &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(Reverse - Primer); M31, 5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39; (Vorwärts - Primer), 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(Reverse - Primer). </li><li> Legen Sie die M32 - Locus in den EGFP-exprimierenden Vektor mit NheI und BamHI Restriktionsstellen. Legen Sie die M31 - Locus in die M32-EGFP -recombinant mit AflII und XbaI - Stellen Plasmid. Spalten die M32 - EGFP - M31 - Sequenz mit NheI und AflII vom M32 - EGFP - M31 Rekombinationsplasmid und lösen sich in H 2 O. </li><li> Transfizieren das gespaltene Konstrukt in die Kerne von MCMV (Smith-Stamm) infizierten NIH3T3-Zellen 24 Stunden nach der Infektion (hpi) ein Elektroporationssystem mit homologe Rekombination zu induzieren. </li><li> Bei 3 Tage nach Infektion, Co-Kultur die Zellen mit nicht-infizierten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) in einem Verhältnis von 1 / 1.000 in Platten mit sechs Vertiefungen und Bildschirm für EGFP-exprimierenden Foci von infizierten Zellen. </li><li> Harvest die virushaltigen Überstände aus den Vertiefungen grün fluoreszierenden Foci enthält, und das Zehnfache verdünnt. Zur Reinigung wählen Vertiefungen, die einzelne grüne fluoreszierende Foci anzuzeigen. </li><li> Wenn alle von der Grenzverdünnung Infektion Anzeige EGFP-Expression resultierenden Brennpunkten ist das Viruspräparat rein, was darauf hinweist, dass keine Wildtyp-Virus bleibt. Quantifizierung des Virus durch den Plaque-Assay - Verfahren , wie zuvor beschrieben 17. </li><li> Behandeln Sie MCMV in zertifizierten biologischen Sicherheit Schränke auf Biosicherheitsstufe 2 Handschuhe und Maske tragen. </li><li> Passage MCMV (Smith - Stamm) und rekombinantem MCMV in MEFs , hergestellt aus 12 Tage alten ICR - Mäuseembryos , wie zuvor beschrieben 17. </li><li> Entfernen Zellen aus den Überständen von infizierten MEF Kulturen durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 20 min bei 16 ° C. </li><li> Ultracentrifuge die Überstände für 40 Minuten bei 70.000 × g. Resuspendieren der Pellets Virionen in 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung und Transfer auf eine vorgeformten linearen s enthältOrbitol Gradienten (25% - 70%). Ultracentrifuge wieder bei 70.000 x g für 60 min 18. </li><li> Ernten Sie die Virion haltige Band mit einer Spritze. Pellet die geernteten Virionen durch einen zusätzlichen Ultrazentrifugationsschritt bei 70.000 × g für 40 min. </li><li> Das Pellet in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und bei -80 ° C, bis die Infektionsversuche. </li><li> Quantifizierung der Virustiter durch den Plaque-Assay - Verfahren , wie zuvor beschrieben 19. </li><li> Visualisieren der EGFP - Expression der rekombinanten MCMV Teilchen (Anregung bei 489 nm, Emission bei 508 nm) durch Fluoreszenzmikroskopie (1A) und der Partikelstruktur durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 8 (1B). </li></ol> 2. Herstellung von Nile Red Fluorescent Microbeads <ol><li> Kauf Carboxy fluoreszierende Nil rot Mikrokügelchen und legen 500 ul Mikrokügelchen in die Rohre zu Durchmesser nach (0,04- 0,06 &amp; mgr; m, etwa 3,63 × 10 12 Partikel; 0,1-0,3 &amp; mgr; m, etwa 5,75 × 10 10 Partikel; und 1,7 bis 2,2 &amp; mgr; m, etwa 6,85 × 10 7 Teilchen). </li><li> Behandeln Sie Perlen mit 500 ul 0,1 M NaOH für circa 1 Tag keine Endotoxine zu entfernen und die Perlen in sterilem Wasser bei RT resuspendieren. </li><li> Adsorbieren die Perlen O / N mit 10% Mausserum von C57BL / 6-Mäusen bei RT vor erhalten zu verwenden. </li><li> Zur Trennung Aggregate, die Perlen Wirbel und beschallen gründlich vor dem Gebrauch. </li></ol> 3. ICV Injektion von MCMV und Fluorescent Microbeads in Neonatal Mäuse <ol><li> Pflegen normalen schwangeren ICR-Mäuse in einer temperaturgesteuerten Anlage unter einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Die Neugeborenen werden als P 0,5 am Tag der Geburt bezeichnet. </li><li> Sterilisieren eine 10-ul-Spritze und einer 27 G-Nadel mit 70% Alkohol. </li><li> Laden Sie die Injektionslösung (5 ul), die MCMV oder fluoreszierende MikroPerlen in die Nadel durch vorsichtiges den Kolben der Spritze gezogen wird. </li><li> Verhalt neonatalen Maus (P 0.5), indem Sie die Maus für 3 auf Eis setzen - 4 min. Sobald das Tier unter Narkose ist, verwenden Sie die Zehen Prise Antwortverfahren der Narkosetiefe zu bestimmen. </li><li> Mark die Injektionsstelle mit einem nicht-toxischen Labor Stift an einer Stelle etwa 0,7 bis 1,0 mm zu der sagittalen Naht lateral und 0,7 bis 1,0 mm caudal von der neonatalen Bregma (2A). </li><li> Die Nadel 2 mm tief, senkrecht zu der Schädeloberfläche an der markierten Injektionsstelle. Als Referenz markieren 2 mm von der Spitze der Nadel mit einem nicht-toxischen Hersteller. </li><li> Injizieren