We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

סינתזה 1. הכנת dsRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהוי אזור 200-800 נ&quot;ב מציאה (על מנת ליצור את dsRNA המקביל) בתוך הגן של עניין כי הוא נבא כי אין השפעות חוץ-המטרה מזוהות (למשל, לא נ&quot;ב רצף הומולוגיה ≥18 בתוך גן אחר) ו שליטה שלילית (למשל , רצף Heterologous כי הוא אינו נוכח בתוך הגנום חרק היעד, כגון הגן lacZ Escherichia coli (GenBank ג&#39;ין מזהה: 945,006). לחלופין, להשתמש כביקורת חיובית (למשל, אשר מניב פנוטיפ ציין בקלות, כגון SRPN2 21,22 ג&#39;ין מזהה, GenBank:. 1270169) רצף של SRPN2 מיקוד dsRNA מוגדר מישל ואח &#39;(2005) 21.. הערה: E-RNAi הוא משאב bioinformatic קוד פתוח כי הוא שימושי עבור זיהוי של אזורים כאלה ועבור בתהליך של תכנון פריימרים oligonucleotide 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע standard PCR הגברה (כלומר, הופיעה עם תקי DNA פולימראז באמצעות 30-35 מחזורים) באמצעות הדנ&quot;א הגנומי או תבנית cDNA להשיג תבנית סינתזה dsRNA מוקף רצף האמרגן T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) ו ממשיך בהכנות dsRNA ו לנקות בעזרת ערכת שעתוק מסחרית במבחנה לפי הוראות יצרן. השתמש SRPN2 PCR תנאי הגברה ומידע פריימר כפי שהוצג ב An et al. (2011) 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תשואות amplicon RNA מטוהרים על ידי ספקטרוסקופיה ספיגת אולטרה סגול באורך גל של 260 ננומטר ולהתאים את הריכוז הרצוי (למשל, 3 מיקרוגרם / μl) במים RNase חינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון בעיות ריכוזים RNA נמוך, להפחית נפח הנוזל על ידי ספינינג דגימות למטה בצנטריפוגה ואקום בטמפרטורת החדר או על ידי lyophilizing דגימות reconstituting בכמויות קטנות יותר של מים. הזמן הדרוש lyophilization מדגם ישתנה בהתאםעל כרכי מדגם ראשונים ריכוזי dsRNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות ואורך של dsRNA על ג&#39;ל 2% agarose מוכן עם 1x TBE או טה חיץ מוכתם ברומיד ethidium (EtBr), יחד עם תבנית ה- DNA משמש התגובה שעתוק. DsRNA יהגר לאט יותר תבנית ה- DNA. איכות ואורך ניתן להעריך על ידי ומבטיח לא קיימים מוצרים dsRNA הלא ספציפית על ידי השוואת מוצרים בטוש DNA סטנדרטי, בהתאמה. הערה: EtBr הוא mutagen חזק יש לטפל בהתאם. הערה: בריכוז dsRNA של 3 מיקרוגרם / μl, 0.5 μl של המדגם הוא יותר מהדרוש להדמיה על הג&#39;ל agarose מוכתם EtBr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן dsRNA ב -20 ° C עד הצורך. מחזורי הקפאה / פשרה מרובות עלולים לגרום שפלה, כך aliquots אמור להיות מוכן עבור כמויות גדולות של dsRNA. </li></ol> 2. כן המהיר גרין FCF דיי (FGD) צינורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל צבע ירוק FCF מהירמפתרון המניות (תוכן לצבוע ≥85%) ל -0.1% (v / v) (הפתרון עובד) במים RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 μl של צבע לתוך החלק התחתון של צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צינורות בתוך גוש חום 65 מעלות צלזיוס למשך כ 3 שעות להתאדות צינורות במקום נוזל, אז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, כדי לקרר לפני השימוש. מוצק צבע יבש זה יהיה לשקם בתמיסה resuspension dsRNA. </li></ol> 3. מחט הזרקת Pull <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים זכוכית בורוסיליקט באמצעות חולץ מחט מחוממת בקוטר טיפ של 10-30 מיקרומטר. משוך הגדרות מתאימות: מחמם התאמה לא. 1 = 100, התאמת מחמם לא. 2 = 70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע ניזק טיפ הנאה של המחט, למקם את כל מחטי המשך אופקיים בצלחת פטרי על רצועת קריצה מרק. הערה: פרטים נוספים על מחט נימי משייכת שיטות ניתן למצוא פרטים נוספים על מחקר המלריה והפנית מגיב מרכז משאבי MR4 ידנית 24. </li></ol> 4. כן תחנת הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף חומרים דרושים: מחטי הזכוכית microcapillary משכו עד קצה קנס, microinjector, נייר סינון דק נייר סינון עבה, צלחות פטרי, טפטפות העברה, מברשת צבע מיקרוסקופ אור לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את microinjector כפי שהורה במדריך microinjector, ולהגדיר נפח הזרקת נפח רצוי לכל דופק (למשל, לכל היותר 69 nl לכל דופק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פלטפורמה קלה לתמרן במיקרוסקופ (למשל, צד שטוח של מתלת צינור קלקר), לערום את גיליונות נייר שני פילטר עם נייר הסינון הדק על גבי, ובטוח עם קלטת מסביב לקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 10 μl של כל פתרון dsRNA צינורות לצבוע בצבע נפרד, ומניחים על קרח. </li></ol> 5. איסוף גלמים עבור הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים קטן 60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי עם 10 מ&quot;ל של מים ללא יונים, ולאסוף ~ 50 גלמים חיוור (דוריng התגלמות 24 שעות לאחר הראשון) מתוך מגש insectary בעזרת פיפטה העברת פלסטיק חד פעמיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלמים שיש בינוני עד שיזוף לציפורן כהה. הערה: לאחר לציפורן מתחילה להשתזף, הוא הופך להיות יותר קשה לחדור לציפורן, ותוצאות הזרקה קטלנית גבוהה בהרבה. </li></ol> 6. הזרקת dsRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתח, לנתק את קצה דיסטלי של מחט הזריקה עם זוג מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחט הזריקה ידי למלא את משבצות המחט עם שמן מינרלים (באמצעות מזרק עם מחט 3 אינץ &#39;, 30 מד), וגירוש עודפי שמן עם microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזית למלא מחט זריקה עם סכום מקסימאלי של dsRNA, והוצא