We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1. تحضير وإعداد الرنا المزدوج الجديلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف المنطقة ضربة قاضية 200-800 سنة مضت (لتوليد الرنا المزدوج الجديلة المقابلة) داخل الجين الذي يتوقع أن يكون لا يمكن تحديدها آثار خارج الهدف (على سبيل المثال، لا تسلسل تناظر ≥18 بي بي داخل الجين آخر) والسيطرة السلبية (على سبيل المثال ، سلسلة مغاير ليست موجودة في الجينوم الحشرة المستهدفة، مثل الجين كولاي lacZ (بنك الجينات معرف جين: 945006). بدلا من ذلك، استخدام تحكم إيجابية (على سبيل المثال، والتي ينتج النمط الظاهري ملاحظتها بسهولة، مثل SRPN2 21،22 ، بنك الجينات الجينات الرقم: 1270169) ويعرف تسلسل استهداف SRPN2 الرنا المزدوج الجديلة في ميشيل وآخرون (2005) 21. ملاحظة: E-رني موردا بيوينفورمتيك مفتوح المصدر يمكن أن يكون مفيدا لتحديد هذه المناطق ولعملية تصميم الاشعال النوكليوتيد 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الصورةtandard PCR التضخيم (أي يؤديها مع طق الحمض النووي بوليميريز تستخدم 30-35 دورات) باستخدام الحمض النووي الجيني أو قالب كدنا] للحصول على الرنا المزدوج الجديلة قالب التوليف يحيط بها تسلسل T7 المروج (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) والمضي قدما في إعداد الرنا المزدوج الجديلة و تنظيف باستخدام المختبر في عدة نسخ التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام SRPN2 PCR الظروف التضخيم والمعلومات التمهيدي كما وردت في أحد وآخرون (2011) 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عوائد RNA amplicon تنقيتها من التحليل الطيفي امتصاص الاشعة فوق البنفسجية في الطول الموجي من 260 نانومتر، والتكيف مع التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 3 ميكروغرام / ميكرولتر) في ريبونوكلياز خالية من المياه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستكشاف تركيزات منخفضة RNA، والحد من حجم السائل عن طريق الدوران عينات عليها في جهاز للطرد المركزي فراغ في درجة حرارة الغرفة أو lyophilizing العينات وإعادة تشكيل في حجم أصغر من المياه. الوقت اللازم لعينة تجفيد سوف تختلف تبعاعلى وحدات تخزين عينة أولية وتركيزات الرنا المزدوج الجديلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من جودة وطول الرنا المزدوج الجديلة على هلام الاغاروز 2٪ أعدت مع 1X TBE أو تاي العازلة وملطخة بروميد إيثيديوم (EtBr)، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي القالب المستخدم للتفاعل النسخ. فإن الرنا المزدوج الجديلة الهجرة بصورة أبطأ من الحمض النووي القالب. جودة وطول يمكن تقييمها من خلال ضمان عدم وجود منتجات الرنا المزدوج الجديلة غير محددة وبمقارنة المنتجات مع علامة الحمض النووي القياسية، على التوالي. ملاحظة: EtBr هو المغير قوية، وينبغي أن يتم التعامل معها وفقا لذلك. ملاحظة: عند تركيز الرنا المزدوج الجديلة من 3 ميكروغرام / ميكرولتر و 0.5 ميكرولتر من العينة هي أكثر من كافية لتصور على هلام الاغاروز EtBr-الملون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الرنا المزدوج الجديلة في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. قد يسبب عدة دورات تجميد / الذوبان التدهور، لذلك يجب أن تكون على استعداد قسامات لكميات كبيرة من الرنا المزدوج الجديلة. </li></ol> 2. إعداد سريع الخضراء FCF صبغ (FGD) أنابيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع سريع الخضراء FCF صبغمن المحلول (≥85٪ محتوى الصبغة) إلى 0.1٪ (ت / ت) (الحل العمل) في ريبونوكلياز خالية من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 ميكرولتر من صبغ في الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب مكان في كتلة الحرارة 65 درجة مئوية لمدة حوالي 3 ساعات حتى تتبخر السوائل، ثم أنابيب مكان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل، لتبرد قبل استخدام. وهذه الصبغة صلبة جافة إعادة تكوين في الرنا المزدوج الجديلة الحل إعادة تعليق. </li></ol> 3. إبر سحب حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبر الزجاج البورسليكات باستخدام مجتذب إبرة ساخنة لقطر غيض من 10-30 ميكرون. سحب إعدادات تتوافق مع: تعديل سخان لا. 1 = 100، تعديل سخان لا. 2 = 70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب الأضرار التي لحقت طرف غرامة الإبرة، ووضع كل الإبر سحبت أفقيا في طبق بيتري على شريط من صب المعجون. ملاحظة: يمكن الحصول على معلومات إضافية عن إبرة الشعرية سحب الأساليب في مزيد من التفاصيل في أبحاث الملاريا والمراجع الكاشف مركز الموارد Mدليل R4 24. </li></ol> 4. إعداد محطة حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المواد المطلوبة: الإبر الزجاج microcapillary انسحبت لطرف على ما يرام، microinjector، ورقة مرشح رقيقة ورقة مرشح سميكة، أطباق بتري، ماصات نقل، فرشاة الطلاء وتشريح المجهر ضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد microinjector وفقا للتعليمات في دليل microinjector، وضبط حجم حقن لحجم المطلوب لكل نبضة (على سبيل المثال، بحد أقصى 69 NL في النبض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على منصة التي هي سهلة للمناورة تحت المجهر (على سبيل المثال، الجانب المسطح من رف أنبوب الستايروفوم)، كومة اثنين من ورقة ورقة فلتر مع ورقة الترشيح رقيقة على القمة، وتأمين مع الشريط حول الحواف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend 10 ميكرولتر من كل حل الرنا المزدوج الجديلة في أنابيب الصبغة الملونة منفصلة، ​​ومكان على الجليد. </li></ol> 5. جمع الشرانق للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سد صغير 60 ملم × 15 ملم طبق بيتري مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات، وجمع ~ 50 الشرانق شاحب (الدورينانوغرام أول 24 ساعة بعد التشرنق) من علبة insectary باستخدام نقل البلاستيك القابل للتصرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي الشرانق التي لديها متوسط ​​إلى دباغة بشرة داكنة. ملاحظة: بمجرد أن تبدأ بشرة تان، فإنه يصبح أكثر صعوبة في اختراق بشرة، والنتائج حقن في أعلى بكثير الفتك. </li></ol> 