langsam 5 ul MCMV (etwa 5 × 10 5 PFU) in den lateralen Ventrikel ohne die Kopfhaut (2B) zu öffnen. </li><li> In einer anderen Gruppe von Mäusen, injizieren eine 5 ul Lösung fluoreszierende Mikrokügelchen , die (0,1-0,3 &amp; mgr; m, etwa 5,75 × 10 8 Teilchen) durchdie gleiche Methode. </li><li> 20 Sekunden nach der Kolbenbewegung Rückfluss zu verhindern Absetzen - langsam die 10 Nadel entfernen. </li><li> Wiederherzustellen, halten Sie die Mäuse 5 - 10 min in einem warmen Behälter, bis Bewegung und allgemeine Reaktions wiederhergestellt werden. </li><li> Ernten Sie die Gehirne, wie in Abschnitt 5 in einem Bereich von Zeitpunkten beschrieben (3, 12, 24, 48 und 72 h) nach der Injektion. </li></ol> 4. IV Injektion von MCMV oder Fluorescent Microbeads in Neonatal Mäuse <ol><li> Verhalt neonatalen Maus (P 0.5), indem Sie die Maus für 3 auf Eis setzen - 4 min. </li><li> Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 35 G-Nadel die intravenöse Injektion von MCMV in P 0,5 Neugeborenen durchzuführen. </li><li> Verwenden Sie einen Transilluminator (Vene Finder) die oberflächliche zeitliche (Gesichts-) Vene sichtbar zu machen. Vor der Injektion sichern die Neugeborener auf die Transilluminator chirurgischen Band (2C). </li><li> Während Lupen tragen (1.5X), ziehen lassen langsam 50 ul MCMV (etwa 5,45 ×; 10 9 Partikel) oder fluoreszierende Mikrokügelchen (0,04 bis 0,06 &amp; mgr; m, etwa 3,63 × 10 11 Partikel; 0,1-0,3 &amp; mgr; m, etwa 5,75 × 10 9 Partikel und 1,7 bis 2,2 &amp; mgr; m, etwa 6,85 × 10 6 Teilchen) in die oberflächliche zeitliche Vene (2D). </li><li> Nachdem die Nadel entfernt haben, verwenden Gaze 70% Alkohol enthält, Druck auf die Injektionsstelle zu gelten, bis die Blutung aufhört. </li><li> Geben dem neonate etwa 5 min in einen warmen Behälter, bevor es in den Käfig zurückkehrt zu erholen. </li><li> Ernten Sie die Gehirne, wie in Abschnitt 5 in einem Bereich von Zeitpunkten beschrieben (3, 12, 24 und 72 Stunden) nach der Injektion. </li></ol> 5. Gehirngewebe Probenvorbereitung für die Paraffinschnitte <ol><li> Legen Sie die injizierten Neugeborenen in einem kleinen Plastikschale auf zerstoßenem Eis. </li><li> Sobald das Tier unter Narkose ist, verwenden Sie die Zehen Prise Antwortverfahren die Tiefe der anesthes zu bestimmenia. </li><li> Machen Sie eine zentrale oder zwei Ende horizontal Ende schneidet durch den Brustkorb der Brusthöhle zu öffnen. </li><li> Machen Sie einen Schnitt in das Atrium mit einer scharfen Schere. 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in das Atrium ziehen lassen. Stopp-Perfusion, wenn spontane Bewegung (PFA Tanz) und aufgehellt Farbe der Leber beobachtet. Nicht exsanguinate. </li><li> Präparieren Sie die Neugeborenen (wie zuvor 20 beschrieben) , indem Sie zuerst den Kopf Entfernen einer Schere. </li><li> Machen Sie einen Mittelschnitt entlang der integument vom Hals an der Nase, den Schädel zu belichten. </li><li> Legen Sie das scharfe Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum auf der einen Seite, vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels schieben. </li><li> Machen Sie einen Schnitt an der distalen Kante der hinteren Schädeloberfläche erstreckt, und stellen Sie einen identischen Schnitt auf der Gegenseite. Deaktivieren Sie den Schädel um das Cerebellum entfernt. </li><li> Ziehen Sie vorsichtig den Schädel auf einer Seite zu verhindern Schädigung des Gehirns zurück. Wiederholen Sie diesen VorgangVerfahren auf der anderen Seite des Gehirns. </li><li> Mit einem Spatel, trennen die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns. </li><li> mit einer Schere, und entfernen Sie das Gehirn vorsichtig trennen das Gehirn aus dem Kopf, jede dura Trimmen, die noch das Gehirn an den Schädel zu verbinden. </li><li> Platzieren das Gehirn in einer Phiole Fixiermittel, enthaltend 4% PFA mindestens 10-mal das Volumen des Gehirns für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Dehydratisieren, um das Gewebe durch eine Reihe von abgestuften Ethanolbädern, das Wasser zu verdrängen, und dann mit Paraffinwachs infiltrieren, einen Block zu bilden. Schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Mikrotom in Scheiben 4 um dicke 21. </li><li> Entparaffinieren und Rehydrierung die Folien der infizierten Gehirne 22. Fahren Sie mit in - situ - Hybridisierung für Paraffin eingebettete Schnitte. </li></ol> 6. Gehirngewebe Probenvorbereitung für die Gefrierschnitte <ol><li> Entfernen Sie das Gehirn nach den beschriebenen Schritten in 5,1-5,11. </li><li> Um die fluoreszierenden Mikrokügelchen und M32-EGFP-MCMV, legen Sie das reseziert Gehirn auf flachem Boden cryomolds beobachten. In Einbettmedium vollständig die Gehirnprobe abzudecken. Schnapp gefrieren die cryomolds in vorgekühltem n - Hexan (-80 ° C), einer Pinzette den Rand der