דופק אחד תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את המחלק של נוזל. בכל מקרה שבו לא נוזלי נלקח למעלה / או גורשו, לבדוק את קצה דיסטלי של המחט עבור כל חסימה ולהבטיח כי המחט מאובטח היטב microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 1-3 גלמים, ומניחים אותם על נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המכחול, מקם את הגלמים על נייר פילטר עם גב לציפורן נגיש, ולהשתמש במכחול לדחוף על נייר סינון ולספוג של עודפי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצב את הגולם עם קצה המכחול, ולהכניס את המחט לתוך לציפורן הגבה בין בית החזה והבטן בזווית של כ 30 מעלות ביחס לפני השטח הגבי של הגולם. הזרקת צריכה להיות מופנית כלפי הקצה האחורי של גולם ואת המחט צריך להתרגש בכיוון הקדמי אל האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק שני פולסים (69 nl לכל הדופק) של 3 מיקרוגרם / פתרון dsRNA μl לתוך hemolymph, ולבדוק לחלוקת צבע בכל הגוף. אם אין צבע מזוהה, להעביר את מיקום המחט הזרקת מעט כדי לנקות את קצה מחסימה וחזור משלוח נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מכחול הרטוב לעבור גולם בעדינות את המחט לתוך מים עבור culturing. Tהוא גולם צריך להיצמד המכחול לנוגע אור. </li></ol> 7. תנאים לאחר הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי עם גלמים מוזרק לתוך כלוב יתושים עם זרימת אוויר מתאים (למשל, כלוב רשת או מיכל עם מכסה רשת). תנאי גידול גלמי צריכים להישאר עקבי 27 ± 3 ° C טמפרטורה, 75 לחות ± 5% ולהיות תחת אור: חושך מחזור של 16: 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10% (w / v) פתרון גלוקוז, ומניח כדור צמר גפן רווי פתרון כלוב יתושי רשת האכלה מבוגרת. </li></ol> 8. הערכת מציאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב נקודות הרצוי (ים), להעריך פנוטיפים בחרקים ניסיוני dsRNA מוזרק, בהשוואה לקבוצת הביקורת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך חרקי dsSRPN2 ו dsLacZ מדי יום על ידי מצמרר למטה מבוגרים במשך כ 2-3 דקות ב -20 מעלות צלזיוס, והעביר צלחת קרה ב -2 מעלות צלזיוס וזיהוי כל היווצרות פסאודו-סרטנית על ידי ניצול של מיקרוסקופ לנתח ב 15Xגדלה עם תאורת brightfield. לאחר הערכה, לחזור מבוגרים לתנאי insectary (27 ± 3 מעלות צלזיוס, 75 ± 5% לחות). הערה: dsRNAs הניסיון ושליטה מועסק בפרוטוקול זה dsSRPN2 ו dsLacZ, בהתאמה. ישנן אפשרויות רבות מתאימות שולטים; עם זאת, הוא הציע כי שליטה חיובית עבורו פנוטיפ ו / או הביטוי היא דמיינו בקלות (למשל, על ידי לנתח מיקרוסקופיה) ו / או לכמת [למשל, בזמן אמת PCR כמותי (qRT-PCR), כתם המערבי] אמור לשמש כאשר לומדים את הטכניקה הזו. חלבון SRPN2 וכימות תמליל באמצעות כתם המערבי qRT-PCR, בהתאמה, מתוארים מישל et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplicity+of+malaria+transmission:+a+review+of+entomological+inoculation+rate+measurements+and+methods+across+sub-Saharan+Africa.">The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa.</a> Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).</li><li>The malERA Consultative Group on Vector Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Research+Agenda+for+Malaria+Eradication:+Vector+Control.">A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control.</a> PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).</li><li>Enyati, A., Hemmingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Management:+Past,+Present,+and+Future.">Malaria Management: Past, Present, and Future.</a> Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).</li><li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).</li><li>Mitchell, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+Target-Site+Mechanisms+Combine+to+Confer+Strong+DDT+Resistance+in+Anopheles+gambiae.">Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).</li><li>Knox, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+online+tool+for+mapping+insecticide+resistance+in+major+Anopheles+vectors+of+human+malaria+parasites+and+review+of+resistance+status+for+the+Afrotropical+region.">An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region.</a> Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).</li><li>Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+a+Chimeric+Chalcone+Synthase+Gene+into+Petunia+Results+in+Reversible+Co-Suppression+of+Homologous+Genes.">Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes.</a> Plant Cell. 2, 279-289 (2002).</li><li>Sen, G. L., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+RNAi:+the+silence+of+the+genes.">A brief history of RNAi: the silence of the genes.</a> FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).</li><li>Romano, N., Macino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quelling:+transient+inactivation+of+gene+expression+in+Neurospora+crassa+by+transformation+with+homologous+sequences.">Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.</a> Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Catteruccia, F., Levashina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+the+Malaria+Vector,+Anopheles+gambiae:+Therapeutic+Applications+of+RNAi:+Methods+and+Protocols.">RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols.</a> Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A).