6. الرنا المزدوج الجديلة حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، وقطع الطرف البعيد من إبرة الحقن مع زوج من ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إبرة الحقن عن طريق الردم الإبرة مع الزيوت المعدنية (باستخدام حقنة مع 3 بوصة، إبرة قياس 30)، وطرد فائض المعروض النفطي مع microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أمام إبرة الحقن مع أقصى قدر ممكن من الرنا المزدوج الجديلة، وإخراج نبضة واحدة تحت المجهر للتأكد من صرف السائل. في حالة عدم وجود السائل وتناولها و / أو طرد، والتحقق من الطرف البعيد من الإبرة للأي انسداد والتأكد من أن الإبرة المضمونة بقوة في microinjectoص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 1-3 الشرانق، ووضعها على ورقة الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام، ووضع الشرانق على ورقة الترشيح مع الظهرية بشرة الوصول إليها، واستخدام الفرشاة لدفع على ورق الترشيح وامتصاص أي المياه الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار خادرة مع غيض من الفرشاة، وادخال الإبرة في إهاب الظهرية بين الصدر والبطن في زاوية ما يقرب من 30 درجة بالنسبة إلى السطح الظهري للخادرة. وينبغي توجيه حقن نحو نهاية الخلفي من الشرنقة والإبرة يجب أن يتم نقل في اتجاه الأمامي إلى الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن اثنين من البقول (69 NL في النبضة) من 3 ميكروغرام / حل الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر في الدملمف، وتحقق لتوزيع اللون في جميع أنحاء الجسم. إذا تم تحديد أي لون، وتحول موقف إبرة حقن قليلا لمسح معلومات من إعاقة وكرر تسليم السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفرشاة المبللة للتحرك بلطف خادرة من الإبرة في المياه لزراعة. تانه بوبا يجب التمسك الفرشاة على ضوء الاتصال. </li></ol> 7. شروط المشاركة الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري مع الشرانق حقنها في قفص البعوض مع تدفق الهواء مناسب (على سبيل المثال، قفص شبكة أو حاوية مع غطاء شبكة). وينبغي أن تظل الظروف تربية العذراء باستمرار في 27 ± 3 درجة مئوية درجة الحرارة، و75 ± 5٪ الرطوبة ويكون تحت ضوء: دورة الظلام من 16: 8 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10٪ (ث / ت) محلول الجلوكوز، ووضع كرة من القطن مشبعة حل على قفص البعوض شبكة لتغذية الكبار. </li></ol> 8. تقييم ضربة قاضية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المطلوب نقاط (ق)، وتقييم الظواهر في الحشرات التجريبية حقن الرنا المزدوج الجديلة، مقارنة بالمجموعة الضابطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم dsSRPN2 وdsLacZ الحشرات يوميا من قبل تقشعر لها الأبدان أسفل البالغين لمدة 2-3 دقائق عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ونقلهم إلى لوحة الباردة في 2 درجة مئوية، وتحديد أي تشكيل شبه الورم عن طريق استخدام المجهر تشريح في 15Xالتكبير مع إضاءة brightfield. بعد التقييم، والعودة البالغين لظروف insectary (27 ± 3 درجة مئوية، 75 ± 5٪ الرطوبة). ملاحظة: dsRNAs المجموعتين الضابطة والتجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول هم dsSRPN2 وdsLacZ، على التوالي. هناك العديد من الخيارات المناسبة للضوابط. ومع ذلك، يقترح أن تحكم إيجابية التي النمط الظاهري و / أو التعبير تصور بسهولة (على سبيل المثال، من خلال تشريح المجهر) و / أو كميا [على سبيل المثال، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، وصمة عار الغربية] وينبغي أن تستخدم عندما تعلم هذه التقنية. البروتين SRPN2 وتقدير نسخة عبر طخة غربية وQRT-PCR، على التوالي، تم وصفها في ميشيل وآخرون (2005) 21. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplicity+of+malaria+transmission:+a+review+of+entomological+inoculation+rate+measurements+and+methods+across+sub-Saharan+Africa.">The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa.</a> Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).</li><li>The malERA Consultative Group on Vector Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Research+Agenda+for+Malaria+Eradication:+Vector+Control.">A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control.</a> PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).</li><li>Enyati, A., Hemmingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Management:+Past,+Present,+and+Future.">Malaria Management: Past, Present, and Future.</a> Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).</li><li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).</li><li>Mitchell, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+Target-Site+Mechanisms+Combine+to+Confer+Strong+DDT+Resistance+in+Anopheles+gambiae.">Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).</li><li>Knox, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+online+tool+for+mapping+insecticide+resistance+in+major+Anopheles+vectors+of+human+malaria+parasites+and+review+of+resistance+status+for+the+Afrotropical+region.">An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region.</a> Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).</li><li>Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+a+Chimeric+Chalcone+Synthase+Gene+into+Petunia+Results+in+Reversible+Co-Suppression+of+Homologous+Genes.">Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes.</a> Plant Cell. 2, 279-289 (2002).</li><li>Sen, G. L., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+RNAi:+the+silence+of+the+genes.">A brief history of RNAi: the silence of the genes.</a> FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).</li><li>Romano, N., Macino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quelling:+transient+inactivation+of+gene+expression+in+Neurospora+crassa+by+transformation+with+homologous+sequences.">Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.