cryomolds es dem Futter zu befestigen vor zu halten. </li><li> Für sectioning, das gefrorene Gewebeblock auf dem vorgekühlten Kryostaten Futter befestigen. Übertragen Sie das gefrorene Gewebe mit dem Futter in einer Kryostatkammer und Absenken der Temperatur auf zwischen -10 und -20 ° C, und die Scheiben ca. 8 - 10 &amp; mgr; m dick 23. </li><li> Fixieren die Abschnitte mit cytofixative (Gemisch aus Isopropylalkohol und Polyethylenglykol) durch Aufsprühen. Luft trocknen die Abschnitte für 30 min bei RT sofort nach dem Spritzen und lagern Sie sie bei - 80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Äquilibrieren die Abschnitte auf RT zurück und waschen dreimal mit PBS. </li><li> Beflecken die Abschnitte mit Fluorescein - Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem Griffonia simplicifolia isolectin B4 bei einer Konzentration von 1: 100 für 10 min in PBS bei RT (Figur 5) oder mit PE-konjugierten CD31 - Antikörper in einer Konzentration von 1: 100 für 30 min in PBS bei RT (Abbildung 6). </li><li> Waschen Sie die Abschnitte mit dreimal PBS. </li><li> Nach dem Waschen beflecken die Abschnitte mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Zellkerne sichtbar zu machen. Montieren der Abschnitte in anti-fade-Reagenz und Bild DAPI (Anregung bei 345 nm, Emission bei 455 nm), EGFP (Anregung bei 489 nm, Emission bei 508 nm) und Nilrot (Anregung bei 553 nm, Emission bei 637 nm) mit einem Fluoreszenzmikroskop (Figuren 3, 5, 6). </li></ol> 7. Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) für Paraffin eingebettete Schnitte <ol><li> Bereiten Sie die FISH - Sonde direkt mit Fluorophor für die DNA - in situ - Hybridisierung durch Nick - Translation unter Verwendung eines bakteriellen künstlichen Chromosom enthält die gesamte MCMV DNA Gen markiertome (pSM3fr) 19. Die Konzentration der FISH-Sonde beträgt 0,1 ug / ul. </li><li> Entparaffinieren und Rehydrierung die Folien der infizierten Gehirne 22. </li><li> Behandeln die Gewebeschnitte mit RNase (100 &amp; mgr; g / ml in PBS) viraler DNA zu detektieren. </li><li> Führen Antigen-Retrieval mit 0,05% NP40, 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) bei 95 bis 98 ° C für 20 min. Kühlen Sie die Folien bis auf RT für 20 min. </li><li> In einem Färbeküvette Glas Coplin, waschen Sie die Folien in reinem Wasser dreimal für 2 Minuten jedes Mal. Durchführen eines zusätzlichen Antigen-Retrieval-Schritt mit einer 0,06% Pepsin, 0,01 N HCl-Lösung für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Rinse gleitet dreimal in reinem Wasser für 2 Minuten jedes Mal in einem Färbeküvette Glas Coplin. </li><li> Dehydratisieren der Gewebeschnitte wieder durch den Objektträger aus 70% Ethanol Übertragung bis 85% Ethanol und dann mit 100% Ethanol. </li><li> 10 ml des Hybridisierungspuffers zur Herstellung mischen 1,25 ml in situ Hybridisierungssalze (3 M NaCl, 100 mM TrisHCl pH 8,0, 100 mM Natriumphosphat pH 6,8, 50 mM EDTA) mit 5 ml entionisiertes Formamid, 2,5 ml 50% Dextransulfat, 250 &amp; mgr; l 50x Denhardt-Lösung, 125 ul 100 mg / ml tRNA und 875 &amp; mgr; l H 2 O. </li><li> Verdünne die DNA-Sonde direkt markiert mit Fluorophoren, die die gesamte MCMV-Genom zufällig in dem Hybridisierungspuffer zu erkennen. Das Endvolumen sollte 10 &amp; mgr; l (7 &amp; mgr; l Hybridisierungspuffer, 1 &amp; mgr; l Sonde (0,1 ug / ul) und 2 &amp; mgr; l destilliertes Wasser) sein. </li><li> Fügen Sie die Sondenmischung (10 ul) zu jeder Folie und Deckel mit einem Deckglas (15 x 15 mm). Deckglasränder mit Gummi-Zement. Denaturieren die Sondenmischung für 5 min bei 85 ° C, und schließen Sie den Hybridisierungsschritt O / N bei 42 ° C. </li><li> Waschen der Objektträger mit 0,3% NP40, 0,4x SSC bei 73 ° C für 2 min; mit 0,1% NP40, 0,4x SSC bei 73 ° C für 1 min; und mit 2x SSC zweimal. </li><li> Counterstain die Kerne mit DAPI (10 ng / ml) und die Folie mit einem Deckglas abdecken. </li><li> Montierendie Abschnitte in anti-fade - Reagenz und Bild DAPI (Anregung bei 345 nm, Emission bei 455 nm) und EGFP (Anregung bei 489 nm, Emission bei 508 nm) mit einem Fluoreszenz - Mikroskop (Abbildung 4). </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia.">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863 (2014).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In Tiermodellen, ICV, intraperitoneale, direkte Plazenta und IV-Infektionen verwendet wurden, die Pathogenese von Virusenzephalitis zu studieren. Wir konzentrierten uns auf die ICV und IV-Injektion Modelle von neugeborenen Mäusen für die Einfachheit der Verfahren und der Nutzen der direkten Injektion von Partikeln in den Zielbereich. Obwohl intraperitoneale Infektion ist eine einfache Methode, verteilt Viruspartikel systemisch über einen indirekten Prozess 5,24. Direkte plazentaren Infektion ist eine gute ...