</a> gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+Olfactory+System+Development+through+Chitosan/siRNA+Nanoparticle+Targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/Interfering+RNA+Nanoparticle+Mediated+Gene+Silencing+in+Disease+Vector+Mosquito+Larvae.">Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae.</a> J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).</li><li>Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+RNAi+based+microalgal+larvicide+to+control+mosquitoes.">Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes.</a> Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).</li><li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control:+A+review.">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review.</a> J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).</li><li>Burand, J. P., Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi:+Future+in+insect+management.">RNAi: Future in insect management.</a> J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).</li><li>Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+SRPN2+facilitates+midgut+invasion+by+the+malaria+parasite+Plasmodium+berghei.">Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei.</a> EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Anopheles Research. , (2014).</li><li>Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+rearing+temperature+and+larval+density+on+larval+survival,+age+at+pupation+and+adult+size+of+Anopheles+gambiae.">Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).</li><li>Michel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+melanizing+activity+in+Anopheles+gambiae+does+not+affect+development+of+Plasmodium+falciparum.">Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).</li><li>Harker, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Profiling+Associated+With+Life+Cycle+of+Anopheles+gambiae.">Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).</li><li>Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+pupal-specific+cuticular+protein+genes+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).</li><li>Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pupal+cuticle+proteins+of+Manduca+sexta:+characterization+and+profiles+during+sclerotization.">Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).</li><li>Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+cuticular+genes+of+silkworm,+Bombyx+mori.">Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori.</a> BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).</li><li>Zhou, X., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+specifies+pupal+development+and+mediates+the+&amp;#34;status+quo&amp;#34;+action+of+juvenile+hormone+on+the+pupal-adult+transformation+in+Drosophila+and+Manduca.">Broad specifies pupal development and mediates the &amp;#34;status quo&amp;#34; action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.</a> Development. 129, 2259-2269 (2002).</li><li>Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+Toll+related+genes+during+development+and+immune+responses+in+Anopheles+gambiae.">Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).</li><li>Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-related+receptors+and+the+control+of+antimicrobial+peptide+expression+in+Drosophila.">Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).</li><li>Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CecC,+a+cecropin+gene+expressed+during+metamorphosis+in+Drosophila+pupae.">CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae.</a> Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).</li><li>Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Insect+Metamorphosis:+a+Microarray-Based+Study+of+Larval+and+Adult+Gene+Expression+in+the+Ant+Camponotus+Festinatus.">Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus.</a> Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).</li><li>Cook, P. E., Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes+for+adult+age+estimation.">Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation.</a> Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).</li><li>Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serpin+gene+family+in+Anopheles+gambiae.">The serpin gene family in Anopheles gambiae.</a> Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).</li><li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+the+salivary+gland+nitrophorin+2+in+the+triatomine+bug+Rhodnius+prolixus+(Hemiptera:+Reduviidae)+by+dsRNA+ingestion+or+injection.">RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).</li><li>Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+with+the+allatoregulating+neuropeptide+genes+from+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+and+its+effects+on+the+JH+titer+in+the+hemolymph.">RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph.</a> J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li></ol>

גישה פתוחה עבור מאמר וידאו זה הוא שלם על ידי ביוג&#39;ן.

