The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

1. הכין הוספת מסנן תרבית תאים עבור תאי המתזמן HIBCPP ב מערכת מודל הפוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם DMEM / F12 (Ham) בתוספת 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -10% עוברי עגל בסרום (FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים סטרילי כדי למקם מוסיף מסנן תרבית תאים 0.33 סמ&quot;ר הצמיחה באזור עם גודל הנקבוביות של 3 מיקרומטר במהופך לתוך צלחת 12-היטב (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בינוניים לתוך המגירה התחתונה של כנס מסנן תרבית תאים (כ -3 מיליליטר) ו -100 μl על גבי להכניס את המסנן. להציף את הצלחת כמו גם בתא התחתון עם מדיום. לשאוב את המדיום מוגזם בצורה כזאת כי בתא התחתון של להכניס מסנן נשאר מלא (1E איור). הערה: מומלץ להשתמש פיפטה סרולוגיות עבור שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בצלחת 12-היטב עם המכסה ולהעביר מחדיר מסנן תרבית תאים מוכן בחממה, 37 ° C,5% CO 2 עד תוספת של תאים. </li></ol> טיפוח 2. Passaging של תאים HIBCPP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DMEM / F12 (Ham) בתוספת 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל ו -10% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני טרום חם PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשאוב בינוני מן הבקבוק. הוסף 10 מ&quot;ל PBS על הבקבוק ו מערבולת. חזור על פעולה זו פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל 0.25% טריפסין-EDTA אל הבקבוק מערבולת. מניחים לתוך החממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ -20 דקות להסיר את הבקבוק מן החממה. ודא כי התאים מנותקים מהחלק התחתון של הבקבוק ולהציג צורה עגולה כאשר שנסקרו עם המיקרוסקופ. הערה: התאים לא לנתק לחלוטין זה מזה נמצאים בדרך כלל agglomerates. מומלץ להשתמש בתאים עד חלוף 38. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפסיק trypsinization להוסיף 17 מ&quot;ל בינוני. Resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיהלתוך צינור 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 50 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים נפח מתאים של המדיום לספור את התאים באמצעות hemocytometer. הערה: ריכוז תאי HIBCPP resuspended צריך להיות 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. עבור תחזוקה של תאים HIBCPP הוא הציע להעביר סכום של 1-6 x 10 6 תאים 10 מ&quot;ל בינוני עד א-בבקבוק T75. שנה בינונית כל שני וחמישי. </li></ol> 3. מתזמן Inverted נייד הוספת מסנן תרבות עם תאי HIBCPP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בראש כל כנס מסנן הפוך (כלומר בצד התחתון של המסנן) להוסיף 80 μl של השעית תא (כלומר. 8 x 10 4 תאים) (איור 1E). הערה: ודא כי התאים מופצים בצורה אחידה בתוך ההשעיה על ידי צינור היפוך לפני הזריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את מוסיף מסנן התרבות הזורע תאים עם המכסה של הצלחת 12-היטב ולהעביר בחממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון, למלא 1 בינוני מ&quot;ל לתוך הבארות של צלחת 24 גם. הרם את מוסיף מסנן תרבית תאים באמצעות מלקחיים מתוך צלחת 12-היטב, להשליך את המדיום פנימה, להדליק את מוסיף מסנן ומניחים אותם בכיוון סטנדרטי לתוך צלחת 24 גם מוכן (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים לתוך מדיום חדש כל שני וחמישי. כן 24 בארות עם מדיום חדש ולהעביר את מוסיף המסנן אליו. מלאו מוסיף עם מדיום חדש 0.5 מ&quot;ל. בדוק TEER כל יום כמפורט בסעיף 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ערכים TEER של תאים