Wenn virale Enzephalitis zu studieren, ist die initiale Verteilung viraler Partikel sehr wichtig Krankheitsentstehung zu verstehen und virale Targets im Gehirn zu identifizieren. Die meisten Viren im Bereich von 20 bis 300 nm in der Größe, obwohl die Pandoraviren mehr als 700 nm 1 groß ist. Die Verteilung der viralen Partikel in der akuten Phase der Infektion kann auf die Größe der Partikel abhängen, die Verteilung von zellulären Rezeptoren oder die Affinität der zellulären Rezeptoren für Viren. In Tiermodellen intracerebroventricular (ICV), intraperitoneale, direkte Plazenta und intravenöse (IV) Infektionen verwendet wurden, um die Pathogenese von Virusenzephalitis zu studieren. ICV Inokulation mit dem Virus wird häufig verwendet, Zentralnervensystem (ZNS) Infektionen in Mäusen herzustellen. Studien dieser Technik berichten weit verbreitete Infektion verwendet, insbesondere von Zellen in der periventrikulären Zonen und in Regionen des Gehirns, in direktem Kontakt mit der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), similar zu den Wirkungen der viralen ventriculoencephalitis. Die geringe Größe des adeno-assoziierten Virus (AAV) Teilchen (20 bis 25 nm im Durchmesser) erleichtert ihre Verbreitung im Gehirn in ICV Infektionen 2-4. Die intraperitoneale 5, direkte Plazenta 6 und IV - Injektionen 7 repräsentieren hematogenic systemische Verabreichung. Das Eindringen von Viruspartikeln durch die Blut-Hirn - Schranke (BBB) ​​ermöglicht ihnen das Parenchym der neonatalen Gehirn zu erreichen, was diffuse microglial Knötchen 8,9. Cytomegalovirus (CMV) ist ein verbreitetes Virus, das das Herpes-Virus-Familie gehört. In den Vereinigten Staaten, 50% - 80% der Menschen haben CMV-Infektion durch das Alter hatte 40. CMV-Infektionen selten schädlich sind, aber Krankheiten bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem und Föten führen. Von allen Lieferungen, 0,2% - 2% sind mit CMV 10 geboren, was zu schweren Symptomen wie Mikrozephalie, periventrikuläre Verkalkung, Kleinhirnhypoplasie, microphthalmia und Sehnervenatrophie 11,12. Des Weiteren, geistige Retardierung, Innenohrschwerhörigkeit, Sehstörungen, Krampfanfällen und Epilepsie treten bei etwa 10% der nicht-tödlich CMV-infizierten Säuglingen 13,14. ZNS-Dysfunktion ist die häufigste charakteristisches Symptom von CMV angeborene Anomalie. Mehr Kinder werden dauerhaft jedes Jahr durch kongenitale CMV als durch das Down - Syndrom, das fetale Alkoholsyndrom oder Spina bifida 15 deaktiviert. Es gibt keine Impfung gegen CMV in der Gegenwart, für ein Bedürfnis nach einem sicheren und wirksamen Impfstoff ruft. Untersuchung der Wechselwirkung von CMV-Teilchen mit ihren Rezeptoren in der frühesten Phase der Infektion ist wichtig, die Wirkung der Impfung zu verstehen. Ventriculoencephalitis und diffuse Mikroglia Knötchen sind die beiden wichtigsten pathologischen Merkmale von CMV - 16 - Enzephalitis. Es ist ungewiss, wie die CMV-Partikel (150-300 nm) in der akuten Phase der Infektion eine durch das Gehirn ausgebreitetnd, wie die Verteilung von zellulären Rezeptoren und ihre Affinität für Viren tragen zur Ausbreitung des Virus. Kawasaki et al. Haben ICV und IV Infektionen aus der Perspektive der Verteilung der Teilchen und ihre Rezeptoren (β1 Integrin) in der frühesten Phase der Infektion beurteilt. Wir haben gefunden, dass die Verbreitung von CMV - Teilchen und der Expression von β1 - Integrin gut in der frühesten Phase der Infektion sowohl ICV und IV Infektionen 8 korreliert sind. ICV-Infektion ist ein Modell der ventriculoencephalitis und IV-Infektion ist ein Modell der diffusen Mikroglia Knötchen. auf die Wirkung der Teilchengröße, viral Wechselwirkungen mit Zellrezeptoren und den Mechanismus der BBB Eindringen in das Gehirn würde nützliche Information, die die Dynamik von viralen oder fluoreszierenden Teilchen zu studieren. Das folgende Protokoll kann jede viralen Infektionen und viralen Vektor in das ZNS zu untersuchen, verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&amp;nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% mouse serum</td><td>DAKO&amp;nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICR mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modified Microliter Syringes (7000 Series)</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35-gauge needle</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer (pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA (10 mg/ml)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glass</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&amp;nbsp; Gold</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles and fluorescent microbeads into the neonatal brain

In der Studie über die Pathogenese von Virusenzephalitis, ist die Infektion Methode kritisch. Die erste der beiden Hauptinfektionswege zum Gehirn ist die hämatogene Route, die Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns beinhaltet. Die zweite ist die intracerebroventricular (ICV) Route. Einmal innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS), ausbreiten können Viren auf den Subarachnoidalraum, Meningen und Plexus über den Liquor. In experimentellen Modellen werden die frühesten Stadien der ZNS-viralen Verbreitung nicht gut charakterisiert, und es ist unklar, ob nur bestimmte Zellen zunächst infiziert sind. Hier haben wir die Verteilung von Cytomegalovirus (CMV) Teilchen während der akuten Phase der Infektion untersucht, bezeichnet als primäre Virämie nach ICV oder intravaskulären (IV) Injektion in den neonatalen Mäusegehirn. Im ICV-Injektion-Modell, 5 ul murinen CMV (MCMV) oder fluoreszierenden Mikrokugeln wurden in den lateralen Ventrikel injiziert am midpoint zwischen dem Ohr und Auge, die eine 10-ul-Spritze mit einer Nadel 27 G verwendet wird. In der IV-Injektion-Modell, eine 1-ml-Spritze mit einer 35 G-Nadel verwendet wurde. Ein Durchleuchtungs wurde verwendet, um die oberflächliche zeitliche (facial) Vene des Neugeborenen Maus sichtbar zu machen. Wir infundiert 50 ul MCMV oder fluoreszierende Mikrokügelchen in die oberflächliche zeitliche Vene. Gehirne wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion geerntet. MCMV - Genome wurden unter Verwendung der in situ - Hybridisierungsverfahren nachgewiesen. Fluoreszierende Mikrokügelchen oder grün fluoreszierendes Protein exprimierenden rekombinanten MCMV Partikel wurden durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Diese Techniken können auf viele andere Pathogene angewendet werden, um die Pathogenese von Encephalitis zu untersuchen.

