研究は、米国立衛生研究所、国立癌研究所、癌研究センターの学内研究プログラムによって部分的にサポートされていました。

記載されたプロトコルは、ヒト組織試料の使用に関するNI​​Hルールに従って使用した。 1。組織標本<ol><li>開始する前に、治験審査委員会（IRB）のプロトコルに従って、ヒト組織標本を得る。 </li><li>組織/セルブロックとそれに対応する処理方法[ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）、冷凍、またはエタノール固定パラフィン包埋（EFPE）]の種類を選択します。ホルマリン固定はエタノール固定および急速冷凍した後、最適な組織像を提供しています。しかしながら、固定および組織処理方法は、下流の分子分析のためにDNA、RNA、およびタンパク質の量と質に影響を与えることができると考えるべきである。 </li><li>選択したスライド型（ガラス、膜、ガラス、または金属フレーム膜）上に組織/細胞ブロック切片を切った。 SIVQ分析は、すべての3のスライド型に対しても同様に動作します。ご注意ください擬似カバースリップ法キシレンとイーサンに（後述）スライドステージ上で反転されなければならないのでオールメタルフレームメンブレンスライド上で行うことができない。 </li><li>背景から目的の細胞を識別するために、化学またはIHCベースの組織染色を選択します。その染色方法はまた、DNA、RNA、および蛋白質および組織の量に影響を与えることができます。プロトコルを実行する前に、生体分子のベースラインの質を評価するために染色した後、組織をテストします。 DAB 15、免疫蛍光で免疫組織化学（IHC）、ファストレッド、 デノボレッド、トルイジンブルー、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）（未発表データ）：SIVQ-LCMを用いて染色した組織/細胞診スライド上で行われた。 </li></ol> 2。試料イメージング<ol><li>負荷は顕微解剖機器の電動ステージ上にスライドさせると関連するソフトウェアを起動します。ロードされたスライドの位置を指定し、撮影された画像ファイルはJPEG形式で保存されるべきであることを確認するためのチェックボックスをオンにします。 </li><li> IMを最適化年齢マニュアルフォーカスホイールまたは切開具のソフトウェアを介してのいずれかを用いて、画面上の画像の明るさ、焦点を調整することにより品質。 <ol><li>解剖器のソフトウェア内の画像のツールボックスを使用して、適切にランプの明るさやカメラのゲインを設定します。値の例は、ディフューザと、明るさ= 60とゲイン= 220である。 </li><li>手動で、またはソフトウェアでのオートフォーカス機能でピント合わせ。 </li></ol></li><li>解剖プロセスのためのロードマップを提供するために、スライドのサムネイルの概要イメージをキャプチャします。 <ol><li> uncoverslippedスライドの最適な画像品質を得るには、測定器、凝縮器下のディフューザーを使用する、または、耐火インデックス（擬似カバースリップ）を向上させるために、エタノールまたはキシレンのどちらかを少量（〜30μl）を加える。キシレンを使用する場合は、換気フード、保護白衣、アイゴーグル、手袋の使用を含め、これらは有毒で、適切な安全対策を使用しなければならないしていることに注意してください。 </li><li>エタノールまたはキシレン溶液が完全にクリアされたか、キャップ上のポリマーが歪みますまで、スライド上のLCMキャップを置かないでください。 </li></ol></li><li>スライドを移動して、10X、20X、40Xまたは倍率で解剖されるべき領域の画像をキャプチャします。必要に応じて、以前に22を説明したように（マイクロソフトオフィスピクチャーマネージャーで）などの自動修正などのソフトウェアを使用してイメージを高める。画像は、彼らが自動化された選定ソフトに再インポートできるようにJPEG形式でキャプチャする必要があります。 </li></ol>画像の3。アルゴリズムの解析<ol><li>転送はSIVQフォルダに顕微解剖機器からの映像を捕獲した。解剖器に接続されたコンピュータ上でArcturusXT、オートスキャンとSIVQソフトウェアパッケージをインストールして開きます。 SIVQソフトウェアへのアクセスのために、博士はユリシーズバリス（ulysses@med.umich.edu）までお問い合わせください。 </li><li>オープンSIVQ、目的の撮影した画像（JPEG）をロードします。&lt;/李&gt; <li>関心のある領域に移動し、/または表示窓（ビューポート5および6）のサイズを調整します。 