שיטות קיימות כיום גרימה הלא מהונדס RNAi ב יתושים כרוכים הזרקה ישירה של dsRNA לתוך מבוגר hemocoel 12,13 או האכלת זחל של RNAi מצופה הדק חלקיקי 14-17 או microalgae מבוסס dsRNA מולקולות 18. מיקוד היתוש הבוגר, בעוד יקר מאוד, יכול לכלול מספר רב של גנים שפועלים בתקופות התפתחותי מוקדם יותר. מציאה ביוזמת האכלת זחל עשויה להניב פנוטיפים עקביים במהלך לשלב הבוגר הנובע, בין שאר, על הפוטנציאל של התמדת חלבון משתנית דרך שלב הגלמים. לכן, מציג שיטה נוספת כי הוא מכוון באופן ספציפי על ייזום RNAi במהלך התפתחות גלמי יספק אמצעי באופן מלא יותר להעריך פונקציות גנים במהלך שלבי התפתחות טרום מבוגר, כמו גם יכול משופרים להעריך תפקוד גן בשלבי בוגרים. כמו עם גישת גן מציאה המבוססת על הזרקת dsRNA או ביטוי, ההתמדה של גן המציאהלא ניתן לחזות. לכן, רמות תעתיק או חלבון יש לבחון עבור הגן של עניין בתקופות ההתפתחותי של עניין. למרות שאנו רואים המשך של ירידה ברמות חלבון ביום 5 לאחר ההזרקה עבור SRPN2 ב SRPN2 חיות dsRNA מוזרקות, גורמים כגון מחזור חלבון מחצית חיים יכולים להיות שונים עבור מטרות שונות. זה קריטי כדי להבטיח, כמו גם, כי dsRNA לשמש להזרקה הוא גם מרוכז ומופיע ללא פגע על ג&#39;ל agarose. אנו ממליצים הנסיינים מחדש גורמים אלה אם תוצאות מציאה אינן מספיקות, וריכוזים בהתאמה של dsRNA ייתכן שיהיו הצורך להיבדק באופן אמפירי עבור מטרות גן ספציפיות. אנו מתארים שיטה לייזום של התערבות RNA בשלב הגלמים של An. פיתוח gambiae. שיטה זו מסתמכת על כניסתה באמצעות microinjection של dsRNA ישירות לתוך hemocoel של גלמים מוקדמים ומאפשרת הערכה של איכות הזרקה ידישימוש dsRNA שכותרתו לצבוע. היכולת לחזות איכות הזרקה מהווה שיפור חיוני להבטחת מציאה מוצלחת ומהווה היבט של מציאת גן מבוסס הזרקה כי לא נדונה פרוטוקולים ביותר שדווחו בעבר מבוסס dsRNA התמקדות בשלב הבוגר. על ידי מיקוד הגולם בתחילת תקופה התפתחותית זו, גנים שעשויים לשחק תפקיד בפרק זמן התפתחותי קריטי זה, או במהלך השלבים המוקדמים של בגרות ניתן להעריך מבחינה תפקודית. בנוסף, שיטה זו עשויה לאפשר משלוח dsRNA לתאים, והקמת התערבות RNA בתאים נגישים במהלך המטמורפוזה, אבל פחות נגישה יתושים בוגרים נוצרו באופן מלא. ניתוח microarray לאחרונה על ידי הארקר et al. (2012) זיהו 560 An. תמלילי gambiae שהיו למעלה מוסדר או למטה מוסדר על ידי פי 4 לפחות בשלבים התפתחותיים שונים, הנעים בין העובר לבוגר. של 560 תמלילים מזוהים, סט של 309 היה למעלה מוסדר במהלך התפתחות גלמי 27. ממצאים אלה מראים כי יש דרישות רבות עבור ביטוי גני הפרש לאורך פיתוח יתושים, כוללות אלה המתרחשים בשלב הגלמים, מרווח שבמהלכו האורגניזם עובר מטמורפוזה. במינים רבים של חרקים, כולל. gambiae, גנים המעורבים בתהליכים כגון פיתוח (כלומר, cuticular גלמי וחלבונים קושרי כיטין) 27-31 התגובה החיסונית (כלומר, חלבונים דמויי קולטן אגרה) 27,32-34 מתבטאים ביותר בשלב גלמי. לאחר מבוגר מגובש לגמרי התפתח, שם הוא המשיך ביטוי גנים בתגובה סביבתי פיסיולוגי משנה 35. יש לציין, במהלך ההתפתחות הבוגרת מוקדם, יש עלייה בביטוי של גנים התפתחותיים (כלומר, cuticular מבוגר וחלבונים sarcoplasmic) 36, וכן גנים מרכזיים אחרים (כלומר </em&gt;, חלבון הזרע ספציפי ציטוכרום P450 אנזימי מטבוליזם) 27,36. הביקורת החיובית לשמש בפיתוח של זה פרוטוקול, SRPN2, הוא An. מעכב פרוטאז סרין gambiae (סרפין). SRPN2 ממלא תפקיד חשוב בוויסות שלילית של melanization חרקים, תגובה חיסונית מולדת קשת רחבה בחרקים 21,22. מציאה של SRPN2 בתוצאות יתושים בוגרים היווצרות פסאודו גידול 21,22, פנוטיפ כי הוא ציין בקלות על ידי השימוש במיקרוסקופ אור. בהתחשב בכך פנוטיפ המובחן זה יכול להיות בקיע בקלות חרקי חיים, השתמשנו SRPN2 זריקות RNAi בשלב גלמים ראשוניים. בנוסף, SRPN2 מתבטא במהלך כל שלבי התפתחות 37, ובכך לספק מטרה טובה להזרקת RNAi בשלב