</a> Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Catteruccia, F., Levashina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+the+Malaria+Vector,+Anopheles+gambiae:+Therapeutic+Applications+of+RNAi:+Methods+and+Protocols.">RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols.</a> Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A).</a> gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+Olfactory+System+Development+through+Chitosan/siRNA+Nanoparticle+Targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/Interfering+RNA+Nanoparticle+Mediated+Gene+Silencing+in+Disease+Vector+Mosquito+Larvae.">Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae.</a> J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).</li><li>Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+RNAi+based+microalgal+larvicide+to+control+mosquitoes.">Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes.</a> Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).</li><li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control:+A+review.">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review.</a> J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).</li><li>Burand, J. P., Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi:+Future+in+insect+management.">RNAi: Future in insect management.</a> J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).</li><li>Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+SRPN2+facilitates+midgut+invasion+by+the+malaria+parasite+Plasmodium+berghei.">Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei.</a> EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Anopheles Research. , (2014).</li><li>Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+rearing+temperature+and+larval+density+on+larval+survival,+age+at+pupation+and+adult+size+of+Anopheles+gambiae.">Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).</li><li>Michel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+melanizing+activity+in+Anopheles+gambiae+does+not+affect+development+of+Plasmodium+falciparum.">Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).</li><li>Harker, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Profiling+Associated+With+Life+Cycle+of+Anopheles+gambiae.">Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).</li><li>Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+pupal-specific+cuticular+protein+genes+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).</li><li>Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pupal+cuticle+proteins+of+Manduca+sexta:+characterization+and+profiles+during+sclerotization.">Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).</li><li>Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+cuticular+genes+of+silkworm,+Bombyx+mori.">Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori.</a> BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).</li><li>Zhou, X., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+specifies+pupal+development+and+mediates+the+&amp;#34;status+quo&amp;#34;+action+of+juvenile+hormone+on+the+pupal-adult+transformation+in+Drosophila+and+Manduca.">Broad specifies pupal development and mediates the &amp;#34;status quo&amp;#34; action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.</a> Development. 129, 2259-2269 (2002).</li><li>Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+Toll+related+genes+during+development+and+immune+responses+in+Anopheles+gambiae.">Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).</li><li>Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-related+receptors+and+the+control+of+antimicrobial+peptide+expression+in+Drosophila.">Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).</li><li>Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CecC,+a+cecropin+gene+expressed+during+metamorphosis+in+Drosophila+pupae.">CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae.</a> Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).</li><li>Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Insect+Metamorphosis:+a+Microarray-Based+Study+of+Larval+and+Adult+Gene+Expression+in+the+Ant+Camponotus+Festinatus.">Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus.</a> Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).</li><li>Cook, P. E., Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes+for+adult+age+estimation.">Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation.</a> Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).</li><li>Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serpin+gene+family+in+Anopheles+gambiae.">The serpin gene family in Anopheles gambiae.</a> Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).</li><li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+the+salivary+gland+nitrophorin+2+in+the+triatomine+bug+Rhodnius+prolixus+(Hemiptera:+Reduviidae)+by+dsRNA+ingestion+or+injection.">RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).</li><li>Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+with+the+allatoregulating+neuropeptide+genes+from+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+and+its+effects+on+the+JH+titer+in+the+hemolymph.">RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph.</a> J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li></ol>