שנזרעו HIBCPP על מוסיף תרבית תאים עולה 70 Ω x סמ&quot;ר (כ 4 ימים לאחר הזריעה), ולאחר מכן להמשיך תרבית תאים במדיום המכיל FCS 1% ו 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין. הכן 24 גם צלחות עם המדיום 1 מ&quot;ל לכל היטב. העבר מוסיף מסנן על הבארות המוכנות והבינוני חילופיים בתא העליון. הערה: נסיגת סרום זה לאחר confluency מובילה להיווצרות שלפוטנציאל הממברנה גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני מתא מסנן, להעביר מוכן היטב ולמלא עם 500 בינוני μl. חזור על פעולה זו פעם. שים את תאי לילה לתוך החממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 4. מדידה של ההתנגדות החשמלית Transepithelial (TEER) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול טיפים אלקטרודה של voltohmmeter רקמות אפיתל במשך 15 דקות באתנול 80%. העבר voltohmmeter מתחת למכסה המנוע ולתת להתייבש אלקטרודה לרגע. מניח אלקטרודה לתוך מדיום תרבות בהתאמה המשמש את התאים במשך 15 דקות אחרות כדי לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מדידות על ידי מיצוב הזרוע הארוכה של האלקטרודה כך שהוא נוגע בתחתית המגירה התחתונה בכל פעם, במקום זרוע הקצר לתוך תא הכנס המסנן. הערה: ערכי התנגדות של מוסיף מסנן תרבית תאים ללא תאים בינוניים אמורה לשמש ערכי ריק כמו ((ערך נמדד (Ω) - ערך ריק (Ω)) x מסנןמשטח (כלומר 0.33 סמ&quot;ר)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי בדיקת המקום האלקטרודה בחזרה לתוך אתנול 80% במשך 15 דקות. אחסן בתוך שפופרת יבשה. </li></ol> 5. קביעת חדירות Paracellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1 גרם FITC-אינולין ב 200 מ&quot;ל בינוני תרבות בתוספת 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין 1% FCS. החל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של הפתרון לתוך תא מסנן העליון לפני ההדבקה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדבקה לאסוף דגימות בינוניות מהבאר הנמוכה כדי לקבוע כמה אינולין עבר מתא המסנן דרך שכבת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון סטנדרטי FITC-אינולין ולבצע 1: 2 דילולים, 10 פעמים (100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, 1.56%, 0.78%, 0.39%, 0.2% ו 0%) . לקבוע קרינה על ידי מדידת כל דגימות קורא microplate. </li></ol> 6. הכנת חיידקים עבור זיהום של תאי HIBCPP על הוספת מסנן תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני הניסוי, לגרד tהוא נ קפוא meningitidis זנים מחוץ מניה-גליצרול פס על אגר שוקולד עם Vitox. לגדול לילה בחממה, על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ 20-30 מושבות מתרבות לילה ולהעביר לתוך שפופרת המכילה 8 מ&quot;ל Proteose Peptone בינוני בתוספת 0.042% 3 NaHCO, 0.01 M MgCl 2 ו -1% Polyvitex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את החיידקים עבור 1.25 שעות ב 220 סל&quot;ד, 37 ° C. גלולה חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 2684 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant ו resuspend גלולה חיידקי עם 8 מ&quot;ל סרום ללא בינוני. וורטקס כדי להבטיח השעיה אפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע צפיפות תרבות, למדוד דילול של 1:10 ב צפיפות אופטית (OD) של 600 ננומטר. התאם את השעית החיידקים כדי OD 600 של 0.1. הערה: השעיה זו מכילה כ. 1 x 10 8 CFU / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את ריכוז תא החיידק, לדלל את בשלבי ההשעיה (1:10) עדדילול של 10 -5 צלחת לצלחות אגר שוקולד. הערה: דילולים סדרתי דומה צריך להתבצע לחשב עקומות התפתחות חיידקים. </li></ol> 7. זיהום של תאי HIBCPP על הוספת