גלמים והערכה של תפקוד אצל מבוגר מוקדם. אנו מראים כי השיטה שפיתחנו מסוגלת pseud דומה למבוגרים melanotic התרמה<html> היווצרות o גידולים כתוצאת זריקות dsRNA בצעו בשלב הגלמים של פיתוח. בפיתוח פרוטוקול זה, ראינו הזרקה כי במהלך התפתחות גלמי מוקדם (כלומר, השעה 24 הראשונים שלאחר נשירת זחל-הגלמים) היא קריטית להשגת הופעתה המבוגרת אופטימלית. במקרה הופעתה עניה מתקבלת לאחר הזרקה, מומלץ זמני זחלים עם דיוק רב יותר, כדי להשיג גלמים עם התקשות לציפורן נרחבת פחות ולהבטיח הזרקה בשלב גלמים מוקדם מושגת. יתר על כן, מזעור ניזק התוצאות לציפורן בשיעורי הופעתה אופטימליים גדלת הגדלה במהלך ההזרקה יכול לעזור להבטיח שהאזור המיועד אך ורק של החיה הוא נקב. אם המחט צריכה לנקב דרך לציפורן הגחון, והאיגום הנוזל צבען שכותרתו יהיה ניכר על הצד החיצוני של הגולם או יהיה להרוות את נייר הסינון. מומלץ מאוד להשליך מעליו כל גלמים שיש להן יותר לנקב לציפורן אחת. jove_content &quot;&gt; עם החוויות הנרחבות של מעבדות רבות עם הביצועים של זריקות יתושים בוגרות, גישות microinjection זוהו בעבר ניתן להתאים עם שינויי פרוטוקול פשוטים לשימוש בניסויי RNAi גלמים. בסך הכל, המטרה של שיטה זו היא לספק לחוקרים את היכולת ניתן לבצע להרחיב את מסגרת הזמן שבמהלכה הפוכה אנליזה גנטית, נוסף המאפשר מחקר יתמוך בפיתוח של אסטרטגיות בקרת וקטור הרומן. מעניין לציין, כי ניסויים במינים אחרים, כגון Rhodnius prolixus ו frugiperda Spodoptera, לחשוף גן תופעות השתקה נוטים להיות הרבה יותר באופן יזום במהלך מבוגר מראש טיולי 38,39. במהלך כל שלבי פיתוח, הגן בתיווך RNAi מציאה כפוף לשיקולים בדבר המהירות וההתמדה של להשתקת גנים, ואת היציבות של חלבונים המקודדים על ידי גנים ממוקדים. מטרת RNAi האידיאלית גנים נוטים להיות אלה לקודד protein או RNA כי יש זמן מחצית חיים קצר ושיעור תחלופה גבוהה 11,40. בעוד אסטרטגיות RNAi מהונדסות יכולות להיות מועסקות גם לטפל שיקולים לגבי מהירות והתמדה של RNAi בשלבי טרום מבוגר, טכניקות מהונדסות יש חסרונות רבים (למשל, זמן הנדרש לייצור קווים מהונדסים, מסגרות זמן ניסוי עבור הזדווגויות יתושים לייצר חרקים עם ביטוי dsRNA מוסדר, ותחזוקה של מניות מהונדסות). לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מספק לו שיטה קלה ומהירה עבור ייזום מציאת גן במהלך התפתחות גלמי ו בסוגי תאים שמקורם והם נגישים במהלך המטמורפוזה אבל הם פחות נגישים במבוגרים. שימוש השעיות dsRNA שכותרתו לצבוע מאפשר הערכה קלה של הצלחת הזרקה ופיזור החומר הציג בתוך גלמים. הנתונים שלנו על תחילת היווצרות גידולים אצל מבוגרי גלמים מוזרקים, לעומת חיות המוזרקות כמבוגרים, עולים בקנה אחד עם initiation של RNAi בתיווך מציאה בשלב הגלמים. באמצעות קו יתוש G3 שלנו ובתנאי insectary שלנו, אנו רואים את ההיווצרות פסאודו גידול melanotic המבוגר מוקדם ככל 10 ימים לאחר ההזרקה של מבוגרים מוזרקות שלושה עד חמישה ימים הופעתה פוסט. על ידי ביצוע הזרקה גלמי בשלב מוקדם, אנו צופים היווצרות פסאודו הגידול melanotic גלוי מוקדם ככל חמישה ימים לאחר ההזרקה (כלומר, שלושה עד ארבעה ימים לפרסם הופעתה). נתונים אלו מרמזים כי שיטה זו מאפשרת התחלת מציאת הגן במהלך תקופה התפתחותית תת למדה בעבר (כלומר, פיתוח גלמים). שיטת התיוג לצבוע שלנו יכולה להיות יעילה גם עבור פיתוח פרוטוקולי הזרקת זחל חדשים, בשל האופי השקוף של לציפורן במהלך כל instars הזחל. בעוד השליטה בשימוש במחקר זה דורשת התקדמות לתוך לשלב בוגר כדי להציג פנוטיפ מציאה, בניסויים עתידיים להעריך פנוטיפים בשלב ספציפי גולם לאחר הזרקה של גלמים מוקדם תספקתובנה חשובה לגבי ההתרחבות של שיטה זו לתוך תקופות התפתחותיות נוספות כגון פיתוח גלמים מאוחר. לסיכום, שיטה זו מספקת פרוטוקול RNAi ערך עבור ייזום בשלב גלמים של מציאת גן בתיווך RNAi ומרחיבה את כלי גנום התפקודי זמין לשימוש בתוך קהילת מחקר חרקי וקטור.

