The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

1.倒立モデル系で播種HIBCPP細胞のための細胞培養フィルターインサートを準備します<ol><li>前加温DMEM / F12（ハム）を5μg/ mlのインスリン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）を補充しました。 </li><li>逆さまに12ウェルプレート（ 図1E）に3ミクロンの細孔サイズで0.33 cm 2の成長領域の細胞培養フィルターインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。 </li><li>細胞培養フィルターインサートの下の区画（約3ml）およびフィルターインサートの上に100μlのにメディアを埋めます。プレートだけでなく、媒体と​​下の区画をあふれさせます。フィルタインサートの下の区画が（ 図1E）満たされたままになるように、過剰な培地を吸引除去します。 注：このステップのための血清学的ピペットを使用することをお勧めします。 </li><li>蓋で12ウェルプレートをカバーし、インキュベーターに調製した細胞培養用フィルタインサートを転送する、37°C細胞を添加するまで5％CO 2。 </li></ol> 2.栽培とHIBCPP細胞の継代<ol><li> 5μg/ mlの、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％FCSを補充したDMEM / F12（ハム）を準備します。 </li><li> 37℃の水槽で予備暖かい媒体とPBS。フラスコから培地を吸引。フラスコやスワールに10mlのPBSを追加します。一度、この手順を繰り返します。 </li><li>フラスコやスワールに3ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 、インキュベーターに37℃、5％CO 2を配置します 。 </li><li>約20分後、インキュベーターからフラスコを取り外します。細胞がフラスコの底から切り離されていることを確認し、顕微鏡で調査したときに円形が表示されます。 注：細胞は、互いから完全に切り離しておらず、しばしば凝集体中に見出されます。通路38までのセルを使用することをお勧めします。 </li><li>トリプシン処理を停止するには17ミリリットル培地を追加します。上下にピペッティングすることにより細胞を再懸濁し、懸濁液を移します50ミリリットルチューブに。室温で10分間、50×gで遠心分離します。 </li><li>媒体の適切な量で細胞を再懸濁し、血球計数器を使用して細胞を数えます。 注：再懸濁HIBCPP細胞の濃度が1×10 6細胞/ mlであるべきです。 HIBCPP細胞の維持のために、T75フラスコに10 mlの培地中に1-6×10 6細胞の量を転送するために提案されています。一日おきに培地に変更します。 </li></ol> HIBCPP細胞と3シード反転細胞培養フィルターインサート<ol><li> （フィルタの底部側すなわち ）それぞれの逆フィルタインサートの上に細胞懸濁液（ すなわち 8×10 4細胞）（ 図1E）の80μlを添加します。 注：細胞が均等に播種する前にチューブを反転させることによって懸濁液中に分散されていることを確認します。 </li><li>インキュベーターに12ウェルプレート及び転写の蓋、37°C​​、5％Cを播種した細胞培養用フィルタインサートをカバーO 2。 </li><li>初日に、24ウェルプレートのウェルに1ミリリットル培地を埋めます。 12ウェルプレートのうち、鉗子を用いて、細胞培養フィルターインサートを持ち上げ、内側の媒体を破棄し、フィルターインサートをオンにして調製した24ウェルプレート（ 図1E）に標準的な向きに配置します。 </li><li>二日毎に新鮮な培地に細胞を配置します。新鮮な培地で24ウェルを準備し、それにフィルターインサートを移します。 0.5ミリリットルの新鮮な培地とインサートを記入してください。セクション4で説明したように、毎日TEERを確認してください。 </li><li> HIBCPPのTEER値は、細胞培養インサート上で細胞を播種すると70Ωのx cm 2で（約4日播種後）を超え、その後、1％FCSおよび5μg/ mlのインスリンを含有する培地中で細胞培養を続けます。各ウェルのための培地1ミリリットルで24ウェルプレートを準備します。上部コンパートメントに準備したウェルと交換媒体にフィルターインサートを転送します。 注：この血清除去を密集度は、の形成につながる後高い膜電位。 </li><li>フィルタ区画から培地を吸引は、よく準備に転送し、500μlの培地で埋めます。一度、この手順を繰り返します。 、インキュベーターに一晩、37℃、5％CO 2をセルに入れてください。 </li></ol>経上皮電気抵抗の4測定（TEER） <ol><li> 80％エタノール中で15分間、上皮組織voltohmmeterの電極チップを浸し。ボンネットの下voltohmmeterを移し、一瞬電極乾燥させます。平衡化するための別の15分間の細胞のために使用されるそれぞれの培養液中に電極を配置します。 </li><li>それは毎回下部コンパートメントの底に接するように電極の長いアームを配置することによって測定を行う、フィルターインサート区画に短い腕を置きます。 注： - ブランク値（Ω））×フィルタ培地中で細胞を含まない細胞培養フィルターインサートの抵抗値はブランク値（（実測値（Ω）として使用されるべきです表面（ すなわち 0.33 cm 2で））。 </li><li> 15分間80％エタノールに電極背面場を測定した後。ドライチューブ内に保管してください。 </li></ol>傍細胞透過性の5決意<ol><li> 5μg/ mlのインスリン、1％FCSを補充した200mLの培養培地中で1gのFITC-イヌリンを溶解します。細胞の感染前に、上部フィルタ室への溶液の50μg/ mlのを適用します。 </li><li>感染後多くのイヌリンは、細胞層を介してフィルタ区画から渡される方法を決定するために、下の井戸から培地サンプルを収集。 </li><li> FITC-イヌリン標準液を調製し、1行う：2希釈、10倍（100％、50％、25％、12.5％、6.25％3.13％1.56％0.78％0.39％、0.2％及び0％）の。