We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1.合成と準備のdsRNA <ol><li>何も識別可能なオフターゲット効果を持たないことが予測され、目的の遺伝子内（対応するdsRNAを生成する）200〜800 bpのノックダウンの領域を特定する（ 例えば 、別の遺伝子内の配列相同性≥18BP）および陰性対照（ 例えば 、 、このような大腸菌 lacZ遺伝子などの標的昆虫ゲノム（GenBankの遺伝子ID：945006）内に存在しない異種配列。あるいは、SRPN2 21,22として簡単に観察される表現型を、もたらすポジティブコントロール（ 例えば 、使用、GenBankの遺伝子ID：1270169）を標的とするdsRNA SRPN2の配列は、ミシェルらに定義されている（2005年）21。。 注：E-RNAiは、そのような領域の同定のためおよびオリゴヌクレオチドプライマー23の設計プロセスのために有用であるオープンソースのバイオインフォマティクスリソースです。 </li><li>秒を実行しますT7プロモーター配列に隣接するdsRNA合成テンプレート（5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;）を取得したdsRNA製剤を続行するゲノムDNAまたはcDNAテンプレートを用いtandard PCR増幅（ すなわち 、30〜35サイクルを使用して、Taq DNAポリメラーゼを用いて行った）とクリーンアップ、製造者の指示に従って、商業インビトロ転写キットを用いて。 らに提示されるようSRPN2 PCR増幅条件およびプライマーの情報を使用してください。（2011）22。 </li><li>波長260nmの紫外吸光分光法により精製されたRNAアンプリコンの収量を定量化し、RNaseフリー水で所望の濃度（ 例えば 、3μgの/μl）をに調整します。 <ol><li>低RNA濃度をトラブルシューティングするために、室温で真空遠心でサンプルをスピンダウンしてか、サンプルを凍結乾燥し、水のより少量で再構成することにより液量を減らします。サンプルの凍結乾燥に要する時間が依存して変化します初期試料容積とのdsRNA濃度に。 </li></ol></li><li> 1×TBEまたはTAEを用いて調製し、2％アガロースゲル上でのdsRNAの品質と長さを確認するバッファと転写反応に使用される鋳型DNAと共に、エチジウムブロマイド（EtBrを）で染色しました。 dsRNAは、鋳型DNAよりもゆっくりと移動します。品質および長さには、非特異的なdsRNA産物が存在しない保証することによって、それぞれの標準的なDNAマーカーを用いて製品を比較することによって評価することができます。 注：EtBrを、強力な変異原であり、それに応じて処理されるべきです。 注：/μlの3μgのののdsRNA濃度では、サンプルの0.5μlをEtBrを、染色アガロースゲル上で可視化のために十分以上です。 </li><li>必要になるまで-20℃でのdsRNAを保管してください。アリコートは、dsRNAの大量のために準備される必要がありますので、複数回の凍結/融解サイクルは、劣化を引き起こす可能性があります。 </li></ol> 2.ファストグリーンFCF染料（FGD）チューブを準備します<ol><li>ファストグリーンFCF色素を希釈RNaseフリー水中0.1％（v / v）の（使用液）の原液（≥85％の染料含有量）から。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブの底への色素のピペットで1μlの。 </li><li>約3時間65℃のヒートブロックに入れチューブを使用する前に冷却するために、少なくとも30分間室温で管を配置し、その後、液体蒸発します。この乾燥固体染料は、dsRNAの再懸濁溶液中に再構成します。 </li></ol> 3.プル注射針<ol><li> 10〜30μmでの先端径に加熱されたニードルプラーを使用してホウケイ酸ガラス針を引き出します。ノーヒーター調整：プル設定はに対応しています。 = 100 1、ヒーターの調整なし。 2 = 70。 </li><li>針の先端の細いへの損傷を避けるために、パテを成形するストリップ上のペトリ皿に水平にすべて引っ張ら針を配置します。 注：メソッドを引っ張るキャピラリ針のための追加情報は、マラリア研究およびリファレンス試薬リソースセンターMにさらに詳細に記載されていますR4マニュアル24。 </li></ol> 4.注入ステーションを準備します<ol><li>必要な材料を収集：ガラスマイクロキャピラリー針は、ペトリ皿、転送ピペット、ペイントブラシや光学顕微鏡を解剖、先端の細い、微量注入、薄いフィルター紙や厚手のろ紙に引っ張りました。 </li><li>マイクロインジェクターマニュアルの指示に従ってマイクロインジェクターを用意し、パルス当たりの所望の容量（ 例えば 、パルスあたり69 NLの最大値）に注入量を設定します。 </li><li>顕微鏡下で操縦するのは簡単であるプラットフォームでは（ 例えば 、発泡スチロールのチューブラックの平らな面）は、上に薄い濾紙で2つのフィルタ用紙をスタックし、エッジの周りにテープで固定します。 </li><li>氷の上の各のdsRNA別々の着色染料チューブ内の溶液、および場所の10μLを再懸濁します。 </li></ol> 5.注射用蛹を収集<ol><li>イオン交換水10ミリリットルと小さい60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿を記入し、〜50淡い蛹を収集（ドゥリ使い捨てのプラスチック製トランスファーピペットを用いて、昆虫館トレイから蛹化後の最初の24時間）ngの。 </li><li>ダークキューティクルの日焼けにメディアを持っている任意の蛹を削除します。 注：キューティクルは日焼けし始めると、それは非常に高い死亡率にクチクラ、射出結果を貫通することがより困難になります。 </li></ol> 6. dsRNAをインジェクション<ol><li>解剖顕微鏡下で、微細なピ​​ンセットで注射針の先端を断ちます。 </li><li> （3インチ、30ゲージ針で注射器を用いて）、およびマイクロインジェクターで余分な油を排出鉱物油で針を埋め戻すことにより、注射針を準備します。 </li><li>フロントdsRNAの最大量で注射針を記入し、液体の分配を確保するために、顕微鏡下で1パルスを取り出します。液体が取り込まれていないおよび/または追放された場合には、任意の閉塞のために、針の先端をチェックして、針がしっかりmicroinjectoに固定されていることを確認rを。 </li><li> 1-3蛹を選んで、ろ紙上に置いてください。 </li><li>絵筆を使用して、アクセス可能な背側クチクラでろ紙上の蛹を置き、ろ紙上にプッシュし、余分な水分を吸収するために絵筆を使用しています。 </li><li>絵筆の先端で蛹を安定化し、蛹の背面に関連して約30°の角度で胸部と腹部の間の背側クチクラに針を挿入します。注射は蛹の後端に向かうべきであり、針が前方対後方方向に移動させなければなりません。 </li><li>血リンパに3μgの/μlのdsRNAのソリューションの二つのパルス（パルスあたり69 NL）を注入し、そして体全体の色の分布を確認してください。何色が識別されない場合は、障害物からチップをクリアするためにわずかに注射針の位置を移動し、液体供給を繰り返します。 </li><li>優しく培養のために水の中に針から蛹を移動するために湿らせた絵筆を使用してください。 T彼は軽い接触時に絵筆に固執する必要があり蛹。 </li></ol> 7.ポスト噴射条件<ol><li>適切な空気の流れ（ 例えば 、メッシュケージまたはメッシュふた付き容器）と蚊のケージに注入された蛹でペトリ皿を置きます。蛹の飼育条件は、27±3℃の温度、75±5％の湿度で一貫したままと光の下でなければなりません：8時間：16の明暗サイクル。 </li><li> 10％（w / v）のグルコース溶液を用意し、大人の給電用の蚊ケージメッシュ上にソリューション飽和コットンボールを置きます。 </li></ol> 8.ノックダウンを評価します<ol><li>所望の時間点（s）で、対照と比較して、実験的なdsRNAを注入した昆虫に表現型を評価します。 <ol><li> 、-20℃で約2-3分間大人のダウン冷却する2℃のコールドプレートに転送し、15Xで解剖顕微鏡を利用して任意の擬似腫瘍形成を識別することによって、毎日dsSRPN2とdsLacZ昆虫を評価します明視野照明と倍率。評価後、昆虫館条件（27±3℃、75±5％の湿度）に大人を返します。 注：このプロトコルで用いた実験と対照dsRNAは、それぞれ、dsSRPN2とdsLacZです。