מלריה היא מחלה זיהומית יתושים המשפיעה מיליונים רבים של אנשים בכל שנה. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מדווח כי בשנת 2013 היו כ 584,000 מקרי מוות עקב מלריה, 78 אחוזים מהם התרחשו אצל ילדים מתחת לגיל חמש שנים 1. הפתוגנים שגורמים מלרית אדם הם טפילים נבגוניות בתוך Plasmodium הסוג והם מועברים בין מארחי האדם שלהם על ידי יתושי אנופלס נקבה. הילוכים מתרחשים כאשר היתוש לוקח ארוחת דם ביחיד נגוע, ולאחר מכן פיקדונות טפילים מזהם בתוך אדם נגוע בארוחת דם עוקבת. בתוך הסוג אנופלס, אנופלס gambiae הוא המין עם קיבולת וקטורים הגדולה הוא וקטור מלריה הבולטים באפריקה שמדרום לסהרה 1-3. נכון לעכשיו, בקרת וקטור יתושים על ידי פריסה של הדברה ממשיכה bדואר השיטה הגדולה מועסקת על מנת להפחית את הניטל של מלרית אדם. למרות השימוש הדברה מאז 1960 הוכיחה להיות מוצלח מאוד, עליית התנגדות חרקים העלתה צורך בפיתוח חומרי הדברה הרומן ואסטרטגיות בקרת וקטור אלטרנטיבה 4-7. במהלך שנת 2010, סך של 49 מתוך 63 מדינות דיווח ארגון הבריאות העולמי הצביע על התרחשות של התנגדות הדברה וקטורים מלריה 1. בנוסף, הכלי Mapper IR, אשר מנצל ספרות ביקורת עמיתים להעריך נתונים התנגדות באזורים Afrotropical, מדווח כי בין השנים 2001 ו -2012 היו 46% ו -27% עליות התנגדות pyrethroids ו dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), בהתאמה 7. התערבות RNA (RNAi) זוהה בתחילת 1990 כטכניקה שיכול להיות מועסק על מנת להשבית את הגנים בצמח פטוניה 8,9 וב הפטרייה Neurospora crassa 9,10. זמןקצר לאחר מכן,בשנת 1998, RNAi תועדה לראשונה ב elegans Caenorhabditis כאמצעי לצמצום ביטוי גנים במודל חיה על ידי כניסתה של antisense או RNA פעמיים גדיל (dsRNA) באמצעות שיטות הזרקה או האכלה 9,11. מאז גילויו, RNAi יש מהפכה במרדף עידן הגנומיקה בכך שהוא מאפשר לחוקרים לנצל גנטיקה הפוכה כדי לחקור את התפקידים התפקודיים במהירות של גנים של עניין באמצעות מנגנון להשתקת גנים סלקטיבית מאוד שלאחר תעתיק. באורגניזמים מסוימים, כגון תסיסנית, שימוש האורגניזם מהונדס מבטאים בונים RNA מפריע הצליח נרחב עבור מציאת גן (KD). למרות השימוש transgenes ב An. gambiae עבור RNAi נוצל ועשוי להיות שימושי עבור מסכים בקנה מידה גדולה, הדור של זני יתושים מהונדסים הוא גם העבודה וזמן אינטנסיבי, לוקח בדרך כלל שניים עד שלושה חודשים כדי לעבור את זיהוי של גן המעניין את generatiעל של מנייה מהונדסת מתאימה 12. נכון לעכשיו, השיטה העיקרית של KD גן ב An. gambiae הוא בזריקה לתוך hemolymph, בשלב המבוגר, של dsRNA ספציפי גן מסוים 12,13. תהליך זה בדרך כלל לוקח בערך חודש ללכת מהזדהות של גן של עניין להערכה של KD הגן, להוכיח להיות הרבה יותר מהיר מאשר שיטות מהונדסות 12. שיטות-בשלב הזחל RNAi הוקמו לאחרונה ב An. gambiae ו Aedes aegypti באמצעות ננו-חלקיקי האכלת 14-17 או על ידי משלוח אוראלי של microalgae המבוסס dsRNA מולקולות 18, המציעות הזדמנויות לבצע ניתוח גנומי תפקודי במהלך בשלבים מוקדמים של פיתוח. ב הזרקה ישירה, האכלה, ושיטות משלוח nanoparticle, dsRNA נלקח באופן אוטונומי על ידי התא היעד ביקע ידי האנזים דייסר לתוך 21-25 נוקליאוטידים-ארוך &quot;קצר מפריעים RNAs&quot; (siRNAs) 19,20. siRNAs אלה אז incorporated לתוך השתקה המושרה RNA מורכב (RISC), שממנו גדיל אחד ייפסל, המאפשר במתחם RISC הנכנס RNA להיקשר ודבק mRNA היעד ובכך להפחית את רמתו ומעכבות ותרגומו 19,20. מאפיינים מהותיים רבים של ביולוגית יתוש בסיסית לווסת קיבולת וקטורים, לרבות נטייתו מארח (למשל, חוש ריח, gustation), הזדווגות, רבייה וחסינה. לאור החשיבות של תהליכים ביולוגיים אלה, סביר להניח כי האפנון שלהם ברמה גנטית או תרופתית יציע הזדמנויות חדשות עבור בקרת וקטור, כוללים עקיפה של התנגדות חרקים, ולספק כלים חדשים גישות משולבות רחב יותר לניהול וקטור. השימוש גנומיקה תפקודי להעריך את התפקידים של גנים הבסיסיים תכונות ביולוגיות המהותיות אלה