マイクロプレートリーダー内のすべてのサンプルを測定することにより蛍光を決定します。 </li></ol>細胞培養フィルターインサート上HIBCPP細胞の感染のための細菌の6.準備<ol><li>実験前にある日、こすりトン彼冷凍N.髄膜炎菌は Vitoxとチョコレート寒天上でグリセロールストックと連勝をオフ株。 5％CO 2で、37℃で、インキュベーター中で一晩成長します。 </li><li>一晩培養物から20〜30コロニーを抽出し、0.042パーセントのNaHCO 3、0.01 MのMgCl 2および1％Polyvitexを補っ8ミリリットルプロテオースペプトン培地を含むチューブに移します。 </li><li> 220rpmで、37℃で1.25時間、細菌を振ります。室温で10分間2,684 gでの遠心分離によって細菌をペレット。上清を捨て、8ミリリットルの無血清培地で細菌ペレットを再懸濁します。でも、サスペンションを確保するための渦。 </li><li>培養密度を決定するために、600nmでの光学密度（OD）で1：10の希釈を測定します。 OD 0.1の600に細菌懸濁液を調整します。 注：この懸濁液を約含まれています。 1×10 8 CFU / mlです。 </li><li>細菌細胞濃度を確認するAまで懸濁液を段階的（1:10）希釈しますチョコレート寒天プレート上に10 -5の希釈およびプレート。 注：同様の連続希釈は、細菌増殖曲線を計算するために実行される必要があります。 </li></ol>二重免疫による細菌の侵入の細胞培養フィルターインサートと決意にHIBCPP細胞の7感染<ol><li> 1％FCSおよび5μg/ mlのインスリンを含有する培地中で細胞培養を継続した後、上皮組織voltohmmeterを使用して毎日細胞を測定します。細胞は約500Ωのx cm 2でのTEERに達した場合は、感染を行います。 </li><li>指定された時間が経過し、5％CO 2で、37℃で、10店の感染多重度で準備された細菌懸濁液（MOI）で細胞インキュベーターで感染細胞に感染します。 注：MOIがコンフルエンス（1.21×10 6細胞/ cm 2）で考慮細胞培養フィルターインサートあたりの細胞数を取ることによって計算することができます。 </li><li>未感染を停止1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する500μlの無血清培地で3回洗浄することによってイオン（SFM）は、下部コンパートメントに、フィルタ室1 mlで適用しました。 </li><li>非特異的結合部位に対する抗体の付着を防止するために、1％BSAフィルタ室のバッファと、室温で20分間、下部コンパートメント1 mlを含む500μlのSFMでブロック。 </li><li> 100μlの一次抗体抗Nでインキュベートフィルタコンパートメント内、室温で20分間、下の区画で500μlの：meningtidisα-OMP（200 1）。 注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。 </li><li>フィルタ区画から培地を吸引して細胞を洗浄し、1％BSAを含有する調製ウェル1 mLのSFMにフィルタインサートを転送し、1％BSAを含有する500μlのSFMで空にフィルタ室を満たします。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>フィルタのコンパに500μlの4％ホルムアルデヒドで細胞を固定してくださいrtment、室温で10分間、下部コンパートメント1 mlです。 </li><li>フィルタ区画から培地を吸引して細胞を洗浄し、1mlのPBSでよく準備し、500μlのPBSで空にフィルタ室を埋めるために、フィルタインサートを移します。一度、この手順を繰り返します。 注：サンプルを4℃でPBS中に一晩保存することができます。 </li><li>切断インサートの外細胞培養フィルターを固定し、250μlのPBS、1％BSAを含有する洗浄します。細胞外細菌を染色するために：標識された250μlの蛍光（励起波長594 nm）を二次抗体ニワトリ抗ウサギ（500 1）を用いて室温で15分間、細胞をインキュベートします。 注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。 </li><li> 250μlのPBSを室温で1時間、1％BSAおよび0.5％トリトンX-100を含有する細胞透過性。 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。 </li><li> 250μlの一次抗体抗Nでインキュベート髄膜炎菌 </em&gt;のα-OMP（1：200）、細胞外および細胞内細菌を染色する30分間。 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。 </li><li> （1：500）、蛍光標識した（励起波長660 nm）をファロイジン（1：250）および4&#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）（蛍光標識を250μl（励起波長488 nm）を二次抗体を適用します。 1：50,000）を室温で1時間細胞外および細胞内細菌、アクチン細胞骨格と核を染色しました。 注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。 </li><li> 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。顕微鏡を介して、検査まで4℃でメディアや店舗を実装する際に細胞を埋め込みます。 </li><li>事前に定義されたフィールドごとに侵入した細菌の数を決定します。フィルター膜当たり20フィールドをカウントすることによってこれを行います。侵入した細菌の割合を計算します。 注：エリアcoefficと20の顕微鏡視野の平均細菌数を掛けient。結果は、0.33 cm 2の細胞培養フィルターインサート中に存在する全細菌の量を表します。感染期間中に培地中で増殖させた細菌の量によって、この値を割ります。 </li></ol>