In Untersuchungen zur Pathogenese von viralen Enzephalitis, ist die Infektion Verfahren wichtig. Die hämatogenen Weg stellt eine akute Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns, während der ICV Route eine akute Infektion stellt über das CSF durch den Subarachnoidalraum ausbreitet, bis zu den Meningen und Plexus choroideus. Um die erste Verteilung der Partikel in akuten Enzephalitis analysieren, in - situ - Hybridisierung der MCMV Genome und die direkte B...

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Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Intracerebroventricular und intravaskuläre Injektion von Viruspartikeln und Fluorescent Microbeads in die neonatale Gehirn

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

intracerebroventricular-intravascular-injection-viral-particles

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K Aufrufe.  Hamamatsu University School of Medicine. Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization. 

Serie: Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Forschung

Neurowissenschaften

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most often results in failure of potential therapeutics designed for neurodegenerative disorders 1,2. Neurodegenerative diseases such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), in which the lower motor neurons are affected, can benefit greatly from introducing the therapeutic agents into the CNS. The purpose of this video is to demonstrate two different injection paradigms to deliver therapeutic materials into neonatal mice soon after birth. One of these methods is injecting directly into cerebral lateral ventricles (Intracerebroventricular) which results in delivery of materials into the CNS through the cerebrospinal fluid 3,4. The second method is a temporal vein injection (intravenous) that can introduce different therapeutics into the circulatory system, leading to systemic delivery including the CNS 5. Widespread transduction of the CNS is achievable if an appropriate viral vector and viral serotype is utilized. Visualization and utilization of the temporal vein for injection is feasible up to postnatal day 6. However, if the delivered material is intended to reach the CNS, these injections should take place while the blood brain barrier is more permeable due to its immature status, preferably prior to postnatal day 2. The fully developed blood brain barrier greatly limits the effectiveness of intravenous delivery. Both delivery systems are simple and effective once the surgical aptitude is achieved. They do not require any extensive surgical devices and can be performed by a single person. However, these techniques are not without challenges. The small size of postnatal day 2 pups and the subsequent small target areas can make the injections difficult to perform and initially challenging to replicate.