وتدفع الوصول المفتوح لهذا الفيديو المادة تكفلها بيوجين.

الأساليب الحالية لإحداث غير المعدلة وراثيا رني في البعوض وتشمل الحقن المباشر للالرنا المزدوج الجديلة في hemocoel الكبار 12،13 أو تغذية اليرقات رني النانوية المغلفة الزناد 14-17 أو الرنا المزدوج الجديلة القائم على الطحالب الجزيئات 18. استهداف البعوض الكبار، في حين أن قيمة للغاية، يمكن استبعاد عدد كبير من الجينات التي تعمل خلال فترات النمو السابقة. ضربة قاضية بدأها تغذية اليرقات قد تسفر عن الظواهر غير متناسقة خلال مرحلة البلوغ بسبب، في جزء منه، إلى إمكانية استمرار البروتين المتغير من خلال طور العذراء. لذلك، إدخال وسيلة إضافية التي تهدف على وجه التحديد في البدء رني خلال تطوير العذراء ستوفر وسيلة لتقييم بشكل كامل وظائف الجينات خلال مراحل النمو قبل الكبار، وكذلك القدرات المعززة لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل الكبار. كما هو الحال مع نهج الجينات ضربة قاضية على أساس حقن الرنا المزدوج الجديلة أو التعبير، واستمرار الجينات ضربة قاضيةلا يمكن التنبؤ بها. ولذلك، ينبغي تقييم نص أو مستويات البروتين لجين من الفائدة خلال فترات التنموية للاهتمام. على الرغم من أن نلاحظ استمرار انخفاض مستويات البروتين في اليوم 5 بعد حقن للSRPN2 في الحيوانات حقن الرنا المزدوج الجديلة SRPN2، يمكن لعوامل مثل دوران البروتين ونصف حياة تختلف عن أهداف مختلفة. ومن الأهمية بمكان أن تضمن لها، كذلك، أن الرنا المزدوج الجديلة لاستخدامها في حقن يتركز بشكل جيد ويبدو سليما على هلام الاغاروز. ونحن نوصي المجربون إعادة تقييم هذه العوامل إذا كانت النتائج ضربة قاضية ليست كافية، وربما تحتاج إلى اختبار تجريبي لأهداف الجينات المحددة تركيزات كل من الرنا المزدوج الجديلة. نحن تصف طريقة لبدء التدخل RNA خلال طور العذراء من آن. تطوير الغامبية. ويعتمد هذا الأسلوب على مقدمة عبر Microinjection من الرنا المزدوج الجديلة مباشرة في hemocoel من الشرانق في وقت مبكر، ويسمح لتقييم جودة حقن من قبلاستخدام من المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة. القدرة على تصور نوعية حقن يشكل تعزيز حاسم لضمان ضربة قاضية ناجحة وتشكل جانبا من جوانب ضربة قاضية الجينات القائم على حقن أنه لم يتم النظر في البروتوكولات القائمة على الرنا المزدوج الجديلة ذكرت معظم سابقا مع التركيز على مرحلة البلوغ. من خلال استهداف خادرة في بداية هذه الفترة التنموية، الجينات التي قد يكون لها دور خلال هذه الفترة تنموي محوري، أو خلال المراحل المبكرة من سن البلوغ يمكن تقييمها وظيفيا. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قد تمكن تسليم الرنا المزدوج الجديلة إلى الخلايا، وإنشاء تدخل الحمض النووي الريبي في الخلايا التي يمكن الوصول إليها خلال التحول، ولكن يصعب الوصول إليها في البعوض البالغ تشكيلها بالكامل. تحليل ميكروأري مؤخرا هاركر وآخرون (2012) حددت 560 آن. النصوص الغامبية التي تصل التنظيم أو تنظيم أسفل من قبل ما لا يقل عن 4 أضعاف خلال مراحل نمو متميزة، بدءا من الجنين إلى الكبار. من 560 النصوص التي تم تحديدها، مجموعة من 309 والتنظيم صعودا خلال تطوير العذراء 27. وتشير هذه النتائج إلى أن هناك العديد من متطلبات التعبير الجيني الفرق في جميع أنحاء تنمية البعوض، بما في ذلك تلك التي تحدث خلال مرحلة العذراء، فاصل خلالها الكائن الحي يخضع التحول. في العديد من أنواع الحشرات، بما في ذلك. الغامبية، الجينات المسؤولة عن العمليات مثل التنمية (أي جليدية العذراء والبروتينات ملزم كيتين) 27-31 والمناعي استجابة (أي تول البروتينات مثل مستقبلات) 27،32-34 وأعربت غاية أثناء مرحلة العذراء. مرة واحدة ظهرت الكبار تشكيلها بالكامل، وهناك واصل التعبير الجيني في استجابة لالبيئية والفسيولوجية تغيير 35. والجدير بالذكر أن خلال تطوير الكبار في وقت مبكر، أن هناك زيادة في التعبير عن الجينات التنموية (أي جليدية الكبار والبروتينات العضلية) 36، وكذلك الجينات الرئيسية الأخرى (أي </em&gt;، الحيوانات المنوية بروتين معين والسيتوكروم P450 الانزيمات الأيض) 27،36. السيطرة الإيجابية المستخدمة في تطوير هذا البروتوكول، SRPN2، هو آن. الغامبية مثبط البروتياز سيرين (السربين). يلعب SRPN2 دورا هاما في تنظيم السلبي للالتصبغ الحشرات، مجموعة واسعة الاستجابة المناعية الفطرية في الحشرات 21،22. ضربة قاضية من SRPN2 في البعوض النتائج الكبار في تشكيل شبه ورم 21،22، النمط الظاهري الذي لوحظ بسهولة عن طريق استخدام المجهر الضوئي. وبالنظر إلى أن هذا النمط الظاهري واضح يمكن سجل بسهولة في الحشرات الحية، كنا SRPN2 لحقن مرحلة رني العذراء الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن SRPN2 خلال جميع مراحل التطوير 37، وبالتالي توفير هدفا جيدا للمرحلة العذراء حقن رني وتقييم وظيفة في الكبار في وقت مبكر. علينا أن نبرهن على طريقة وضعنا غير قادرة على إحداث الكبار مماثل pseud الميلاني<html> تشكيل س الورم نتيجة لحقن الرنا المزدوج الجديلة المنجزة خلال مرحلة العذراء للتنمية. في تطوير هذا البروتوكول، لاحظنا أن حقن خلال تطوير العذراء في وقت مبكر (أي أول 24 ساعة بعد تساقط اليرقات، العذراء) أمر بالغ الأهمية للحصول على أفضل ظهور الكبار. في حال الفقراء ظهور يتم الحصول بعد الحقن، ونحن نوصي تنظيم اليرقات بدقة أكبر، للحصول على الشرانق مع تصلب بشرة أقل اتساعا، وأؤكد أن يتحقق في وقت مبكر حقن مرحلة العذراء. وعلاوة على ذلك، والتقليل من الأضرار التي لحقت النتائج بشرة في معدلات ظهور الأمثل وزيادة التكبير أثناء الحقن يمكن أن تساعد في ضمان أن يتم ثقب فقط المنطقة المقصودة من هذا الحيوان. إذا كانت الإبرة يجب أن ثقب من خلال لبشرة بطني، وتجميع السائل المسمى صبغ يكون واضحا على السطح الخارجي للخادرة أو سوف تشبع ورقة الترشيح. فإنه ينصح بشدة لتجاهل أي الشرانق التي لديها أكثر من ثقب بشرة. jove_content &quot;&gt; مع تجارب واسعة من العديد من المختبرات مع أداء حقن البعوض الكبار، والنهج حقن مكروي التي سبق تحديدها يمكن تكييفها مع تعديلات بروتوكول بسيط للاستخدام في التجارب رني العذراء. وعموما، فإن الهدف من هذه الطريقة هو توفير الباحثين القدرة على توسيع الإطار الزمني خلالها عكس لا يمكن أن يؤديها تحاليل وراثية، مما يتيح البحوث التي من شأنها دعم تطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في الأنواع الأخرى، مثل الرادنة prolixus وورق القطن frugiperda، تكشف عن أن الجينات آثار إسكات تميل إلى أن تكون من ذلك بكثير أكبر عندما بدأ أثناء مرحلة ما قبل الكبار مراحل 38،39. وخلال جميع مراحل التنمية، الجينات بوساطة رني ضربة قاضية يخضع لاعتبارات تتعلق سرعة واستمرار إسكات الجينات، واستقرار البروتينات المشفرة بواسطة الجينات المستهدفة. الهدف رني المثالي جينات تميل إلى أن تكون تلك التي ترميز proteiن أو الحمض النووي الريبي التي لديها قصيرة نصف الحياة ومعدل دوران عال 11،40. بينما الاستراتيجيات رني المعدلة وراثيا يمكن أيضا أن تستخدم لمعالجة اعتبارات تتعلق سرعة واستمرار رني خلال مراحل ما قبل الكبار، وتقنيات المعدلة وراثيا لديها العديد من نقاط الضعف (على سبيل المثال، الوقت اللازم لتوليد خطوط المعدلة وراثيا، التجريبية الأطر الزمنية لالتزاوج البعوض لتوليد الحشرات مع التعبير الرنا المزدوج الجديلة منظم، والحفاظ على مخزونات المعدلة وراثيا). على النقيض من ذلك، لدينا بروتوكول يتيح وسيلة أسهل وأسرع للبدء في إسقاط الموروثة خلال تطوير العذراء وفي أنواع الخلايا التي تنشأ ويمكن الوصول إليها خلال مسخ ولكن أقل الوصول إليها في البالغين. استخدام تعليق الرنا المزدوج الجديلة المسمى صبغ يسمح لتقييم سهلة للنجاح الحقن وتشتت المواد أدخلت داخل الشرانق. لدينا بيانات عن بداية تشكيل الورم في البالغين العذراء حقن، بالمقارنة مع الحيوانات المحقونة مثل البالغين، ويتسق مع الحرف الأولينتقم من ضربة قاضية رني بوساطة أثناء طور العذراء. باستخدام خط G3 البعوض لدينا وتحت ظروف insectary لدينا، فإننا نلاحظ الميلاني تشكيل شبه ورم الكبار في وقت مبكر من 10 أيام بعد الحقن من البالغين حقن 3-5 أيام بعد ظهور. عن طريق أداء أوائل حقن العذراء المرحلة، نلاحظ مرئية تشكيل الميلاني شبه الورم في وقت مبكر من خمسة أيام بعد الحقن (أي 03:57 آخر أيام ظهور). وتعني هذه البيانات أن هذه الطريقة يمكن الشروع في ضربة قاضية الجينات خلال فترة التنموية سابقا تحت درس (أي تنمية العذراء). قد تكون لدينا طريقة صبغ العلامات مفيدة أيضا لوضع بروتوكولات حقن اليرقات الجديدة، نظرا لطبيعة شفافة للبشرة خلال جميع الأعمار اليرقية. في حين أن التحكم المستخدمة في هذه الدراسة تتطلب التقدم إلى مرحلة البلوغ لعرض النمط الظاهري ضربة قاضية، والتجارب المستقبلية لتقييم الظواهر مرحلة معينة العذراء بعد الحقن من الشرانق في وقت مبكر سيوفرمعلومات قيمة فيما يتعلق بتوسيع هذه الطريقة في فترات التنموية إضافية مثل التنمية العذراء في وقت متأخر. وباختصار، فإن هذا الأسلوب بروتوكول رني قيما لمرحلة بدء العذراء من ضربة قاضية الجينات بوساطة رني ويوسع أدوات الجينومية الوظيفية المتاحة للاستخدام ضمن الأوساط البحثية ناقلات الامراض والحشرات.