コントロールに適した多くのオプションがあります。しかしながら、それが示唆された表現型および/ ​​または発現を容易におよび/ ​​または定量化[ 例えば 、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）、ウェスタンブロット]は使用されるべきである（ 例えば 、顕微鏡解剖によって）視覚化された陽性対照ウエスタンブロットおよび定量RT-PCRを介して、この技術。SRPN2タンパク質および転写物の定量を学習する際に、それぞれ、 ら。（2005）21ミシェルに記載されています。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplicity+of+malaria+transmission:+a+review+of+entomological+inoculation+rate+measurements+and+methods+across+sub-Saharan+Africa.">The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa.</a> Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).</li><li>The malERA Consultative Group on Vector Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Research+Agenda+for+Malaria+Eradication:+Vector+Control.">A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control.</a> PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).</li><li>Enyati, A., Hemmingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Management:+Past,+Present,+and+Future.">Malaria Management: Past, Present, and Future.</a> Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).</li><li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).</li><li>Mitchell, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+Target-Site+Mechanisms+Combine+to+Confer+Strong+DDT+Resistance+in+Anopheles+gambiae.">Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).</li><li>Knox, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+online+tool+for+mapping+insecticide+resistance+in+major+Anopheles+vectors+of+human+malaria+parasites+and+review+of+resistance+status+for+the+Afrotropical+region.">An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region.</a> Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).</li><li>Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+a+Chimeric+Chalcone+Synthase+Gene+into+Petunia+Results+in+Reversible+Co-Suppression+of+Homologous+Genes.">Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes.</a> Plant Cell. 2, 279-289 (2002).</li><li>Sen, G. L., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+RNAi:+the+silence+of+the+genes.">A brief history of RNAi: the silence of the genes.</a> FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).</li><li>Romano, N., Macino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quelling:+transient+inactivation+of+gene+expression+in+Neurospora+crassa+by+transformation+with+homologous+sequences.">Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.</a> Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Catteruccia, F., Levashina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+the+Malaria+Vector,+Anopheles+gambiae:+Therapeutic+Applications+of+RNAi:+Methods+and+Protocols.">RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols.</a> Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A).</a> gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+Olfactory+System+Development+through+Chitosan/siRNA+Nanoparticle+Targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/Interfering+RNA+Nanoparticle+Mediated+Gene+Silencing+in+Disease+Vector+Mosquito+Larvae.">Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae.</a> J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).</li><li>Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+RNAi+based+microalgal+larvicide+to+control+mosquitoes.">Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes.</a> Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).</li><li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control:+A+review.">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review.</a> J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).</li><li>Burand, J. P., Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi:+Future+in+insect+management.">RNAi: Future in insect management.</a> J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).