מסנן תרבית תאים ו קביעת פלישת חיידקים ידי Immunofluorescence הזוגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתמשיך תרבית תאים במדיום המכיל FCS 1% ואינסולין 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, למדוד תאים מדי יום באמצעות voltohmmeter רקמת האפיתל. אם התאים הגיעו TEER של כ -500 Ω x cm², לבצע את הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים עם השעית החיידקים המוכנה על ריבוי של זיהום (משרד פנים) של 10. חנות התאים הנגועים בחממה, על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 לתקופה המצוינת של זמן. הערה: משרד הפנים יכול להיות מחושב על ידי לקיחה בחשבון את מספר תאים לכל כנס מסנן תרבית תאים בנקודת המפגש (1.21 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את להדביקיון על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 500 μl בינוני סרום ללא (SFM) המכיל אלבומין 1% שור (BSA) להחיל את תא מסנן, 1 מ&quot;ל ל המגירה התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום עם 500 SFM μl המכיל 1% חיץ BSA בתא לסנן 1 מ&quot;ל בתא התחתון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע הדבקות של נוגדנים אתרי הקישור נוקבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 100 נ העיקרי μl נוגדן אנטי meningtidis α-OMP (1: 200) בתא לסנן 500 μl בתא התחתון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים על ידי aspirating המדיום מתא מסנן, להעביר את הכנס כדי לסנן SFM מוכן היטב עם 1 מ&quot;ל המכיל BSA 1% ולמלא את תא מסנן רוקנו עם 500 μl SFM המכיל 1% BSA. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם 500 μl פורמלדהיד 4% compa מסנןrtment, 1 מ&quot;ל בתא התחתון במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים על ידי aspirating המדיום מתא מסנן, להעביר את הכנס כדי לסנן PBS מוכן היטב עם 1 מ&quot;ל ולמלא את תא מסנן רוקנו עם 500 μl PBS. חזור על פעולה זו פעם. הערה: דוגמאות ניתן לאחסן לילה PBS ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Cut תא קבוע מסננת של מוסיף ולשטוף עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. דגירה תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 250 μl ניאון שכותרתו (עירור גל 594 ננומטר) משני נוגדנים עוף ארנב נגד (1: 500) להכתים חיידקים תאיים. הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים עם 250 μl PBS המכיל BSA 1% ו -0.5% Triton X-100 עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 250 נ העיקרי μl נוגדן אנטי meningitidis </em&gt; α-OMP (1: 200) למשך 30 דקות להכתים חיידקים חוּץ ו תאיים. שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 250 μl של ניאון שכותרתו (גל עירור 488 ננומטר) נוגדנים משני (1: 500), שכותרתו ניאון (גל עירור 660 ננומטר) Phalloidin (1: 250) ו 4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ( 1: 50,000) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר להכתים חיידקי חוּץ ו תאיים, cytoskeleton יקטין וגרעינים. הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. שבץ תאי הרכבה בינוני ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד בדיקה באמצעות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מספר החיידקים פלשו לכל שדה מוגדר מראש. האם זה על ידי ספירת 20 שדות לכל קרום מסנן. חישוב אחוזי חיידקים פלשו. הערה: הכפל את ספירת חיידקי ממוצע של 20 שדות מיקרוסקופיים עם שטח קואפיקient. התוצאה מבטאת את כמות החיידקים הכולל נוכח להכניס מסנן תרבית תאים 0.33 סמ&quot;ר. מחלקי ערך זה על ידי כמות החיידקים גדלו בתקשורת במהלך תקופת ההדבקה. </li></ol>