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular ICV and Intravenous IV Injection in Mice

This article demonstrates two very different methods of injection: 1) into the brain (intracerebroventricular) and 2) systemic (intravenous) to introduce the therapeutic agents into the central nervous system of neonatal mice.

Abgabe therapeutischer Wirkstoffe durch intracerebroventrikuläre (ICV) und intravenöse (IV) Injektion in Mäuse

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most ...

Medizin

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genetik

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Verwenden Sie von<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging zur Überwachung der Progression of Experimental Maus Cytomegalovirus-Infektion bei Neugeborenen

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Immunologie und Infektion

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly and additional brain abnormalities. However, the mechanism underlying the pathogenesis of ZIKV in the developing brain remains unclear. Intracerebral surgical methods are frequently used in neuroscience research to address questions about both normal and abnormal brain development and brain function. This protocol utilizes classical surgical techniques and describes methods that allow one to model ZIKV-associated human neurological disease in the mouse nervous system. While direct brain inoculation does not model the normal mode of virus transmission, the method allows investigators to ask targeted questions concerning the consequence after ZIKV infection of the developing brain. This protocol describes embryonic, neonatal, and adult stages of intraventricular inoculation of ZIKV. Once mastered, this method can become a straightforward and reproducible technique that only takes a few hours to perform.

Here we describe a method for establishing a model of Zika virus-induced microcephaly in mouse. This protocol includes methods for embryonic, neonatal, and adult-stage intracerebral inoculation of the Zika virus.

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

Intravenöse Injektionen in neugeborenen Mäusen

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Biologie

Ein umfassendes Protokoll für die Verabreichung von intrathekalen Injektionen bei neugeborenen Mäusen

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and treatments. By directly delivering medications and treatments into the cerebrospinal fluid of the central nervous system, this method achieves higher localized drug concentrations while reducing systemic side-effects compared to other routes such as intravenous, subcutaneous, or intramuscular injections. Its importance extends beyond clinical settings, as intrathecal injection plays a vital role in preclinical studies focused on treating neurogenetic disorders in rodents and other large animals, including non-human primates. However, despite its widespread application, intrathecal injection in young, particularly neonatal pups, poses significant technical challenges due to their small size and fragile nature. Successful and reliable administration of intrathecal injections in newborn mice requires meticulous attention to detail and careful consideration of various factors. Thus, there is a crucial need for a standardized protocol that not only provides instructions but also highlights key technical considerations and good laboratory practices to ensure procedural consistency, as well as the safety and welfare of the animals.
To address this unmet need, we present a detailed and comprehensive protocol for performing intrathecal injections specifically in newborn pups on postnatal day 1 (P1). By following the step-by-step instructions, researchers can confidently perform intrathecal injections in neonatal pups, enabling the accurate delivery of drugs, antisense oligos, and viruses for gene replacement or genome editing-based treatments. Furthermore, the importance of adhering to good laboratory practices is emphasized to maintain the well-being of animals and ensure reliable experimental outcomes. This protocol aims to address the technical challenges associated with intrathecal injections in neonatal mice, ultimately facilitating advances in the field of neurogenetic research that aims to develop potential therapeutic interventions.

Autor im Rampenlicht: Intrathekale Injektion – Eine effiziente und zuverlässige Verabreichungsmethode zum Testen der Wirksamkeit der Gen-Editierung in neonatalen Mäusegehirnen

The present protocol outlines step-by-step instructions for performing intrathecal injections in neonatal mice for gene editing and drug delivery.

Intrathekale Injektion von neugeborenen Mäusen zur Genomeditierung und Medikamentenverabreichung

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

Intracerebroventricular und intravaskuläre Injektion von Viruspartikeln und Fluorescent Microbeads in die neonatale Gehirn

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Abgabe therapeutischer Wirkstoffe durch intracerebroventrikuläre (ICV) und intravenöse (IV) Injektion in Mäuse

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Verwenden Sie von

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene

Intravenöse Injektionen in neugeborenen Mäusen

Intrathekale Injektion von neugeborenen Mäusen zur Genomeditierung und Medikamentenverabreichung

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