</li><li>Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+SRPN2+facilitates+midgut+invasion+by+the+malaria+parasite+Plasmodium+berghei.">Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei.</a> EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Anopheles Research. , (2014).</li><li>Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+rearing+temperature+and+larval+density+on+larval+survival,+age+at+pupation+and+adult+size+of+Anopheles+gambiae.">Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).</li><li>Michel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+melanizing+activity+in+Anopheles+gambiae+does+not+affect+development+of+Plasmodium+falciparum.">Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).</li><li>Harker, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Profiling+Associated+With+Life+Cycle+of+Anopheles+gambiae.">Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).</li><li>Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+pupal-specific+cuticular+protein+genes+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).</li><li>Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pupal+cuticle+proteins+of+Manduca+sexta:+characterization+and+profiles+during+sclerotization.">Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).</li><li>Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+cuticular+genes+of+silkworm,+Bombyx+mori.">Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori.</a> BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).</li><li>Zhou, X., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+specifies+pupal+development+and+mediates+the+&amp;#34;status+quo&amp;#34;+action+of+juvenile+hormone+on+the+pupal-adult+transformation+in+Drosophila+and+Manduca.">Broad specifies pupal development and mediates the &amp;#34;status quo&amp;#34; action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.</a> Development. 129, 2259-2269 (2002).</li><li>Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+Toll+related+genes+during+development+and+immune+responses+in+Anopheles+gambiae.">Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).</li><li>Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-related+receptors+and+the+control+of+antimicrobial+peptide+expression+in+Drosophila.">Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).</li><li>Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CecC,+a+cecropin+gene+expressed+during+metamorphosis+in+Drosophila+pupae.">CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae.</a> Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).</li><li>Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Insect+Metamorphosis:+a+Microarray-Based+Study+of+Larval+and+Adult+Gene+Expression+in+the+Ant+Camponotus+Festinatus.">Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus.</a> Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).</li><li>Cook, P. E., Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes+for+adult+age+estimation.">Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation.</a> Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).</li><li>Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serpin+gene+family+in+Anopheles+gambiae.">The serpin gene family in Anopheles gambiae.</a> Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).</li><li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+the+salivary+gland+nitrophorin+2+in+the+triatomine+bug+Rhodnius+prolixus+(Hemiptera:+Reduviidae)+by+dsRNA+ingestion+or+injection.">RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).</li><li>Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+with+the+allatoregulating+neuropeptide+genes+from+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+and+its+effects+on+the+JH+titer+in+the+hemolymph.">RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph.</a> J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li></ol>