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W., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+messenger+RNA+for+transthyretin+(prealbumin)+in+human+choroid+plexus.">High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus.</a> Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).</li><li>Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+insulin-like+growth+factor+II+gene+in+the+choroid+plexus+and+the+leptomeninges+of+the+adult+rat+central+nervous+system.">Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).</li><li>Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winged+helix+transcription+factor+HFH-4+is+expressed+during+choroid+plexus+epithelial+development+in+the+mouse+embryo.">The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).</li><li>Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+may+be+an+underestimated+site+of+tumor+invasion+to+the+brain:+an+in+vitro+study+using+neuroblastoma+cell+lines.">The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines.</a> Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

CPの上皮細胞は、血液2,3からCSFを分離BCSFBを形成します。我々は最近、BCSFBの機能性ヒトモデルとしてHIBCPP細胞株を確立しました。細胞は、高い膜電位の開発、巨大分子のための低透過性、ならびにのTJ 5の連続ストランドの存在を含むin vitroでの BCSFBの重要なバリア機能を表示します。 TJ蛋白質は、細胞の基底外側/頂端の極性に寄与する。極性は、表面受容体ならびに?...

血液脳脊髄液関門（BCSFB）は、血液と脳の1の間に3つのバリアサイトの一つです。その形態学的相関脈絡叢（CP）2,3、強く脳室に血管新生および配置されている内皮上皮回旋の上皮細胞です。 CPは、脳脊髄液（CSF）を生成するだけでなく、血液から後者を分離するのに役立ちます。バリア機能を実現するために、CP上皮細胞は、低飲作用活性を示す特定のトランスポーターを発現し、そして密に密着結合（のTJ）2,3の連続的なネットワークで接続されています。 日本人女性4の悪性脈絡叢乳頭腫由来のヒト脈絡叢乳頭腫（HIBCPP）細胞は、BCSFBのインビトロモデルで機能を構築するために使用しました。 HIBCPP細胞は、TJの形成などの機能BCSFBの特性のいくつかを示してストランド、経上皮電気抵抗（TEER）のように決定することができる高い経上皮膜電位の開発、および高分子のマイナー透過性。また、HIBCPP細胞は、イオン性微小環境を調節するために機能し、基底外側/アピカル極性5,6,7を示すことが特徴的なトランスポーターを発現します。 BCSFBは、中枢神経系（CNS）8への病原体（細菌、ウイルス、および真菌）のための侵入部位として機能することが示されています。 髄膜炎菌 （ 髄膜炎菌 ）、グラム陰性菌、などの病原体の侵入は、髄膜炎などの重篤な病気を引き起こす可能性があります。 それはCPの保護上皮バリアを克服したという証拠は、血管およびCP上皮細胞9,10で髄膜炎菌の増加量を示す髄膜炎菌性疾患を有する患者における組織病 ​​理学的観察によってサポートされています。宿主細胞のBAへの参入を得るために、cteriaは、多くの場合、宿主細胞上にある特定の表面受容体によって媒介またはトリガされるエンドサイトーシス機構を乗っ取ります。これらの受容体と病原体の相互作用は11種特異的であることができるので、動物モデルにのみ制限された範囲に相談することができます。 HIBCPP細胞株は、浸潤プロセスならびにヒトモデル系において根底にある分子メカニズムを研究する機会を提供します。細胞培養インサートを採用するには、2つのセルの側面から宿主細胞と病原体の相互作用を分析することを可能にしています。 N.含む多くの細菌、 髄膜炎菌は 、感染アッセイ中の重力の影響を強く受けます。アッセイ中HIBCPP細胞と病原体の最適な相互作用のために、細菌は、最初に細胞培養フィルターインサートシステムの上部コンパートメントに追加されます。それぞれ、頂端または側底細胞側からの感染を有効にするには、in vitroの系の2つのバリエーションは、ESTAされていますblished：標準システムではHIBCPP細胞は微生物がCSF-側に位置し、細胞（ 図1A、C）の頂端側と接触するように取得されたときの状況を模倣し、フィルタインサートの上部コンパートメントに播種します。対照的に、反転細胞培養フィルターインサートシステムにおいてHIBCPP細胞を使用して細菌が血流に入っている状態を反映しています。微生物は、側底側からの血液との出会いCP上皮細胞（ 図1B、D）に広めます。注目すべきは、このモデル系では、細菌は、基底細胞の側5,7から特に極性様式でHIBCPP細胞に侵入することが示されています。 続いてCPの感染、侵入する病原体パターン認識受容体（PRRは）への連結を介して自然免疫系によって認識され得ます。 PRRのよく説明メンバーは、Toll様受容体（TLR）ファミリーに属します。 TLRは缶ビン病原体関連分子パターン（PAMP）と呼ばれている感染性微生物の特徴構成に、D。受容体のライゲーションは、次にBCSFB 13,14を横切って免疫細胞の遊出を促進するサイトカインおよびケモカイン12の発現を誘発する宿主細胞のシグナル伝達カスケードの活性化をもたらします。 HIBCPP細胞は、mRNAレベルでいくつかのTLRを発現することが示され、N.とその感染されています髄膜炎菌は CXCL1-3、IL6、IL8およびTNFα15,16を含むいくつかのサイトカインおよびケモカインの分泌をもたらします。 ここでは、BCSFBを模倣反転細胞培養インサートシステムで栽培し、ヒト細胞株HIBCPPの感染を記述しています。このモデルシステムは、生体内の関連する側底細胞側だけでなく、その後の細胞応答と病原体の相互作用を研究することができます。