יאפשר זיהוי של מטרות חדשות ולספק תובנה חדשות על איך אנחנו יכולים ליצור ביעילות חדשה, strateg שליטה אפקטיבית יותרies. אנו מתארים את הפיתוח ושימוש שיטת הזרקה מהירה לייזום RNAi בשלב הגלמים של An. gambiae. אנו צופים כי הזרקה בשלב גלמים של טריגר RNAi מאפשרת תצפית של פנוטיפים כתוצאה במבוגרים בשלב מוקדם, כלומר, במוקדם לאחר הופעתה מ יהיה ציין אם גן המציאה הופעל מבוגרים שלאחר הופעתה. שיטות זה מאפשרת מציאת גן מתחיל בזמן ההפסקה התפתחותי הגלמים והארכה לשלבים בוגרים, כך מציאת גן היזם במהלך התפתחות גלמי יכולה להתמיד להשפיע סוגי תאי hemolymph נגיש בוגרים מוקדמים, כמו גם סוגי תאים, כי הם יותר hemolymph-נגישים במהלך המטמורפוזה מאשר מבוגר, כגון עצב סנסורי נמצא נספחים מבוגרים לאחר הופעתה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEGAscript RNAi kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II foot switch</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Narishigne</td>
			<td>PB-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1371150</td>
			<td>&#188; inch cut from tip to create a wider opening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman &#8220;thin&#8221; filter paper&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot &#8220;thick&#8221; filter paper</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>107-3931</td>
			<td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (size 0)</td>
			<td>Michael&#8217;s Art</td>
			<td>10474940</td>
			<td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting light microscope</td>
			<td>&#160;----&#160;</td>
			<td>-----</td>
			<td>This can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

הזרקת גלמים עבור תשואות KD גן תוצאות אופטימליות כאשר ההזרקה מתבצעת בשלב הגלמים מוקדם, כאשר רמות שיזוף לציפורן נמוכות (איור 1 א &#39;, שמאל, ו -1 B). גברת שיזוף והתקשות של לציפורן, בדרך כלל לאחר 24 שעות, תוצאות במוות גלמי עלה בעקבות הזרקה (איור 1 א, מרכז וימין). קצב ההתפתחות גלמי יכול להשתנות בהתאם לתנאי insectary וצפיפות בעלי חיים 24,25; ולכן, עדיף להעריך פיגמנטציה חזותית. במהלך תהליך ההזרקה, מחט הנימים מוכנס לתוך לציפורן הגב בזווית של כ -30 מעלות הקדמיות לכיוון אחורי (איור 2 א). לאחר המחט מוחדרת ואת dsRNA + 0.01% (w / v) FGD הוא חילק, חלוקת לצבוע ניכר ברחבי hemolymph (figuמחדש 2B). הערכת הופעתה מבוגרת גלמים הזריקה 0.01% (w / v) FGD חשף בשיעור ממוצע של הופעתה 70%, בהשוואה ל -96.7% הופעתה של בקרות שאינן מוזרק (איור 3 א). מן הראוי לציין כי הופעתה חלקית ממקרה גלמי נצפתה עבור מספר רב של יתושים שאינם שורדים (איור 3 ב). חיות מוזרקות להפגין ללא עיכובים בזמן הופעתה (איור 4 א) או השפעה מוטה משני המגדר (האיור 4B). הערכה נוספת של בוגר ששרד ביצע עד היום 10 הופעתה פוסט חושף שום השפעה ניכרת על הישרדות מבוגר שלאחר הופעתה (איור 4C). אימות של איכות KD הוערכה על ידי פסאודו הגידול melanotic (אשכול פיגמנט כהה רקמה) פנוטיפ הקשורים SRPN2 מציאה 21,22 כביקורת חיובית עבור מציאה ואת<html> בהעדר פנוטיפים הקשורים הזרקת dsLacZ כביקורת שלילית. יתושים למבוגרים שצצו דורגו ביום 8 לאחר הזרקה (יום 6-7 שלאחר ההופעה). Melanotic-גידולים פסאודו (איור 5 א ו 5 ב) נצפו באמצעות לציפורן של 93.5% של dsSRPN2 לעומת 0% מכלל היתושים הבוגרים dsLacZ (איור 6 א). אשכולות של רקמת melanized בקדרות זוהו על דיסקציה של טלאים פיגמנט (5C איור). פסיאודו גידולים נראו על לציפורן המבוגרת מוקדם ככל 3 יום-הופעתה פוסט ונכחו גם קבוצת משנה של hemolymph dsSRPN2 ורקמות בטן (מידע לא מוצג). בשעה 5 לאחר ההזרקה (בשלב הבוגר מוקדם), ירד משמעותית SRPN2 רמות dsSRPN2, אבל לא dsLacZ או מבודד חלבון hemolymph מוזרק הלא נצפתה (איור 6). ftp_upload / 