このビデオの記事のためのオープンアクセスは、Biogen社によって支払われます。

蚊に非トランスジェニックRNAiを誘導するための現在の方法は、成人の血体腔12,13またはRNAiトリガーコーティングされたナノ粒子14-17または微細藻類ベースのdsRNAが18を分子の幼虫の摂食へのdsRNAの直接注入を伴います。大人の蚊対象に、非常に貴重な一方で、以前の発育期間中に機能する多数の遺伝子を除外することができます。幼虫の摂食によって開始されたノックダウンは蛹を介して可変タンパク質の持続性の潜在的に、部分的に起因大人の段階で一貫性のない表現型をもたらすことができます。したがって、より完全に成人期の間の遺伝子機能を評価するために、遺伝子予め大人の発達段階の間の機能、ならびに強化された能力を評価するための手段を提供する蛹開発中のRNAiを開始する時に特異的に目的とする付加的な方法を導入します。 dsRNAを注入または発現に基づく遺伝子ノックダウンのアプローチと同様に、遺伝子の持続性はノックダウン予測することはできません。したがって、転写物またはタンパク質のレベルは、関心の発達期間中に目的の遺伝子のために評価されるべきです。我々はSRPN2 dsRNAを注入した動物にSRPN2のために5日目注射後にタンパク質レベルを減少させたの継続を観察しているが、このようなタンパク質の代謝回転および半減期などの要因が異なるターゲットで異なることができます。 dsRNAは、注射のために使用すること、ならびに、確保することが重要であるだけでなく濃縮し、アガロースゲル上でそのまま表示されます。私たちは、ノックダウンの結果が十分でない場合の実験者がこれらの要因を再評価をお勧めします、とdsRNAのそれぞれの濃度は、特定の遺伝子標的のために経験的にテストする必要があります。 我々はアンの蛹中にRNA干渉の開始のための方法を説明します。ハマダラカの開発。この方法は、直接、早期蛹の血体腔へのdsRNAのマイクロインジェクションを介して導入に依存しているとすることにより、注射品質の評価が可能色素標識dsRNAの使用。注射の質を視覚化する能力は、成功したノックダウンを確保するための重要な強化を構成し、成人期に焦点を当て、最も以前に報告されたdsRNAベースのプロトコルでは考慮されていない注入に基づく遺伝子ノックダウンの態様を構成します。この発達期間の開始時に蛹を標的とすることによって、この重要な発達期間中、または成人期の初期段階で役割を果たしている可能性がある遺伝子が機能的に評価することができます。さらに、この方法は、変態中にアクセスされている細胞内のdsRNAの細胞への送達、およびRNA干渉の確立を可能にするかもしれないが、完全に形成された大人の蚊でアクセスしにくいです。 ハーカーらによる最近のマイクロアレイ解析。（2012）560 アンを同定しました。アップレギュレートまたは胚から成人までの範囲の、異なる発生段階の間に少なくとも4倍ダウンレギュレートされたハマダラカ転写物。 56の0転写物が同定され、309のセットは、蛹の開発27の間にアップレギュレートされました。これらの知見は、蛹の段階で発生するもの、生物が変態を受け、その間に間隔を含む蚊の開発を通じてディファレンシャル遺伝子発現のための多くの要件が存在することを示唆しています。 アン含む多くの昆虫種、で。ハマダラカ 、このような開発（ すなわち 、蛹クチクラとキチン結合タンパク質）27-31、免疫応答のようなプロセスに関与する遺伝子（ すなわち 、トール受容体様タンパク質）27,32-34が非常に蛹の段階の間に発現されています。完全に形成された成体が出現したら、環境および生理学的に35の変化に応答して遺伝子発現が継続されます。特に、初期の大人の開発中に、発生遺伝子（ すなわち 、大人のクチクラと筋タンパク質）36、の発現の増加だけでなく、他の重要な遺伝子が存在する（ すなわち、 </em&gt;、精子特異的タンパク質およびシトクロムP450代謝酵素）27,36。 このプロトコル、SRPN2の開発に使用される陽性対照は、 アンです。ハマダラカセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）。 SRPN2は昆虫メラニン、昆虫21,22における幅広いスペクトル先天性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしています。擬似腫瘍形成21,22、容易に光学顕微鏡を使用することによって観察される表現型の大人の蚊結果のSRPN2のノックダウン。