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;acute;,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Neisseria meningitidis &amp;alpha;-OMP</td><td></td><td></td><td>This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of W&amp;uuml;rzburg, Germany)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate agar plates</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask 75 cm&amp;sup2; red cap sterile</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

a choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

ここでは、反転し、細胞培養インサートシステムでHIBCPP細胞の培養および感染を説明します。このモデルは、私たちは（ 図1）を普及し、血流を介して上皮細胞に侵入する細菌の生理学的状況を再現、側底細胞側から侵入メカニズムとその下にある分子のシグナル伝達経路を研究することができます。 HIBCPP細...

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A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

ヒトの血液脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルは、基底外側からの細菌感染症を研究するために、

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

a-choroid-plexus-epithelial-cell-based-model-human-blood

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K ビュー.  Heidelberg University. The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

生物工学

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

免疫・感染学

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

神経科学

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

医学

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in neuroscience. As it is becoming increasingly clear that this tiny structure plays a crucial role in health and disease of the central nervous system (CNS), it is of utmost importance to properly dissect the CP out of the brain ventricles in a way that allows downstream processing, ranging from functional to structural analysis. Here, isolation of the lateral and fourth brain ventricle mouse CP without the need for specialized tools or equipment is described. This isolation technique preserves the viability, function, and structure of cells within the CP. On account of its high vascularization, the CP can be visualized floating inside the ventricular cavities of the brain using a binocular microscope. However, transcardial perfusion required for downstream analysis can complicate the identification of the CP tissue. Depending on the further processing steps (e.g., RNA and protein analysis), this can be solved by visualizing the CP via transcardial perfusion with bromophenol blue. After isolation, the CP can be processed using several techniques, including RNA, protein, or single cell analysis, to gain further understanding on the function of this special brain structure. Here, scanning electron microscopy (SEM) on whole mount CP is used to get an overall view of the structure.