<ol>
	<li>Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).</li><li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus:+biology+and+pathology.">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).</li><li>Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroid+plexus+papilloma+cell+line+(HIBCPP).">Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Hum Cell. 18, 67-72 (2005).</li><li>Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+anovel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PloS One. 7, e30069 (2012).</li><li>Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+efflux+transport+proteins+of+the+human+choroid+plecus+papilloma+cell+line+HIBCPP,+a+functional+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Pharm Res. , (2014).</li><li>Gr&#252;ndler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li><li>Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+-+a+multi-role+player+during+infectious+diseases+of+the+CNS.">The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS.</a> Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).</li><li>Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Neisseria+meningtidis+with+the+components+of+the+blood-brain+barrier+correlates+with+increased+expression+of+PilC.">Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC.</a> J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).</li><li>Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays+assays.">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays.</a> Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).</li><li>Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells:+an+updated+view.">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).</li><li>Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe+sensing,+positive+feedback+loops+and+the+pathogenesis+of+inflammatory+diseases.">Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases.</a> Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).</li><li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system.">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).</li><li>Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+trafficking+through+the+choroid+plexus.">Cell trafficking through the choroid plexus.</a> Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).</li><li>Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+elicits+a+pro-inflammatory+response+involving+I+kappa+B+zeta+in+a+human+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+model.">Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model.</a> J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).</li><li>Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+of+polymorphnuclear+neutrophils+and+monocytes+through+the+human+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+after+bacterial+infection+in+vitro.">Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro.</a> J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).</li><li>McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutation+in+meningococcal+por+A+gene+associated+with+increased+endemic+disease.">Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease.</a> Lancet. 337, 514-517 (1991).</li><li>Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisserial+lipopolysaccharide+is+a+target+for+complement+component+C4b.+inner+core+phosphoethanolamine+residues+define+C4b+linkage+specificity.">Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity.</a> J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).</li><li>Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+carried+meningococci+lack+the+genes+required+for+capsule+synthesis+and+transport.">Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport.</a> Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).</li><li>Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+meningococci+carried+by+children+and+young+adults.">Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults.</a> J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).</li><li>Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro.">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).</li><li>Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+toll-like+receptor+2+and+4+in+the+brain+of+mice+challenged+with+cell+wall+components+derived+from+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).</li><li>Laflamme, S., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4:+the+missing+link+of+the+cerebral+innate+immune+response+triggered+by+circulating+gram-negative+bacterial+cell+wall+components.">Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components.</a> FASEB J. 15, 155-163 (2001).</li><li>Zughaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+capsular+polysaccharides+indice+inflammatory+responses+via+TLR2+and+TLR4-MD-2.">Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2.</a> J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).</li><li>Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Toll/IL-1-receptor+-mediated+gene+expression+by+the+inducible+nuclear+protein+IkappaBzeta.">Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta.</a> Nature. 430, 218-222 (2004).</li><li>Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pheumophila-induced+IkappaBzeta-dependent+expression+of+interleukin-6+in+lung+epithelium.">Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium.</a> Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).</li><li>Jaerve, A., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+CNS+injury+and+repair.">Chemokines in CNS injury and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).</li><li>Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+of+T-cells+after+infection+of+human+choroid+plexus+papilloma+cells+with+Echovirus+30+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Virus Res. 170, 66-74 (2012).</li><li>Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus:+Target+for+polypeptides+and+site+of+their+synthesis.">Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis.</a> Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).</li><li>Dickson, P. W., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+messenger+RNA+for+transthyretin+(prealbumin)+in+human+choroid+plexus.">High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus.</a> Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).</li><li>Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+insulin-like+growth+factor+II+gene+in+the+choroid+plexus+and+the+leptomeninges+of+the+adult+rat+central+nervous+system.">Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).</li><li>Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winged+helix+transcription+factor+HFH-4+is+expressed+during+choroid+plexus+epithelial+development+in+the+mouse+embryo.">The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).</li><li>Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+may+be+an+underestimated+site+of+tumor+invasion+to+the+brain:+an+in+vitro+study+using+neuroblastoma+cell+lines.">The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines.</a> Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לתאי האפיתל של CP מהווים את BCSFB שמפריד בין CSF מן 2,3 דם. לאחרונה הקים את הקו הסלולרי HIBCPP כמודל אנושי מתפקד של BCSFB. התאים להציג פונקציות מחסום חשובות של BCSFB במבחנה, כוללים הפיתוח של פוטנציאל הממברנה גבוה, חדירות נמוכות עבור מקרומולקולות, כמו גם הנוכחות של גדילים ר...