この明確な表現型は簡単に生昆虫で得点することができることを考えると、我々は初期の蛹のRNAiの注射のためにSRPN2を使用していました。また、SRPN2により早期成人蛹のRNAi注入と機能の評価のための良好な標的を提供し、すべての発育段階37の間に発現されます。我々は、我々が開発した方法は、同様の成人黒色偽のを誘導することができることを実証します<html>開発の蛹中に実行するdsRNA注射の結果としてのo-腫瘍形成。このプロトコルを開発する際に、我々は（ すなわち 、幼虫、蛹の脱皮後の最初の24時間）は、最適な羽化を得るために重要である早期蛹の開発時に、その注射を観察しています。貧しい出現は、注射後に得られた場合には、我々はあまり大規模なキューティクルの強化で蛹を取得し、早期蛹注入が達成される保証するために、より高い精度で幼虫をステージングすることをお勧めします。さらに、最適な出現率のキューティクル結果へのダメージを最小限に抑え、注入中に倍率を大きくすると、動物の唯一の意図した領域がパンクしていることを確認することができます。針が腹キューティクルまで穿刺した場合は、色素で標識された液体のプールは蛹の外側には明らかであろうか、ろ紙を飽和さ。非常に複数のキューティクル穿刺を持つ任意の蛹を破棄することをお勧めします。 大人の蚊注射の性能に多くの研究室の豊富な経験とjove_content &quot;&gt;、以前に同定されたマイクロインジェクションのアプローチは蛹RNAi実験で使用するための単純なプロトコルの変更に適合させることができる。全体的に、この方法の目的は、研究者の能力を提供することです遺伝的分析は、さらに新たなベクトル制御戦略の開発を支援する研究を可能にする、実行することができ、逆その間の時間枠を展開します。興味深いことに、このようなRhodniusのprolixusおよびヨトウガのような他の種での実験は、サイレンシング効果はあまりになる傾向があり、その遺伝子を明らかに前成体は38,39段の間に大きいとき、開発のあらゆる段階で、RNAiを介した遺伝子ノックダウンは、遺伝子サイレンシング、および標的遺伝子がコードするタンパク質の安定性の迅速性と持続性に関する考慮事項に従うものとします。開始。理想的なRNAi標的遺伝子はproteiをコードするものとなる傾向がありますnまたは短い半減期と高い離職率11,40を有しているRNA。 トランスジェニックRNAiの戦略はまた、前成体期中速さとRNAiの持続性に関する考慮事項に対処するために使用することができるが、遺伝子組換え技術は、昆虫を生成するために、蚊の交配のための多くの欠点（ 例えば 、トランスジェニック系統の生成に必要な時間、実験時間フレームを持っています規制dsRNA発現、およびトランスジェニック株のメンテナンス）で。これとは対照的に、我々のプロトコルは、蛹、開発中および発信や変態中にアクセス可能ですが、大人にはあまりアクセス可能な細胞型において遺伝子ノックダウンを開始するための簡単​​かつ迅速にする方法を提供します。色素標識のdsRNA懸濁液の使用は蛹内導入物質の注入の成功と分散の容易な評価が可能になります。大人のように注射した動物と比較して、蛹注入成人における腫瘍形成の発症に関する我々のデータは、初期化と一致しています蛹の段階でのRNAi媒介ノックダウンのiation。私たちのG3蚊ラインを使用して、私たちの昆虫館の条件下で、私たちは早くも10日のような大人の注射後の成人黒色擬似腫瘍形成を観察すると、3〜5日後に出現注入。早期蛹段噴射を行うことにより、我々は、早ければ5日後に注射（ すなわち 、3〜4日が出現後）として目に見える黒色擬似腫瘍形成を観察します。これらのデータは、この方法は以前の下で研究された発育期間（ すなわち 、蛹の開発）の間に遺伝子ノックダウンの開始を可能にすることを示唆しています。我々の色素標識法はまた、すべての幼虫齢時に表皮の半透明の性質に起因する新たな幼虫の注入プロトコルの開発に有用であろう。本研究で用いた制御は、ノックダウンの表現型を表示するには、成人期への進行を必要とするが、早期蛹の注射後の蛹特有の表現型を評価するための将来の実験が提供されますこのような後半蛹の開発など、追加の発育期間中に、この方法の拡張に関する貴重な洞察。要約すると、この方法は、RNAi媒介遺伝子ノックダウンの蛹開始のための貴重なRNAiのプロトコルを提供し、ベクトル昆虫研究コミュニティ内で使用可能な機能ゲノムツールを拡張します。

マラリアは毎年、個人の何百万人に影響を与える蚊が媒介する感染症です。世界保健機関（WHO）は2013年に5年1歳未満の子供に発生した78パーセントそのうちのマラリアによる約584000人の死亡があったことを報告しています。人間のマラリアを引き起こす病原体は、属マラリア原虫内アピコンプレクサ寄生虫であり、メスのハマダラカによって、その人のホスト間で伝送されます。蚊が感染している個体からの血液食事をとり、その後、堆積物は、その後の血液の食事に感染していない個体に寄生虫を感染性ときに送信が発生します。属ハマダラカの中では、 ハマダラカは最大ベクトル容量を持つ種で、サハラ以南のアフリカ1-3で最も著名なマラリアベクトルです。 現在、殺虫剤の展開によって蚊のベクトル制御は、bに続け人間のマラリアの負担を軽減するために採用の主要な方法を電子。 1960年代からの殺虫剤の使用は、非常に成功することが証明されたが、殺虫剤抵抗性の上昇は、新規な殺虫剤及び代替ベクトル制御戦略4-7の開発の必要性が駆動しています。 2010年に、WHOへの報告49 63の国の合計は、マラリアベクトル1の殺虫剤抵抗性の発生を示しました。さらに、Afrotropical地域における抵抗データを評価するための査読論文を利用IRマッパー・ツールは、2001年と2012年の間に、それぞれ7ピレスロイドとジクロロジフェニルトリクロロエタン（DDT）のに抵抗が46％と27％増加するが、そこにあったことを報告しています。 RNA干渉（RNAi）はペチュニア植物8,9及び真菌アカパンカビ 9,10中の遺伝子を不活性化するために利用することができる技術として1990年代初期に同定されました。その後まもなく、1998年に、RNAiは、最初の注射または給紙方法9,11を介してアンチセンスまたは二本鎖RNA（dsRNAを）の導入によって動物モデルにおける遺伝子発現を減少させる手段として、 線虫（Caenorhabditis elegans）に記載されていました。その発見以来、RNAiは、研究者が急速に高度に選択的な転写後遺伝子サイレンシング機構を介して目的の遺伝子の機能的役割を調査するために、逆遺伝学を利用できるようにすることで、機能ゲノミクスの追求に革命をもたらしました。このようなキイロショウジョウバエなどのいくつかの生物では、干渉RNAコンストラクトを発現するトランスジェニック生物の使用は、遺伝子ノックダウン（KD）のために広く成功しています。 アンでの導入遺伝子の使用が。 RNAiのためのハマダラカが利用されてきた大規模なスクリーンのため有用であることが判明し得る、トランスジェニック蚊株の生成は、労力と時間がかかり、一般generatiに関心のある遺伝子の同定から行くために2〜3ヶ月を取ることもあります適切なトランスジェニック株12の上。現在、 アンにおける遺伝子KDの主要な方法。ハマダラカは、dsRNAの、大人の段階で、血リンパへの注射によって与えられた遺伝子12,13に特異的です。このプロセスは、典型的には、はるかに迅速なトランスジェニック法12よりであることを証明し、遺伝子KDの評価に関心のある遺伝子の同定から行くために1ヶ月程度かかります。幼虫期のRNAiのための方法は、 アンで最近確立されています。ナノ粒子供給14-17を経由して、または微細藻類ベースのdsRNAの経口送達によるハマダラカとネッタイシマカは、開発の初期段階で機能的ゲノム解析を実行するための機会を提供し、18を分子。直接給電注射、およびナノ粒子の送達方法において、dsRNAは、標的細胞によって自律的に取り、21-25ヌクレオチド長の「短い干渉RNA」（siRNAの）19,20に酵素ダイサーによって切断します。これらのsiRNAは、その後ですincorporated RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）、一方の鎖は、RNA結合RISC複合体が結合し、標的mRNAを切断し、それによって、そのレベルを低下させ、その翻訳19,20を阻害することができ、廃棄されるから。 基本的な蚊の生物学の多くの本質的な特徴は、ホストの嗜好（ 例えば 、嗅覚、味覚）、交配、繁殖や免疫力を含め、ベクトルの容量を調節します。これらの生物学的プロセスの重要性を考えると、遺伝的または薬理学的なレベルで彼らの変調が殺虫剤抵抗性の回避を含む、ベクトル制御のための新たな機会を提供し、ベクトル管理に対するより広範に統合されたアプローチのための新しいツールを提供する可能性があります。これらの本質的な生物学的機能の根底にある遺伝子の役割を評価するための機能ゲノミクスの使用は、新しい標的の同定を可能にし、我々は効果的に新しい、より効果的な制御strategを作成することができますどのように新たな洞察を提供しますIES。我々はアンの蛹の段階でRNAiを開始するための迅速な注入方法の開発と使用を記載しています。ハマダラカ 。我々は、RNAiトリガーの蛹注入が早くノックダウン遺伝子が出芽後成人で開始された場合に観察されるよりも出芽後、 すなわち 、初期段階の成人で、得られた表現型の観察を可能にすることを確認します。この方法は蛹の発育期間中に始まると大人の段階に伸びる遺伝子ノックダウンを可能にし、蛹の開発中に開始ノックダウンなど、その遺伝子は、変態血リンパ-アクセス以上ある早期成人血リンパアクセス可能な細胞型、ならびに細胞型を持続し、影響を与えることができます出現を以下の成人付属で見つかったような感覚ニューロンのような大人、中より。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEGAscript RNAi kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II foot switch</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Narishigne</td>
			<td>PB-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1371150</td>
			<td>&#188; inch cut from tip to create a wider opening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman &#8220;thin&#8221; filter paper&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot &#8220;thick&#8221; filter paper</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>107-3931</td>
			<td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (size 0)</td>
			<td>Michael&#8217;s Art</td>
			<td>10474940</td>
			<td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting light microscope</td>
			<td>&#160;----&#160;</td>
			<td>-----</td>
			<td>This can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

遺伝子KD利回り注入が早い蛹の段階で行われ、最適な結果、キューティクル日焼けレベルが低いとき（ 図1Aは 、左、および1B）のための蛹の注射。注射（図1A、中央、右）後に増加蛹の死亡の結果は、一般的に24時間後に、キューティクルの日焼けと硬化を増加します。蛹の開発速度は昆虫館条件および動物密度24,25に依存して変化し得ます。したがって、それは視覚的に色素沈着を評価するのが最善です。 注入プロセスの間に、キャピラリ針は後方方向（ 図2A）の前方に約30°の角度で背側クチクラ中に挿入されます。針が挿入されたdsRNA + 0.01％された後（w / v）のFGDが分配され、染料の分布は（体液を通じてFigu明らかです）2B再。 FGD（w / v）の0.01％を注射した蛹のための羽化の評価は、非注射対照の96.7パーセントの出現（ 図3A）に比べ、70％の出現の平均レートを明らかにしました。注目すべきは、蛹のケースから部分的な出現は、非生存蚊（ 図3B）の多数の観察されました。注射された動物は、出現時間の遅延なし（ 図4A）またはいずれかの性別（ 図4B）に偏った影響を示しません。大人の生存の追加の評価は、10発芽後は、発芽後の大人の生存（ 図4C）には明らかな影響を示さない日まで実施しました。 KD品質の検証はノックダウンとの陽性対照として21,22をノックダウンSRPN2に関連付けられた黒色の疑似腫瘍（濃く着色された組織のクラスタ）表現型によって評価しました<html>ネガティブコントロールとしてdsLacZ注入に関連した表現型の不在。登場大人蚊が後8日目の注射（日6-7出芽後）で採点しました。黒色擬似腫瘍（ 図5Aおよび5B）は dsSRPN2対の93.5パーセントのクチクラを通して観察されましたdsLacZ大人の蚊（ 図6A）の0％。暗くメラニン組織のクラスタは、着色されたパッチ（ 図5C）の解剖時に同定されました。擬似腫瘍が早くも3日目発芽後のような大人のキューティクルに表示されていたともdsSRPN2体液や腸組織のサブセットに存在した（データは示さず）。 5ポスト噴射（早期成人期）では、有意dsSRPN2にSRPN2レベルの低下はなく、dsLacZまたは非注射体液タンパク質単離物を、（ 図6B）が観察されました。 ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：蛹のdsRNAを注入するための発達ステージング大人の段階に最適な生存および進行中のdsRNA結果の早期蛹注入。表皮の色素沈着（A、左、及びB）の低いレベルは、蛹化後の最初の0~24時間以内に観察することができます。貧しい人々の生存に中等度で蛹クチクラ前回の噴射（A、中央、右）結果の日焼け。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> 図2：前方に約30°の角度で注入位置と背側クチクラへの色素で標識されたdsRNAの色素標識のdsRNA（A）キャピラリ針注射の分布は 、方向を後方します。 （B）染料は可視蛹体液に分布しています。 0.01％Fで標識された138 NLのdsRNAの注入量、GD（W / V）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> 図3：ポスト噴射羽化 （A）非注射対照（N = 60）の96.7パーセントと比較して0.01％のFGD（w / v）の成功した出現（N = 60）、を注射した蛹の70％。三つの生物学的複製を行いました。蛹ケースから（B）部分的出現は、非生存蚊多数観察されました。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> 図4：出現率、性別の評価と大人の生存率 （A）非注射蛹と比較して、同等の出現時間は、0.01％のFGD（24時間= 80％と48時間= 20％）と蛹の注射後に観察された（24。時間= 83％と48時間= 17％）。 （B </strオング&gt;）とほぼ等しいオスとメスの成体出現は0.01％FGD注入蛹（女性= 48％と男性= 52％）と非注射蛹（女性= 52％と男性= 48％）が観察されました。 （C）生存分析は0.01％FGDの注射は10日出芽後まで評価し、大人の生存に影響を与えないことが明らかになりました。結果は、0.01％FGD注射した（n = 60）および非注入（N = 60）蛹（男性と女性の同数）との3つの独立した実験からのデータを表します。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> 図5：擬似腫瘍陽性対照表現型は、成功したノックダウンを反映した疑似腫瘍は、（A）腹部と-injected dsSRPN2の（B）胸部キューティクルに観察されたが、8日目、注入後に-injected大人の蚊をdsLacZされませんでした。（C）高倍率（400X）キューティクルや色素性パッチの解剖のイメージング（a）が （b）は暗くメラニン細胞のクラスターを明らかにしています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> 図6：擬似腫瘍形成の定量とSRPN2タンパク質レベルを減少させた （A）蛹ステージ注射はdsSRPN2の成人の93.5パーセントに擬似腫瘍形成をもたらす（N = 21）dsLacZコントロールの0％と比較した（n = 19）。 。結果は、8日目、注入後に得られます。 （B）ウェスタンブロット（左）のショーはdsSRPN2にSRPN2レベルの低下はなく、dsLacZまたは非注射体液タンパク質分離（5日目注射後）。 3つの独立した実験に基づく結果。アンチSRPN2 21及び使用される抗SRPN3 26抗体希釈液1であった：1000〜1：2000、それぞれ。ヤギ抗RA5000：BBITのIgG-HRP（製品SC-2004、サンタクルスバイオテクノロジー、ダラスTX）を1で使用しました。すべてのタンパク質レベルは、 対応のないt検定により比較して統計的にSRPN3にバンド強度（ImageJのソフトウェア、NIH、ベセスダ、MD）、正規化によって（右）定量化、およびされました。 P &lt;0.05：*、P≥0.05：NS（有意ではありません）。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表します。

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae at JoVE.com

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.0K ビュー.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

ビデオ: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

生物学

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

ローカライズされたRNAiと創薬リーチにおける外来遺伝子の発現が

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAiのエフェクターの細菌配達：Transkingdom RNAiの

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

RNAiのトリガ配信へ

要約

さらに動画を探す

この動画の章