الملاريا مرض معد يسببه البعوض الذي يؤثر على الملايين من الأفراد سنويا. منظمة الصحة العالمية (WHO) أن في عام 2013 كان هناك حوالي 584،000 حالة وفاة بسبب الملاريا، 78٪ منها وقعت في الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات 1. مسببات الأمراض التي تسبب الملاريا البشرية هي طفيليات apicomplexan داخل المتصورة جنس وتنتقل بين المضيفين البشري عن طريق البعوض بعوضة الإناث. يحدث انتقال عندما يأخذ البعوض وجبة الدم من شخص مصاب، ومن ثم الودائع الطفيليات المعدية إلى فرد غير مصاب في وجبة الدم اللاحقة. ضمن جنس الأنوفيليس، بعوض الملاريا هو النوع مع أكبر قدرة اتجاهي وهو ناقل الملاريا الأبرز في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى 1-3. حاليا، لا تزال مكافحة ناقلات البعوض عن طريق نشر المبيدات الحشرية إلى bالبريد الطريقة الرئيسية المستخدمة للحد من عبء الملاريا البشرية. على الرغم من أن استخدام المبيدات الحشرية منذ 1960s وقد ثبت أن تكون ناجحة للغاية، وأدى صعود مقاومة المبيدات الحشرية حاجة لتطوير المبيدات الحشرية جديدة واستراتيجيات مكافحة ناقلات بديل 4-7. خلال عام 2010، أشار ما مجموعه 49 من 63 بلدا تقارير لمنظمة الصحة العالمية وقوع مقاومة المبيدات الحشرية في نواقل الملاريا 1. بالإضافة إلى ذلك، أداة الأشعة تحت الحمراء مخطط، الذي يستخدم الأدب لاستعراض الأقران لتقييم البيانات المقاومة في المناطق المداري الإفريقي، تقارير أن ما بين 2001 و 2012 كان هناك 46٪ و 27٪ زيادة في مقاومة البيرثرويدات ومادة ال د. (دي دي تي)، على التوالي 7. تم التعرف تدخل الحمض النووي الريبي (رني) في 1990s في وقت مبكر كأسلوب التي يمكن أن تستخدم لتعطيل الجينات في مصنع بتونيا 8،9 وفي الفطر العصيباء المبوغة crassa 9،10. بعد ذلك بوقت قصير،في عام 1998، وقد تم توثيق رني لأول مرة في ايليجانس انواع معينة كوسيلة لخفض التعبير الجيني في نموذج حيواني من خلال إدخال العقاقير أو الحمض النووي الريبي مزدوج الجديلة (الرنا المزدوج الجديلة) عن طريق الحقن أو التغذية أساليب 9،11. منذ اكتشافه، قد أحدثت ثورة رني السعي لعلم الجينوم وظيفية من خلال السماح للباحثين الاستفادة من علم الوراثة العكسية للتحقيق بسرعة الأدوار الوظيفية من الجينات ذات الاهتمام عبر آلية إسكات الجينات انتقائية للغاية بعد النسخي. في بعض الكائنات الحية، مثل ذبابة الفاكهة، فإن استخدام الكائنات المعدلة وراثيا التي تعبر عن التدخل التركيبات RNA الناجح على نطاق واسع لإسقاط الموروثة (دينار كويتي). على الرغم من أن استخدام الجينات المحورة في آن. وقد استخدمت الغامبية للرني وقد تكون مفيدة للشاشات واسعة النطاق، وتوليد سلالات البعوض المعدلة وراثيا على حد سواء العمل والوقت مكثفة، مع الأخذ عموما 2-3 أشهر للانتقال من تحديد الجينات التي تهم الجيلعلى من الأسهم المعدلة وراثيا المناسب (12). حاليا، الوسيلة الرئيسية لدينار الجينات في آن. الغامبية هو عن طريق الحقن في الدملمف، خلال مرحلة البلوغ، من الرنا المزدوج الجديلة محدد لجين معين 12،13. هذه العملية تستغرق عادة حوالي شهر واحد للذهاب من تحديد الجينات التي تهم تقييم الجين دينار كويتي، يبرهن على أن تكون أسرع بكثير من الطرق المعدلة وراثيا 12. تم إنشاء طرق اليرقات المرحلة رني مؤخرا في آن. الرنا المزدوج الجديلة المستندة إلى الطحالب الغامبية والزاعجة المصرية عبر جسيمات متناهية الصغر تغذية 14-17 أو عن طريق التسليم عن طريق الفم من الجزيئات 18، مما يتيح فرصا لإجراء تحليل الجيني وظيفية خلال المراحل الأولى من التنمية. في الحقن المباشر، والتغذية، وطرق التسليم جسيمات متناهية الصغر، يؤخذ الرنا المزدوج الجديلة تصل بشكل مستقل من قبل الخلية المستهدفة والمشقوق بواسطة انزيم المقامر إلى 21-25 النوكليوتيدات طويلة &quot;التدخل باختصار الرنا&quot; (الرناوات siRNAs) 19،20. هذه الرناوات siRNAs ثم يتم incorporATED في الحمض النووي الريبي الناجم عن إسكات المعقدة (RISC)، والتي سيتم التخلص منها حبلا واحد، مما يتيح للمجمع RISC محددة RNA لربط ويلتصق مرنا الهدف، وبالتالي تقلل من مستوى، وتحول دون ترجمتها 19،20. العديد من الميزات الجوهرية لعلم الأحياء البعوض الأساسي تعدل قدرة اتجاهي، بما في ذلك تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الشم، ذوق حاسة)، التزاوج والتناسل والحصانة. ونظرا لأهمية هذه العمليات البيولوجية، فمن المرجح أن تعديل على المستوى الجيني أو الدوائي سوف توفر فرصا جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض، بما في ذلك تزييف مقاومة المبيدات الحشرية، وتوفير أدوات جديدة لنهج متكامل على نطاق أوسع لإدارة ناقلات. فإن استخدام علم الجينوم وظيفية لتقييم دور الجينات الكامنة وراء هذه الميزات البيولوجية الجوهرية يمكن تحديد أهداف جديدة وتقديم رؤى جديدة في كيفية يمكننا خلق فعال الجديدة، الاستراتيجيه مراقبة أكثر فعاليةالمنشأ. وصفنا تطوير واستخدام طريقة الحقن السريع لبدء رني خلال طور العذراء من آن. الغامبية. ونلاحظ أن حقن مرحلة العذراء لالزناد رني يمكن رصد الظواهر الناتجة في البالغين مرحلة مبكرة، أي عاجلا بعد ظهور من شأنه أن يلاحظ إذا بدأت الجينات ضربة قاضية في البالغين بعد ظهور. هذه الأساليب تمكن الجينات ضربة قاضية تبدأ خلال الفترة التنموي العذراء وتمتد إلى مراحل الكبار، بحيث إسقاط الموروثة بدأت خلال تطوير العذراء يمكن أن يستمر ويؤثر على الكبار في وقت مبكر أنواع الخلايا اللمف الدموي يمكن الوصول إليها، وكذلك أنواع الخلايا التي هي أكثر الدملمف الوصول اليها خلال التحول مما كانت عليه في الكبار، مثل الخلايا العصبية الحسية الموجودة في الزوائد الكبار بعد ظهور.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEGAscript RNAi kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II foot switch</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Narishigne</td>
			<td>PB-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1371150</td>
			<td>&#188; inch cut from tip to create a wider opening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman &#8220;thin&#8221; filter paper&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot &#8220;thick&#8221; filter paper</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>107-3931</td>
			<td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (size 0)</td>
			<td>Michael&#8217;s Art</td>
			<td>10474940</td>
			<td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting light microscope</td>
			<td>&#160;----&#160;</td>
			<td>-----</td>
			<td>This can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