The choroid plexus (CP), an understudied tissue in neuroscience, plays a key role in health and disease of the central nervous system. This protocol describes a microdissection technique for isolating the CP and the use of scanning electron microscopy to obtain an overall view of its cellular structure.

マイクロダイセクションとホールマウント走査型電子顕微鏡によるマウス脈絡叢の可視化

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model systems. In most cases, chopstick electrodes are used to determine the electric impedance between the upper and lower compartment of a cell culture filter insert system containing cellular monolayers. The filter membrane allows the cells to adhere, polarize, and interact by building tight junctions. This technique has been described with a variety of different cell lines (e.g., cells of the blood-brain barrier, blood-cerebrospinal fluid barrier, or gastrointestinal and pulmonary tract). TEER measurement devices can be readily obtained from different laboratory equipment suppliers. However, there are more cost-effective and customizable solutions imaginable if an appropriate voltammeter is self-assembled. The overall aim of this publication is to set up a reliable device with programmable output frequency that can be used with commercially available chopstick electrodes for TEER measurement.

Here, we demonstrate how to set up an inexpensive volt-amperemeter with programmable output frequency that can be used with commercially available chopstick electrodes for transepithelial/endothelial electrical resistance measurements.

プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてTEER測定を行う簡単なアプローチ

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

生物学

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls and restrict access to the brain parenchyma. However, with the development of nanotechnologies, large panels of new nanomaterials were developed to improve drug delivery, highlighting the need for reliable in vitro microsystems to predict brain penetration in the frame of preclinical assays. Here is a straightforward method to set up a microphysiological system to model the BBB using solely human cells. In its configuration, the model consists of a triple culture including brain-like endothelial cells (BLECs), pericytes, and astrocytes, the three main BBB cellular actors necessary to induce and regulate the BBB properties in a more physiological manner without the requirement of tightening compounds. The model developed in a 12-well plate format, ready after 6 days of triple culture, is characterized in physical properties, gene, and protein expressions and used for polymeric nanogel transport measurement. The model can be used for an extensive range of experiments in healthy and pathological conditions and represents a valuable tool for preclinical assessments of molecule and particle transport, as well as inter-and intracellular trafficking.

This protocol describes a method to establish a human blood-brain barrier (BBB) in vitro model. The endothelial cells and pericytes are seeded on each side of an insert filter (blood compartment), and astrocytes are seeded in the bottom well (brain compartment). The model characterized was used for nanoparticles transport experiments.

ヒト血液脳関門をモデル化した三重培養細胞系

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

An In Vitro Model for Studying Pathogen Crossing of the Blood-Brain Barrier and Brain Cell Infection

Source: da Costa, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59220">A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an in vitro model to study pathogens crossing the blood-brain barrier (BBB). Microvascular endothelial cells, which express tight junctions, form an endothelial layer in the upper chamber, while neurons, astrocytes, and microglia represent the brain parenchyma in the lower chamber, separated by a porous membrane. Virus infection in the BBB model mimics the pathogen crossing from blood to the brain. Upon introducing a neurotropic virus, it crosses the BBB via transcytosis, infects neural cells, replicates, and releases viral progeny, demonstrating successful neuroinvasion.

Source: da Costa, A., et al. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the ...

ヒトの血液脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルは、基底外側からの細菌感染症を研究するために、

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人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

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新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイスモデル

マイクロダイセクションとホールマウント走査型電子顕微鏡によるマウス脈絡叢の可視化

プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてTEER測定を行う簡単なアプローチ

ヒト血液脳関門をモデル化した三重培養細胞系

An In Vitro Model for Studying Pathogen Crossing of the Blood-Brain Barrier and Brain Cell Infection

ヒトの血液脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルは、基底外側からの細菌感染症を研究するために、

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人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

使用してリンパ球血管外漏出の分析

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

マイクロダイセクションとホールマウント走査型電子顕微鏡によるマウス脈絡叢の可視化

プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてTEER測定を行う簡単なアプローチ

ヒト血液脳関門をモデル化した三重培養細胞系

An In Vitro Model for Studying Pathogen Crossing of the Blood-Brain Barrier and Brain Cell Infection

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイスモデル