Lo studio è stato sostenuto in parte dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Il protocollo descritto è stato assunto alle norme NIH sull&#39;uso di campioni di tessuto umano. 1. Tissue Preparazione <ol><li> Prima di iniziare, di ottenere campioni di tessuto umani secondo Institutional Review Board (IRB) protocolli. </li><li> Scegliere il tipo di blocco tessuti / cellule e il corrispondente metodo di lavorazione [fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE), congelati, o etanolo-fisso incluso in paraffina (EFPE)]. Fissazione in formalina fornisce istologia ottimale, seguito da etanolo fissazione e flash congelati. Tuttavia, la fissazione e del tessuto metodi di lavorazione possono influenzare il DNA, RNA, e la quantità di proteine ​​e di qualità per l&#39;analisi molecolare a valle e devono essere considerati. </li><li> Tagliare le sezioni di blocco di tessuto / cellule sul vetrino tipo (vetro, vetro membrana o membrana struttura in metallo) di scelta. Analisi SIVQ funziona altrettanto bene su tutti e tre i tipi di diapositive. Si prega di notare che il metodo pseudo-coprioggetto (descritto di seguito) con xileni e Ethanolo non può essere eseguita sui vetrini membrana struttura in metallo poiché il vetrino deve essere invertita sulla scena. </li><li> Selezionare una macchia tessuto-chimica o basata su IHC per identificare le cellule di interesse dallo sfondo. Si noti che i metodi di colorazione possono anche influenzare DNA, RNA, e la qualità e quantità del tessuto proteina. Testare il tessuto dopo colorazione per valutare la qualità di base di biomolecole prima di procedere con il protocollo. SIVQ-LCM è stata eseguita su vetrini di tessuto / citologici colorati con: immunoistochimica (IHC) con DAB 15, immunofluorescenza, rosso veloce, de novo rosso, blu di toluidina, e ematossilina ed eosina (H &amp; E) (dati non pubblicati). </li></ol> 2. Campione Imaging <ol><li> Caricare scivola sul palco motorizzato dello strumento microdissezione e lanciare il software relativo. Selezionare le caselle di controllo per indicare le posizioni dei vetrini caricati e assicurare che i file immagine catturati devono essere salvati in formato jpeg. </li><li> Ottimizzare l&#39;imqualità età regolando la luminosità e la messa a fuoco dell&#39;immagine sullo schermo, utilizzando la ruota messa a fuoco manuale o tramite software dello strumento di dissezione. <ol><li> Utilizzo degli immagine nel software dello strumento dissezione, impostare la luminosità della lampada e la fotocamera guadagno adeguato. I valori di esempio sono luminosità = 60 e il guadagno = 220, con il diffusore. </li><li> Mettere a fuoco manualmente o con la funzione autofocus nel software. </li></ol></li><li> Catturare un&#39;immagine panoramica miniatura della diapositiva per fornire una tabella di marcia per il processo di dissezione. <ol><li> Per una qualità d&#39;immagine ottimale di uno scivolo uncoverslipped, utilizzare il diffusore sotto il condensatore sullo strumento, o, aggiungere una piccola quantità (~ 30 ml) di etanolo o xileni a migliorare l&#39;indice refrattario (pseudo-vetrino). Quando si utilizza xileni, essere consapevoli del fatto che sono devono essere utilizzate misure di sicurezza tossici e propri, compreso l&#39;uso di una cappa aspirante e camice protettivo, occhiali e guanti. </li><li> NON collocare il tappo LCM sulla diapositiva fino a quando la soluzione di etanolo o xileni ha completamente eliminato o il polimero sul tappo sarà distorta. </li></ol></li><li> Passare il vetrino e catturare le immagini delle aree da sezionati a 10X, 20X, 40X o ingrandimento. Se necessario, migliorare l&#39;immagine con software come Correzione automatica (in Microsoft Office Picture Manager), come descritto in precedenza 22. Le immagini devono essere acquisite in formato jpeg per consentire loro di essere re-importati nel software di selezione automatica. </li></ol> 3. Algoritmo analisi dell&#39;immagine <ol><li> Trasferimento immagini catturate dallo strumento microdissezione alla cartella SIVQ. Installare e aprire i pacchetti software ArcturusXT, scansione automatica e SIVQ sul computer collegato allo strumento dissezione. Per l&#39;accesso al software SIVQ, si prega di contattare il Dott. Ulisse Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Aprire SIVQ e caricare l&#39;immagine catturata (jpeg) di interesse. &lt;/ Li&gt; <li> Passare alla zona di interesse e / o regolare le dimensioni delle finestre di visualizzazione (viewport 5 &amp; 6). Nel software SIVQ, Viewport 5 mostra l&#39;immagine di pre-elaborazione e Viewport 6 mostra l&#39;immagine post-processing 16. </li><li> Scegliere la dimensione del vettore anello e il numero di anelli da utilizzare. </li><li> Selezionare la funzione immagine predicato di essere catturato facendo clic destro su di esso nella Viewport 6. </li><li> Fare clic su &quot;scan&quot; per analizzare l&#39;immagine. </li><li> Regolare la probabilità statistica di immagine abbinamento con le due barre di scorrimento. La barra superiore regola la specificità complessiva vettore, ed è utilizzato per escludere area dalla scansione iniziale (con sensibilità come definito dalla variabile selezionato &quot;Stat&quot;) che può rappresentare eccessivo zona compresa. Al contrario, il dispositivo di scorrimento inferiore è utilizzata per aumentare la sensibilità, dopo aver eseguito una scansione, con l&#39;intento di Superficie crescente che è classificato come una corrispondenza. Entrambi questi controlli a cursore UtiLize la variabile &quot;Stat&quot; come soglia iniziale sensibilità di base. </li><li> Per salvare l&#39;immagine, fare clic su &quot;salva come jpeg&quot; (immagine viene salvato in c :/ vq_test cartella / foto). </li><li> Analizzare l&#39;immagine con l&#39;algoritmo. L&#39;output dell&#39;analisi algoritmo deve generare un&#39;immagine commentato per poter essere utilizzato in SIVQ-LCM. Allo stato attuale, la versione attuale del motore di base SIVQ è in versione beta test con l&#39;aspettativa che la versione di produzione completa (disponibile Q1 2014) incorporerà un kit di sviluppo software completo (SDK) e l&#39;interfaccia di programmazione delle applicazioni (API) per l&#39;integrazione semplificata di filtri spaziali generati dagli utenti e valle fasi di elaborazione dei dati di flusso di lavoro con il motore principale anello di corrispondenza. Questo SDK sarà distribuito con una serie completa di documentazione. <ol><li> Assicurarsi che il heatmap SIVQ viene modificato in un colore rosso uniforme. </li></ol></li><li> Esportare l&#39;immagine. È essenziale incorporare nuovamente le coordinate posizionali nella post-analisi delle immagini jpeg utilizzando un editor HEX per incollare nell&#39;intestazione del file dall&#39;immagine originale strumento di dissezione. I dati appropriati possono essere trovati tra &quot;Start dell&#39;Immagine&quot; marcatore (0xFF, 0xD8) e la prima &quot;Definisci quantizzazione Table&quot; marcatore (0xFF, 0xDB). </li></ol> 4. Microdissezione <ol><li> Posizionare il tappo LCM al centro della regione di interesse, in cui sono stati catturati immagini per l&#39;analisi SIVQ. </li><li> Calibrare e Controllo Qualità (QC) i laser UV / IR e ottimizzare i parametri, tra cui il potere, la durata, sedi laser, e la velocità di taglio UV (come consigliato dal costruttore). Eseguire queste calibrazioni prima di ri-importare l&#39;immagine analizzata. </li><li> Aprire AutoScanXT (software di selezione automatica) e importare l&#39;immagine analizzata da c :/ vq_test cartella / foto. </li><li> Addestrare il software di selezione automatica per riconoscere l&#39;annotazione SIVQ e creare la mappa dissezione. <ol><li> Per creare un traifile di ning, selezionare quattro regioni di interesse (contrassegnate da &quot;cerchi blu&quot;) in merito alla &quot;vernice rossa&quot; dell&#39;immagine analizzata SIVQ. </li><li> Selezionare le aree di sfondo (contrassegnate da &quot;piazze rosse&quot;) che non devono essere sezionato. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Analizza&quot; per generare il file di allenamento, che può essere salvato per usi successivi. </li></ol></li><li> Eseguire microdissezione usando l&#39;appropriato infrarossi (IR) e / o con raggi ultravioletti (UV) laser. <ol><li> Copiare le aree selezionate sulla immagine &quot;live&quot;. </li><li> Nella casella degli strumenti &quot;microdissect&quot;, selezionare i pulsanti di taglio UV cattura IR appropriato o. </li></ol></li><li> Dopo la dissezione è completa, spostare il tappo LCM alla stazione di controllo di qualità e catturare un&#39;immagine dei sezionato tessuti / cellule. Un altro approccio è quello di mettere il tappo su un&#39;area vuota della diapositiva prima di passare alla stazione QC, questo permette all&#39;utente di scattare foto a vari ingrandimenti. </li><li>Acquisire un&#39;immagine dell&#39;area tessuto di interesse dopo microdissezione per valutare ulteriormente sollevamento efficienza. </li><li> Se le cellule desiderati sono stati sezionati con successo, fare clic sul pulsante &quot;fase attuale&quot; nel software ArcturusXT e rimuovere il tappo LCM di avviare il procedimento di estrazione molecolare per l&#39;analisi a valle. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing.">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li><li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens.">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine.">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711 (2013).</li><li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

Michael R. Emmert-Buck è un inventore sui brevetti NIH-detenuti che coprono cattura microdissezione laser e riceve pagamenti basati free attraverso il Programma di trasferimento NIH Technology.

Vi presentiamo un protocollo per l&#39;applicazione di SIVQ-LCM per microdissect cellule epiteliali immunostained da FFPE tessuto mammario umano. L&#39;uso di un algoritmo di analisi di immagine, come SIVQ, riduce la quantità di hands-on tempo necessario per il processo di microdissezione. Questo è un avanzamento potenzialmente importante per il campo da tempo e fatica dell&#39;operatore è tipicamente il fattore limitante per la dissezione precisa di cellule di interesse. Nel presente protocollo, abbiamo specificamen...

Originariamente sviluppato a metà degli anni 1990, microdissezione laser (LCM) permette all&#39;utente di catturare con precisione le cellule specifiche regioni o cellulari da una sezione di tessuto istologico via visualizzazione microscopica 1, 2. Molti studi confrontando analisi molecolare di LCM contro graffi tessuto illustrano il valore del metodo 3-12. In aggiunta, ci sono tre pubblicazioni protocollo video sulla tecnologia che sono disponibili per la visualizzazione 13, 14. Tuttavia, nonostante il suo valore dimostrato, LCM può essere noioso e laborioso quando il bersaglio di interesse è una popolazione cellulare dispersa in una sezione di tessuto eterogeneo, o quando un gran numero di cellule sono necessari per successivi utilizzi specifici come proteomica. L&#39;impatto con l&#39;operatore umano ci ha portato a sviluppare un approccio dissezione semi-automatico per LCM combinando un algoritmo di analisi di immagine potente per guidare il processo LCM 15. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In collaborazione con l&#39;Università del Michigan, il nostro laboratorio presso il NIH ha esteso il già sviluppato e riportato spazialmente invariante quantizzazione vettoriale algoritmo (SIVQ) in modo tale da consentirgli di semi-automatizzare il processo di selezione del tessuto intrinseco guidata microdissezione, rendendo così disponibile uno strumento con il patologo o scienziato vita in mente. Spazialmente invariante quantizzazione vettoriale (SIVQ) è un algoritmo che permette all&#39;utente di semplice &quot;click&quot; su una caratteristica istologica di interesse per creare un vettore anello (caratteristica immagine predicato) che può essere utilizzato per verificare l&#39;intera immagine istologica, regolando la soglia statistica se necessario 16-21. La mappa di calore risultante mostra la qualità di partite alla funzione iniziale dell&#39;immagine predicato e viene successivamente convertito in un singolo colore (rosso) annotazione mappa che può essere importato nello strumento LCM. Il software di selezione automatica, AutoScanXT, viene poi utilizzato per disegnare una mappa basatasulla nota di SIVQ guidare la cattura delle cellule bersaglio del campione di tessuto. Il protocollo dettagliato di seguito descrive l&#39;implementazione del SIVQ nel flusso di lavoro microdissezione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM è una nuova metodologia che automatizza e semplifica il più tradizionale, il processo di dissezione laser user-dipendente. Esso mira a creare un avanzato, la tecnologia della piattaforma dissezione laser rapidamente personalizzabile. In questo rapporto, descriviamo l&#39;integrazione del software di analisi dell&#39;immagine spazialmente invarianti quantizzazione vettoriale (SIVQ) sullo strumento ArcturusXT. Il sistema ArcturusXT contiene sia un infrarossi (IR) e ultravioletti (UV) laser, consentendo cella specifica o grandi dissezioni zona. Lo scopo principale è quello di migliorare la velocità, la precisione e la riproducibilità della dissezione laser per aumentare la produttività del campione. Questo nuovo approccio facilita la microdissezione sia di tessuti umani nella ricerca e flussi di lavoro clinici e animale.

Una sezione di tessuto mammario umano FFPE è stato immunostained per citocheratina AE1/AE3 utilizzando un protocollo IHC standard 23. Dopo la colorazione, la diapositiva tessuto è stato posto sul piatto ArcturusXT e il protocollo SIVQ-LCM è stato avviato come descritto sopra. Poiché il tessuto non può essere coprioggetto per microdissezione, le cellule colorate + IHC possono essere difficili da distinguere visivamente (Figura 1A). Così, per fornire una migliore corrispondenza dell&#39;i...

Watch this Scientific Journal Video about SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument at JoVE.com

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM è un approccio innovativo che sfrutta un algoritmo informatico, spazialmente invarianti quantizzazione vettoriale (SIVQ), a guidare il processo di microdissezione laser (LCM). Il flusso di lavoro SIVQ-LCM migliora notevolmente la velocità e la precisione di microdissezione, con applicazioni sia nella ricerca e cliniche.

SIVQ-LCM protocollo per lo strumento ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Views.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM è un approccio innovativo che sfrutta un algoritmo informatico, spazialmente invarianti quantizzazione vettoriale (SIVQ), a guidare il processo di microdissezione laser (LCM). Il flusso di lavoro SIVQ-LCM migliora notevolmente la velocità e la precisione di microdissezione, con applicazioni sia nella ricerca e cliniche. 

Video: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protocollo per la cura dei Mosquito (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Ricerca

Biologia

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Neutrofili isolamento Protocollo

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

Un protocollo per la produzione di KLRG1 tetramero

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

Un protocollo per la Computer-Based Protein Structure Prediction e Funzione

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

Protocollo di controllo dell&#39;orologio per l&#39;analisi delle immagini: plugin ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

SIVQ-LCM protocollo per lo strumento ArcturusXT

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video