حقن العذراء لعوائد الجينات دينار أفضل النتائج عندما يتم تنفيذ الحقن خلال طور العذراء في وقت مبكر، عندما إهاب دبغ مستويات منخفضة (الشكل 1A، اليسار، و1B). زيادة الدباغة وتصلب بشرة، عموما بعد 24 ساعة، والنتائج في زيادة مخاطر الوفاة العذراء بعد الحقن (الشكل 1A والوسط واليمين). معدل التنمية العذراء يمكن أن تختلف تبعا لظروف insectary وكثافة الحيوانات 24،25. لذا، فمن الأفضل لتقييم تصبغ بصريا. أثناء عملية الحقن، يتم إدخال إبرة الشعرية في إهاب الظهرية بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة في الجزء الأمامي إلى الاتجاه الخلفي (الشكل 2A). مرة واحدة يتم إدخال إبرة والرنا المزدوج الجديلة + 0.01٪ (ث / ت) يتم الاستغناء FGD، وتوزيع الصبغة هو واضح في جميع أنحاء الدملمف (فيقوإعادة 2B). تقييم ظهور الكبار لالشرانق حقن مع 0.01٪ (ث / ت) كشفت FGD بمعدل 70٪ ظهور، مقارنة مع 96.7٪ ظهور الضوابط غير حقن (الشكل 3A). وتجدر الإشارة، وقد لوحظ ظهور جزئي من حالة العذراء لعدد كبير من البعوض غير على قيد الحياة (الشكل 3B). الحيوانات المحقونة يحمل أي تأخير في وقت ظهور الشكل (4A) أو تأثير منحازة على كلا الجنسين (الشكل 4B). قام تقييم إضافي للبقاء الكبار ما يصل الى 10 يوما بعد ظهور يكشف أي تأثير واضح على بعد ظهور الكبار البقاء على قيد الحياة (الشكل 4C). وجرى تقييم التحقق من صحة دينار الجودة من قبل الميلاني شبه ورم (كتلة الأنسجة المصطبغة بحزن) النمط الظاهري المرتبطة SRPN2 ضربة قاضية 21،22 كعنصر تحكم إيجابية لضربة قاضية و<html> غياب الظواهر المرتبطة حقن dsLacZ كعنصر تحكم السلبية. وسجل البعوض البالغ الذي ظهر في يوم 8 بعد حقن (يوم 6-7 بعد ظهور). وقد لوحظت الميلانية الزائفة الأورام (الشكل 5A و5B) من خلال بشرة من 93.5٪ من dsSRPN2 مقابل 0٪ من البعوض dsLacZ الكبار (الشكل 6A). وقد تم تحديد مجموعات من الأنسجة melanized بحزن على تشريح من البقع المصطبغة (الشكل 5C). كانت شبه الأورام واضحة على بشرة الكبار في وقت مبكر من يوم 3 بعد ظهور وكانت أيضا حاضرة في مجموعة فرعية من dsSRPN2 الدملمف وأنسجة الأمعاء (لا تظهر البيانات). في 5 بعد الحقن (أوائل مرحلة البلوغ)، انخفضت بشكل ملحوظ SRPN2 المستويات في dsSRPN2، ولكن لوحظ عدم dsLacZ أو عزلات بروتين غير حقن الدملمف (الشكل 6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: انطلاق التنموي للحقن الرنا المزدوج الجديلة العذراء حقن العذراء المبكر للنتائج الرنا المزدوج الجديلة في البقاء على قيد الحياة الأمثل والتقدم إلى مرحلة الكبار. مستويات منخفضة من تصبغ بشرة (A، غادر، وباء) ويمكن ملاحظة في أول 0-24 ساعة التشرنق التالية. الدباغة من العذراء بشرة السابقة حقن (A والوسط واليمين) النتائج في معتدلة إلى الفقراء البقاء على قيد الحياة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> الشكل 2: موقف حقن وتوزيع المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة (A) شعري حقن إبرة المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة في إهاب الظهرية بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة، في سابقة لالخلفي الاتجاه. يتم توزيع (ب) صبغة واضح في الدملمف العذراء. حجم حقن الرنا المزدوج الجديلة من 138 نيكولا لانغ، وصفت مع 0.01٪ FGD (ث / ت). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> الشكل (3): بعد حقن ظهور الكبار (A) 70٪ من الشرانق حقن مع 0.01٪ FGD (ث / ت) ظهر بنجاح (ن = 60)، مقابل 96.7٪ من الضوابط غير حقن (ن = 60). أجريت ثلاث مكررات البيولوجية. وقد لوحظ (ب) ظهور الجزئي من حالة العذراء لعدد كبير من البعوض غير على قيد الحياة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> الشكل 4: معدل ظهور، وتقييم الجنس والكبار البقاء على قيد الحياة (A) لوحظت مرات ظهور المقارنة التالية حقن العذراء مع 0.01٪ FGD (24 ساعة = ​​80٪ و 48 ساعة = ​​20٪)، بالمقارنة مع العذارى غير حقن (24. ساعة = 83٪ و 48 ساعة = 17٪). (ب </strأونج&gt;) وقد لوحظ متساوية تقريبا من الذكور والإناث البالغات ظهور ل0.01٪ FGD الشرانق حقن (الإناث = 48٪ والذكور = 52٪) والشرانق غير حقن (الإناث = 52٪ والذكور = 48٪). تحليل (C) البقاء على قيد الحياة ويكشف أن حقن مع 0.01٪ FGD لا يؤثر بقاء البالغين، بتقييم ما يصل الى 10 يوما بعد ظهور. وتمثل نتائج البيانات من ثلاث تجارب مستقلة مع 0.01٪ FGD حقن (ن = 60) وعدم حقن (ن = 60) الشرانق (عدد متساو من الذكور والإناث). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> يعكس الزائفة الورم النمط الظاهري مراقبة إيجابية ضربة قاضية ناجحة لوحظت الزائفة الأورام على (A) في منطقة البطن و (ب) بشرة الصدر من dsSRPN2 -injected، ولكن ليس dsLacZ البعوض الكبار -injected في يوم 8 بعد الحقن: الرقم 5.(C) التكبير العالي (400X) التصوير (أ) من بشرة وتشريح بقع مصطبغة (ب) تكشف مجموعات من الخلايا melanized بحزن. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> الشكل 6: الكمي لتشكيل شبه الورم وانخفاض مستويات البروتين SRPN2 (A) حقن طور العذراء تؤدي إلى تشكيل شبه ورم في 93.5٪ من البالغين dsSRPN2 (ن = 21) مقابل 0٪ من الضوابط dsLacZ (ن = 19). . النتائج التي تم الحصول عليها يوم 8 بعد الحقن. (ب) لطخة غربية (يسار) يظهر انخفضت SRPN2 المستويات في dsSRPN2، ولكن ليس dsLacZ أو العزلات غير حقن البروتين الدملمف (يوم 5 بعد الحقن). النتائج على أساس ثلاث تجارب مستقلة. وكانت مكافحة SRPN2 21 و مكافحة SRPN3 التخفيفات 26 الأجسام المضادة المستخدمة 1: 1000 و 1: 2000، على التوالي. الماعز المضادة للراbbit مفتش-HRP (المنتج الشوري عام 2004، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، دالاس تكساس) كانت تستخدم في 1: 5000. وتم قياس كمية كل مستويات بروتين (يمين) من خلال كثافة الفرقة (يماغيج البرمجيات، المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD)، تطبيع SRPN3، وإحصائية مقارنة عن طريق اختبار ر مزاوج. P &lt;0.05: *، ف ≥0.05: نانو ثانية (لا كبيرة). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae at JoVE.com

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

رني الزناد تسليم إلى<em&gt; بعوض الملاريا</em&gt; شرانق

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.0K Views.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Video: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

بروتوكول للتربية البعوض (A. الغامبية)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

رني المترجمة خارج الرحم والتعبير الجيني في المستنزف الطبية

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

البكتيرية تسليم المستجيبات رني : Transkingdom رني

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

التسليم المباشر للMorpholinos MIF في Otocyst اسماك الزرد عن طريق الحقن وElectroporation يؤثر على التنمية الداخلية الأذن

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

وساطة رني ضربة قاضية بواسطة الجينات وTransgenesis Microinjection في نيماتودا Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

رني الزناد تسليم إلى

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video