53,738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: היערכות התפתחותית להזרקת dsRNA גלמי הזרקת גלמים מוקדם של תוצאות dsRNA בהישרדות והתקדמות אופטימליות לתוך לשלב בוגר.. רמות נמוכות של פיגמנטציה לציפורן (A, עזבו, ו- B) ניתן להבחין בתוך ההתגלמות הבאה 0-24 השעות הראשונות. שיזוף של הזריקה הקודמת לציפורן גלמים (A, מרכז וימין) תוצאות בינוניות עד הישרדות עניה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> איור 2:. עמדת הזרקה והפצה של שכותרתו לצבוע dsRNA (א) הזרקת מחט נימים של dsRNA שכותרתו צבע לתוך לציפורן הגב בזווית של כ -30 מעלות, ב קדמי אל אחורי כיוון. (ב) הצבע מופץ בעליל hemolymph הגלמים. נפח הזרקה dsRNA של 138 NL, שכותרתו עם 0.01% FGD (w / v). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> איור 3:. הופעתה הבוגרת לאחר ההזרקה (א) 70% של גלמים הזריקו 0.01% FGD (w / v) יצא בהצלחה (n = 60), בהשוואה ל -96.7% בקבוצת הביקורת הלא מוזרק (n = 60). שלושה ביולוגי משכפל בוצע. (ב) הופעתה חלקית ממקרה גלמי נצפתה עבור מספר רב של יתושים שאינם שורדים. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> איור 4: צמיחת שיעור, הערכת מין והישרדות מבוגרים (א) זמני הופעתה להשוואה נצפו לאחר ההזרקה גלמי עם 0.01% FGD (24 hr = 80% ו 48 שעות = 20%), לעומת גלמים שאינם מוזרק (24. hr = 83% ו -48 שעות = 17%). (B </strאונג&gt;) הופעתה זכר מבוגר הנקבה השווה כ נצפתה גלמים מוזרקים 0.01% FGD (נקבה = 48% וגבריים = 52%) וגלמים הלא מוזרק (נקבה = 52% וגבריים = 48%). (ג) ניתוח ההישרדות מגלה כי הזרקה עם 0.01% FGD אינה משפיע בוגר ששרד, הערך עד יום 10 הופעתה פוסט. תוצאות מייצגי נתונים משלושה ניסויים עצמאיים עם 0.01% FGD המוזרקים (n = 60) ולא מוזרק (n = 60) גלמים (מספר שווה של זכרים ונקבות). ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> איור 5: פנוטיפ בקרה חיובית גידולים פסאודו משקף מציאה מוצלחת-גידולים פסאודו נצפו על הבטן (א) ו- (ב) לציפורן החזי של dsSRPN2 -injected, אבל לא dsLacZ יתושים בוגרים -injected ב 8 יום לאחר ההזרקה..(ג) גדלה גבוהה (400X) הדמיה (א) של לציפורן דיסקציה של טלאי פיגמנט (ב) מגלה אשכולות של תאי melanized בקדרות. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> איור 6: כימות של היווצרות פסאודו הגידול וירידה רמות החלבון SRPN2 (א) זריקות בשלב גלמי לגרום להיווצרות פסאודו-גידול 93.5% מהמבוגרים dsSRPN2 (n = 21) לעומת 0% בקבוצת הביקורת dsLacZ (n = 19). . התוצאות שהתקבלו ביום 8 לאחר ההזרקה. (ב) כתם המערבי (משמאל) מראה ירידה SRPN2 רמות dsSRPN2, אבל לא dsLacZ או מבודד חלבון hemolymph הלא מוזרק (יום 5 לאחר ההזרקה). תוצאות מבוססות על שלושה ניסויים בלתי תלויים. Anti-SRPN2 21 ואנטי SRPN3 26 דילולים נוגדן השתמשו היו 1: 1,000 ו 1: 2,000, בהתאמה. עיזים אנטי-rabbit IgG-HRP (מוצר SC-2004, סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, דאלאס TX) שימש ב 1: 5,000. כל רמות החלבון היו לכמת (מימין) לפי עוצמה הלהקה (ImageJ תוכנה, NIH, Bethesda, MD), מנורמל SRPN3, ולעומת סטטיסטית על ידי מבחן t מזווג. P &lt;0.05: *, P ≥0.05: NS (לא משמעותי). ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM).

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae at JoVE.com

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.0K Views.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Video: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

פרוטוקול לגידול יתושים (א gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

לוקליזציה RNAi ו ביטוי גנים מחוץ לרחם של עלוקה מרפא

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

משלוח חיידקית של RNAi effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

RNAi טריגר משלוח לתוך

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video