SIVQソフトウェアでは、ビューポート5は、前処理画像を示すとビューポート6は、後処理画像16を示している。 </li><li>リングベクトルと、使用するリングの数のサイズを選択します。 </li><li>ビューポート6でそれを右クリックしてキャプチャされる述語画像特徴を選択します。 </li><li>画像を分析する「スキャン」をクリックしてください。 </li><li> 2つのスライドバーを利用した画像マッチングの統計的確率を調整します。上部のバーには、全体のベクトル特異性を調整し、（選択された「統計」変数で定義されている感度の）過度含ま面積を表すことができ、初期スキャンから地域を除外するために使用されている。逆に、下側スライダーは、スキャンが実行された後に試合であると分類された領域の増大を意図して、感度を高めるために利用される。これらのスライダコントロールの両方がUTI初期ベースライン感度閾値としてリゼ &quot;統計&quot;変数。 </li><li>画像を保存するには、（画像は現在C :/ vq_testフォルダ/写真に保存されている）「JPEGとして保存」をクリックしてください。 </li><li>アルゴリズムを用いて画像を分析します。アルゴリズム解析の出力はSIVQ-LCMに使用されるための注釈画像をもたらす必要がある。現在、SIVQコアエンジンの現在のバージョンは、フル生産バージョン（利用可能Q1 2014）の単純化された統合のための完全なソフトウェア開発キット（SDK）、アプリケーション·プログラミング·インターフェース（API）を組み込むことを見込んでベータ版テスト中ユーザが生成した空間フィルタと、コアリングマッチングエンジン下流ワークフローデータ処理ステップ。このSDKには、ドキュメントの完全なセットと一緒に配布されます。 <ol><li> SIVQヒートマップを均一赤色に変化していることを確認します。 </li></ol></li><li>画像をエクスポートします。これは、Pに位置座標を再埋め込むことが不可欠であるオリジナルの解剖計器イメージからファイルヘッダに貼り付けることが進エディタを使用して、OST分析JPEG画像。適切なデータ」は、画像の開始」マーカー（0xFFの、0xD8）と第「量子化テーブルを定義する「マーカー（0xFFの、0xDB）との間で見つけることができる。 </li></ol> 4。マイクロダイセクション<ol><li>画像はSIVQ解析のために捕獲された関心領域の中心にLCMキャップを置きます。 </li><li>キャリブレーションと品質管理（QC）、UV / IRレーザーとパワー、継続時間、レーザーの位置、および（メーカーが推奨するように）、UVカット速度を含むパラメータを最適化します。解析された画像を再インポートする前に、これらのキャリブレーションを実行します。 </li><li>オープンAutoScanXT（自動化された選択ソフトウェア）およびc :/ vq_testフォルダ/写真から解析された画像をインポートします。 </li><li> SIVQ注釈を認識し、解剖マップを作成するための自​​動化された選択ソフトウェアを訓練。 <ol><li> TRAIを作成するには寧ファイル、SIVQ解析された画像の「赤ペンキ」に（「青い円」でマーク）は、対象の4領域を選択する。 </li><li>解剖されるべきではなく、（「赤い四角」でマーク）背景領域を選択します。 </li><li>その後の使用のために保存することができ、トレーニングファイルを生成するために、「分析」ボタンをクリックしてください。 </li></ol></li><li>適切な赤外線（IR）および/または紫外線（UV）レーザを使用したマイクロダイセクションを行う。 <ol><li> 「ライブ」画像に、選択した領域をコピーします。 </li><li> 「顕微解剖」ツールボックスで、適切なIRキャプチャやUVカットのボタンを選択します。 </li></ol></li><li>切開が完了した後、QC局にLCMキャップを移動させ、解剖した組織/細胞の画像を取り込む。別のアプローチは、これは、ユーザが様々な倍率で撮影することができ、従来QCステーションに移動するスライドの空白領域上にキャップを配置することである。 </li><li>効率をさらに引き上げる評価するためにマイクロダイセクション後に、関心のある組織領域の画像をキャプチャします。 </li><li>所望の細胞が正常に解剖されている場合は、下流の分析のための分子の抽出手順を開始するArcturusXTソフトウェアで「現段階」ボタンをクリックし、LCMキャップを取り外します。 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

マイケル·R·エマート、バックにはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションをカバーするNIH-保有する特許に関する発明者であり、NIH技術移転プログラムを通じてロイヤルティ報酬を受け取る。

私たちは、FFPEヒト乳房組織から免疫染色上皮細胞を顕微解剖するSIVQ-LCMの適用のためのプロトコルを提示する。例えばSIVQなどの画像解析アルゴリズムの使用は、実践的な顕微解剖処理に要する時間の量を減少させる。オペレータの時間と労力は、通常、目的の細胞の正確な解剖のための律速段階であるので、これはフィールドの潜在的に重要な進歩である。それは可能性が高いだけでなく、...

もともと、1990年代半ばに開発されたレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、正確に微小な可視化1、2を介して組織学的組織切片から特定 ​​の細胞または細胞領域をキャプチャすることを可能にする。組織の擦り傷に対してLCMの分子分析を比較する多くの研究は、方法3-12の値を示している。また、13、14を表示するために利用可能な技術の3つのビデオプロトコルの出版物があります。関心対象の標的が不均一組織切片中の分散細胞集団である場合、又は多数の細胞は、例えばプロテオミクスのような特定のダウンストリームアプリケーションに必要とされるときが、その実証された値にもかかわらず、LCMは、退屈で面倒であることができる。人間のオペレータの負担は、LCMプロセス15をガイドするために強力な画像解析アルゴリズムを組み合わせることで、LCMのための半自動化された解剖的なアプローチを開発するために私たちを導いた。 &lt;ミシガン大学と共同で、Pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt;、NIHの研究室では、拡張され、以前に開発され、固有の組織選択プロセスを半自動化することを可能にするための方法で空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）アルゴリズムを報告したこのように念頭に置いて、病理学者や生命科学者で利用可能なツールとなり、マイクロダイセクションを導いた。空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）は、ユーザーが単純に統計的閾値の調整、全体の組織学的画像を検索するために使用することができ、リングベクトル（述語画像特徴）を作成し、目的の組織学的な特徴を「クリック」することを可能にするアルゴリズムです16〜21を必要に応じて実行します。得られた熱マップは初期述語画像特徴との一致の品質を表示し、その後に、LCM機器にインポートすることができ、単一の色（赤）の注釈マップに変換されます。自動化された選択ソフトウェア、AutoScanXTは、次に基づいてマップを描画するために使用されるSIVQの注釈に組織サンプルからの標的細胞の捕捉を案内する。以下の詳細なプロトコルは、マイクロダイセクションワークフローにSIVQの実装について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCMは、より伝統的な、ユーザ依存レーザー解剖プロセスを自動化し、合理化する新たな方法論である。それは、高度な、急速にカスタマイズ可能なレーザー解剖プラットフォーム技術の創出を目指しています。本稿では、ArcturusXT機器に画像解析ソフトウエア空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）の統合について説明します。 ArcturusXTシステムは、特定の細胞や大面積の解剖を可能に赤外線（IR）、紫外線（UV）レーザーの両方が含まれています。主要な目標は、速度、精度、およびサンプルスループットを向上させるレーザー解剖の再現性を改善することである。この新しいアプローチは、研究と臨床のワークフローで動物およびヒト組織の両方のマイクロダイセクションを容易にします。

FFPEヒト乳房組織切片は、標準的なIHCプロトコール23を用いてサイトケラチンAE1/AE3に対して免疫染色した。染色後、組織スライドはArcturusXTステージ上に置き、上記のようにSIVQ-LCMプロトコルが開始した。組織顕微解剖のためにカバースリップすることができないので、+ IHC染色された細胞は、視覚的に（ 図1A）を識別することは困難である。これにより、より良好な屈折?...

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SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCMは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のプロセスを駆動するために、コンピュータアルゴリズム、空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）を活かした革新的なアプローチである。 SIVQ-LCMのワークフローを大幅に研究と臨床現場の両方でアプリケーションと、マイクロダイセクションの速度と精度を向上させます。

ArcturusXT楽器のSIVQ-LCMプロトコル

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K ビュー.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCMは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のプロセスを駆動するために、コンピュータアルゴリズム、空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）を活かした革新的なアプローチである。 SIVQ-LCMのワークフローを大幅に研究と臨床現場の両方でアプリケーションと、マイクロダイセクションの速度と精度を向上させます。 

ビデオ: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

生物学

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

好中球単離プロトコル

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

KLRG1テトラマーの生産のためのプロトコル

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

コンピュータベースのタンパク質の構造と機能の予測のためのプロトコル

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、<em&gt;ヒトスジシマカ</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

遺伝子を使用するプロトコル設定トランスレーショナルリサーチの適切な動物モデルを識別するために濃縮分析

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

画像解析のためのクロックスキャンプロトコル：ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

ArcturusXT楽器のSIVQ-LCMプロトコル

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