המכשול נוזל המוח והשדרה דם (BCSFB) הוא אחד האתרים שלושה מחסום בין הדם למוח 1. לתאם מורפולוגיים שלו הם תאי אפיתל של המקלעת דמה (CP) 2,3, גידול convolute האנדותל אפיתל, המהווה כלי דם מאוד וממוקם החדרים של המוח. המחסום משמש כדי לייצר את הנוזל השדרתי (CSF) וכן להפריד האחרון מהדם. על מנת להשיג תפקוד מחסום, לתאי האפיתל CP להראות פעילות pinocytotic נמוכה, להביע מובילים ספציפיים, ומחוברים בצפיפות על ידי רשת רציפה של צומת הדוקים (TJS) 2,3. הפפילומה מקלעת דמה עין אנושית (HIBCPP) תאים, נגזרים הפפילומה מקלעת דמה ממאיר של אישה 4 יפנית, ששמשו לבנייה פונקציונלית במודל חוץ גופייה של BCSFB. תאי HIBCPP להראות כמה מאפיינים של BCSFB פונקציונלי כמו ההיווצרות של TJגדילים, התפתחות של פוטנציאל הממברנה transepithelial גבוהה כי ניתן לקבוע ההתנגדות החשמלית transepithelial (TEER), ו permeabilities מינור מקרומולקולות. יתר על כן, תאי HIBCPP להביע מובילי מאפיין, אשר יכול לשמש כדי לווסת את המיקרו-הסביבה היונית, ולהראות פסגה / 5,6,7 קוטביויות basolateral. BCSFB הוכח לתפקד כאתר כניסה פתוגנים (חיידקים, וירוסים ופטריות) במערכת העצבים המרכזית (CNS) 8. הפלישה של פתוגנים, לרבות meningitidis Neisseria (meningitidis נ), חיידק גראם שלילי, יכולה לגרום למחלות קשות כמו דלקת קרום המוח. עדות לכך שהוא מתגבר על מחסום ההגנה האפיתל של CP נתמכת על ידי תצפיות histopathological בחולים עם מחלת קרום המוח מציגה כמויות מוגברות של meningococci על כלי הדם לתאי האפיתל CP 9,10. כדי לזכות כניסת ba תאי מארחיםcteria לעתים קרובות לחטוף מנגנוני endocytotic, אשר מתווכים או מופעלים על ידי קולטנים משטח ספציפיים הממוקמים על תאי מארחים. מאז אינטראקציות של פתוגנים עם קולטנים אלה יכולים להיות מינים ספציפיים 11, במודלים של בעלי חיים ניתן להתייעץ רק במידה מוגבלת. השורה תא HIBCPP מספק הזדמנות ללמוד את תהליך הפלישה כמו גם את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בתוך מודל המערכת האנושית. העסקה מוסיפה תרבית תאים מאפשרת לנתח אינטראקציות של פתוגנים עם תאי מארחים משני צדדי תא ברורים. חיידקים רבים, נ כולל meningitidis, כפופים בחריפות את השפעת הכבידה במהלך מבחני זיהום. עבור אינטראקציה אופטימלית של פתוגנים עם תאי HIBCPP במהלך המבחנים, החיידקים בתחילה מתווספים לתוך התא העליון של מערכת כנס מסנן תרבית תאים. כדי לאפשר זיהום מן הפסגה או בצד התא basolateral, בהתאמה, שתי וריאציות של מערכת במבחנה כבר established: במערכת תקן תאי HIBCPP הם זורעים לתוך התא העליון של הכנס המסנן, מחקו את המצב כאשר מיקרואורגניזמים נמצאים על CSF בצד ולקבל במגע עם צד apical של התאים (איור 1 א, ג). לעומת זאת, תוך שימוש בתאי HIBCPP במערכת כנס מסנן תרבית תאים הפוכה משקף את התנאים כאשר חיידקים נכנסו לזרם הדם. מיקרואורגניזמים להפיץ את CP דם המפגש לתאי האפיתל מהצד basolateral (איור 1 ב &#39;, ד&#39;). ראויים לציון, במערכת מודל זה הוכח כי חיידקים לפלוש תאי HIBCPP באופן קוטבי במיוחד מן 5,7 בצד התא basolateral. בהמשך לזיהום של CP, הפתוגנים פלשו יכולים להיות מוכר על ידי מערכת החיסון המולדת באמצעות קשירה לקולטנים-זיהוי תבניות (PRRs). היטב תיאר חברי PRRs שייכים קולטן דמוי אגרה (TLR) המשפחה. TLRs יכול binד למבנים מאפיינים של מיקרואורגניזמים זיהומיות, אשר דפוסים מולקולריים הפתוגן קשור termed (PAMPs). קשירה של הקולטניים מובילה הפעלה של תא מארח איתות מפלי המפעילות ביטוי של ציטוקינים כמוקינים 12, אשר בתורו לגרות גלגול של תאי מערכת חיסון על פני 13,14 BCSFB. הוכח כי תאי HIBCPP להביע כמה TLRs ברמה mRNA וזיהום כי עם נ meningitidis התוצאה הפרשת ציטוקינים כמה וכמוקינים, כולל CXCL1-3, IL6, IL8 ו TNFα 15,16. כאן אנו מתארים טיפוח וזיהום של קו תאים אנושיים HIBCPP במערכת להכניס תרבית תאים הפוכה המחקה את BCSFB. מערכת מודל זה מאפשרת ללמוד אינטראקציות של פתוגנים עם צד תא basolateral vivo ב רלוונטי וכן את תגובת התאים הבאה.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;acute;,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Neisseria meningitidis &amp;alpha;-OMP</td><td></td><td></td><td>This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of W&amp;uuml;rzburg, Germany)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate agar plates</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask 75 cm&amp;sup2; red cap sterile</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

a choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

כאן אנו מתארים culturing וזיהום של תאי HIBCPP במערכת להכניס תרבית תאים הפוכה. מודל זה מאפשר לנו לחקור מנגנוני פלישה ואת מסלולי איתות מולקולרית שבבסיס מצד התא basolateral, להתרבות מצב פיסיולוגי של חיידקים בהפצה והזנת תאי אפיתל דרך זרם הדם (איור 1). <p class=...

Watch this Scientific Journal Video about A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side at JoVE.com

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

a-choroid-plexus-epithelial-cell-based-model-human-blood

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K Views.  Heidelberg University. The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Video: A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengineering

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Neuroscience

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

ניתוח חדירות של מכשול המוח-הדם על ידי חציית מיקרודם באמצעות תאי מיקרו-כלי

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

מודל ממשק מוח-דם אנושי ללמוד מכשול המעברים על ידי פתוגנים או תרופות והאינטראקציה שלהם עם המוח

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central nervous system (CNS) by penetrating highly specialized brain endothelial cells (BECs). As Nm is a human-specific pathogen, the lack of robust in vivo model systems makes study of the host-pathogen interactions between Nm and BECs challenging and establishes a need for a human based model that mimics native BECs. BECs possess tighter barrier properties when compared to peripheral endothelial cells characterized by complex tight junctions and elevated trans-endothelial electrical resistance (TEER). However, many in vitro models, such as primary BECs and immortalized BECs, either lack or rapidly lose their barrier properties after removal from the native neural microenvironment. Recent advances in human stem-cell technologies have developed methods for deriving brain-like endothelial cells from induced pluripotent stem-cells (iPSCs) that better phenocopy BECs when compared to other in vitro human models. The use of iPSC-derived BECs (iPSC-BECs) to model Nm-BEC interaction has the benefit of using human cells that possess BEC barrier properties, and can be used to examine barrier destruction, innate immune activation, and bacterial interaction. Here we demonstrate how to derive iPSC-BECs from iPSCs in addition to bacterial preparation, infection, and sample collection for analysis.

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

The protocol described here highlights the major steps in the differentiating induced pluripotent stem-cell derived brain-like endothelial cells, the preparation of Neisseria meningitidis for infection, and sample collection for other molecular analyses.

Neisseria meningitidis זיהום של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי אנדותל במוח

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in neuroscience. As it is becoming increasingly clear that this tiny structure plays a crucial role in health and disease of the central nervous system (CNS), it is of utmost importance to properly dissect the CP out of the brain ventricles in a way that allows downstream processing, ranging from functional to structural analysis. Here, isolation of the lateral and fourth brain ventricle mouse CP without the need for specialized tools or equipment is described. This isolation technique preserves the viability, function, and structure of cells within the CP. On account of its high vascularization, the CP can be visualized floating inside the ventricular cavities of the brain using a binocular microscope. However, transcardial perfusion required for downstream analysis can complicate the identification of the CP tissue. Depending on the further processing steps (e.g., RNA and protein analysis), this can be solved by visualizing the CP via transcardial perfusion with bromophenol blue. After isolation, the CP can be processed using several techniques, including RNA, protein, or single cell analysis, to gain further understanding on the function of this special brain structure. Here, scanning electron microscopy (SEM) on whole mount CP is used to get an overall view of the structure.

The choroid plexus (CP), an understudied tissue in neuroscience, plays a key role in health and disease of the central nervous system. This protocol describes a microdissection technique for isolating the CP and the use of scanning electron microscopy to obtain an overall view of its cellular structure.

מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק הר שלם הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model systems. In most cases, chopstick electrodes are used to determine the electric impedance between the upper and lower compartment of a cell culture filter insert system containing cellular monolayers. The filter membrane allows the cells to adhere, polarize, and interact by building tight junctions. This technique has been described with a variety of different cell lines (e.g., cells of the blood-brain barrier, blood-cerebrospinal fluid barrier, or gastrointestinal and pulmonary tract). TEER measurement devices can be readily obtained from different laboratory equipment suppliers. However, there are more cost-effective and customizable solutions imaginable if an appropriate voltammeter is self-assembled. The overall aim of this publication is to set up a reliable device with programmable output frequency that can be used with commercially available chopstick electrodes for TEER measurement.

Here, we demonstrate how to set up an inexpensive volt-amperemeter with programmable output frequency that can be used with commercially available chopstick electrodes for transepithelial/endothelial electrical resistance measurements.

גישה פשוטה לבצע מדידות הטיר באמצעות עצמית וולט-אמפר מונה עם תדר פלט ניתן לתיכנות

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Biology

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls and restrict access to the brain parenchyma. However, with the development of nanotechnologies, large panels of new nanomaterials were developed to improve drug delivery, highlighting the need for reliable in vitro microsystems to predict brain penetration in the frame of preclinical assays. Here is a straightforward method to set up a microphysiological system to model the BBB using solely human cells. In its configuration, the model consists of a triple culture including brain-like endothelial cells (BLECs), pericytes, and astrocytes, the three main BBB cellular actors necessary to induce and regulate the BBB properties in a more physiological manner without the requirement of tightening compounds. The model developed in a 12-well plate format, ready after 6 days of triple culture, is characterized in physical properties, gene, and protein expressions and used for polymeric nanogel transport measurement. The model can be used for an extensive range of experiments in healthy and pathological conditions and represents a valuable tool for preclinical assessments of molecule and particle transport, as well as inter-and intracellular trafficking.

This protocol describes a method to establish a human blood-brain barrier (BBB) in vitro model. The endothelial cells and pericytes are seeded on each side of an insert filter (blood compartment), and astrocytes are seeded in the bottom well (brain compartment). The model characterized was used for nanoparticles transport experiments.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video