私たちは、アダム·コスターで親切なフィードバックや議論のためのAltschulerと呉ラボの他のすべてのメンバーに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所によってサポートされていましたR01 GM085442とCA133253（SJA）、R01 GM081549（LFW）、CPRIT RP10900（LFW）、およびウェルチ財団、I-1619（SJA）とI-1644（LFW）を付与します。

1。準備サンプルとイメージング<ol><li>細胞培養<ol><li>日常の文化を分割し、20から70までパーセントコンフルエンスで維持する。実験前に、ある日、（材料の表を参照して、ダルベッコ改変イーグル培地）、DMEMでHeLa細胞を成長させ、10％FBS（ウシ胎児血清）および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。 </li><li>実験の日に、分割細胞は、培養（約50％コンフルエント）に成長している。 </li><li>数秒間トリプシン/ EDTA（エチレンジアミン四酢酸）の約2ミリリットルに公開、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄。過剰トリプシン/ EDTAを吸引し、約3分間RTでフード内トリプシン/ EDTAの薄膜を浴びた細胞を維持する。 </li><li>機械的に二度振盪フラスコ、血清添加培地で細胞を剥離。細胞を計数し、メディアの5000 cells/50μlに希釈し、すぐにうまく自動液体処理ロボット（唯一の30を使用して384ウェルガラスボトムプレートに50μL/ウェルプレートプレートのS）は、ここで使用されている。 </li><li>ウェル5内のエッジ効果を最小にするために室温で30分間プレートをインキュベートする。一晩37℃/ 5％CO 2インキュベーター中でRTインキュベーション、場所プレートた。 </li><li>各薬剤は、二重にアッセイする。プレートは、既にメディアを含む上の対応するウェルへの薬物の25を添加する。 </li><li> 24時間後の薬物治療におけるPBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液でプレートを固定する。 </li></ol></li><li>染色 ここで使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。 <ol><li>透過処理3分間TBS中の0.2％トリトンX-100溶液（トリス緩衝食塩水）で細胞を固定し、TBST（トリス緩衝食塩水+ Tween 20）で3回洗浄した。ブロッキングのためTBST中5％BSA（ウシ血清アルブミン）溶液を加える。 </li><li>室温で2時間プレートをインキュベートし、その後、TBSTで3回洗浄する。 </li><li>一次抗体dilutを作るTBST中の5％BSA中のイオン（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。室温で2時間プレートをインキュベートした後、TBSTで3回洗う。 </li><li> TBST中二次抗体dilutionin 5％BSAを作る（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。 </li><li>室温で2時間暗所に静置し、その後、TBSTで二回洗う。 </li><li> PBSに（材料の表を参照）ヘキストおよびファロイジンのための希釈液を調製し、同様に10μL/を追加します。 </li><li> RTで30分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>後の2 TBST洗浄、4℃のCO / Nの箔とストア内のカバープレート</li></ol></li><li>イメージング 1x1のカメラのビニングで20X対物レンズを用いた落射蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。 480イメージ（X3チャンネル）の合計、各ウェルのための16の画像を取得。 </li></ol> 2。画像を分析するダウンロードしphenoripper.orgからPhenoRipperをインストールし、IMAの分析を開始しPhenoRipperを起動GES。 PhenoRipperは現在、TIFF、PNG、およびJPEGとMATLABでサポートされているすべての他のフォーマットを（顕微鏡のソフトウェアは、通常のTIFFにエクスポートをサポート）をサポートしています。 2.1データのロード<ol><li>標準的な名前付け/組織規則は、ローディングイメージと関連付けるメタデータにすることができる顕微鏡画像、存在しない（このような治療のタイプなどすなわち実験注釈を、よく数など）のワークフローの中で最も困難な部分。提示された方法（後述）のいずれかを選択します。 <ol><li> PhenoLoader：必要に応じてファイル名および/ ​​またはディレクトリ構造（ 例えば 、B16 HeLa_Drug5-DAPI.pngイメージがよく、B16からのものであることを示している可能性があり、グループのイメージに十分な情報が含まれている場合に、データをロードし、半自動的に、このオプションを選択し、細胞を処理し、この命名規則と、うまくA1または薬物5で処理されたからすべての画像を簡単にグループ化することができる） - IDが5であり、画像は、核のDAPI染色を捕獲薬剤と。ウィザードの意志画像群とメタデータを関連付けると、次のようにマーカーを定義するためのステップバイUserステップをガイド。 <ol><li> PhenoLoaderウィンドウにアクセスするには、「ファイル構造」をクリックします。 </li><li>画像データセットを含むディレクトリを選択して「ルートディレクトリを定義」をクリックします。次に、解析（オプション、空のままにすることができます）のために使用されていないファイル（使用されていないファイル）をフィルタリングします。 </li><li>実験に使用したバイオマーカーを指定し、画像とそれらを関連付けるための「マーカーの定義」をクリックします。具体的には、一意のバイオマーカーを特定し、ファイル名の一部を選択して、画像ファイルをクリックしてください。最後に、各バイオマーカーの名前を入力します。 </li><li>各画像に情報を関連付けるために「メタデータを定義する」をクリックします。具体的には、画像ファイルをクリックして[画像情報（よく名の例： &quot;B16&quot;）を特定し、ファイル名の一部を選択します。ウィンドウには、グループ名（ 例： &quot;を求め我LL &quot;）の名前を入力し、ポップアップ表示されます。ファイル名から抽出されたグループのメンバーが） 例えばよく名前の完全なリスト（グループテーブルに表示されます。ファイル名に存在しない付加的な情報を追加するには、をクリックして「 （オプション）次の「追加のグループ名（ 例：入力し「メタデータグループの追加」ボタンをクリックして「薬剤」）と、事前に定義されたグループの各値（ 例えば 「ウェル」）、その値を入力します（ 例：「タキソール」） 。加えることができる付加的なグループの数に制限はない。 </li><li>最後に、メタデータファイルを生成し、解析を継続して &quot;作成Metadatafile」をクリックしてください。メタデータファイルが以前に生成された場合、上記のステップは、直接オプション（下記3に記載されている）「メタファイル」を使用してファイルをロードすることによって回避することができる。 </li></ol></li><li>正規表現ベースのテンプレート：正規表現は、パターンにマッチするための標準的なアプローチであるテキスト内。ファイル名および/またはディレクトリ構造は、グループのイメージに十分な情報が含まれており、命名規則は、既存のテンプレートのいずれかと一致する場合に、このオプションを選択します。正規表現に基づいたカスタムテンプレートは、手動で定義され、再使用することができる。この高度なオプションは、正規表現に精通してユーザーにお勧めします。 </li><li>メタデータファイル：究極のカスタマイズ性のため、このオプションを選択します。定義し、カンマ区切り値、各画像に関連付けられたファイル名やメタデータを含む（CSV）ファイルをロードします。ファイル形式の例では、Webサイト（phenoripper.org）のダウンロード部分で提供されています。単純にそれに含まれる情報を表示するインタフェースを介してファイルをロードします。 </li></ol></li><li>冗長なサンプリングを避けるために、実験での反復を定義するメタデータフィールドを選択します。 IMPRでき（良くするなど ）、それらを一緒にグループ化し、複製物を（ウエル内などの全ての画像のようになります）が含まれているデータ·セットの場合オベパフォーマンス。ほとんどの場合、ランダムなサブセットを選択し、デフォルトのオプション「ランダム（知らない）」を選択することが合理的である。 </li></ol> 2.2解析パラメータの設定データセットを処理するのに必要なパラメータを定義する」に設定パラメータ」をクリックします。定義するパラメータは、左側のパネルにあります。右側のパネルには、データセットのマージされたサンプルが表示されます。異なる画像を切り替えるために、左/右の矢印をクリックしてください。 <ol><li>閾値強度：大体のイメージの細胞部分（というよりも、バックグラウンド、非細胞領域）を識別するために、適切なしきい値を選択します。閾値はPhenoRipperによって事前に計算されるが、画像の上に利用可能なスクロールバーを使用して、細胞領域の強調表示を改善するように調整されてもよい。選択された閾値は、すべての画像にまたがって機能しない場合は、むしろ細胞領域を落とすよりも非細胞領域を含むように、しきい値を下げる。 </li><li>ブロックSIZE：グリッドに画像をピクセル単位で適切なブロックサイズを選択してください。指定されたサイズのブロックが画像に重畳される。 20から30ブロック/セルの平均値を得るために、ブロックサイズを調整します。 「ブロックサイズ」フィールドの前にあるチェックボックスに画像クリック上にグリッドを重ね合わせる。 </li><li>オプションのパラメータ：自動スケーリング画像は希望の相対強度を有するマーカーが表示されていない場合（ 例えば 1色が飽和している）、またはマーカーが分析からドロップする必要がある場合は、「チャネルの強さを調整」オプションを使用します。マーカーのサブセットに細胞領域を識別するために、オプションの「しきい値のために使用されるチャネル」を使用しています。他のパラメータのデフォルトの選択は、通常は十分ですが、必要であれば、「高度な解析オプション」を使用してそれらを調整します。 </li><li>メインアプリケーションパネルの「PhenoRip」を押して、分析を実行します。 PhenoRipperは、自動的に画像内の再発のブロックタイプを識別します。表現型のプロファイルが生成されます各画像は、その中に様々なブロックタイプの分画に基づく。 </li></ol> 3。探検結果<ol><li> PhenoBrowser（ 図1）を使用して画像の表現型のプロファイル間の関係を探る。 PhenoBrowserインタフェースは、4つのパネルで構成されています。左上のパネルには、異なる画像/条件との間の相対的な類似性のグラフィカルな表現（散布図）、選択された条件の右側の表示のサンプル画像上の2パネル、および最後のパネル（棒グラフである）は、その表現型のプロファイルを比較します。 </li><li> 「データ処理」メニューを使用して &quot;空のフレームを廃棄する」。 </li><li>低品質の画像を削除する：第一に、個々の画像は、「データ処理」メニューからグループ化をオフに勉強する。次に、散布図における外れ値の点をクリックすると（ 例えば 、焦点のうち、染色アーティファクト）低品質の画像を破棄します。 </li><li>データを調べる：フィールド定義のメタデータを決定し比較の基本単位（ 例えば 、薬剤を比較し、メタデータ·フィールドの値が同じ「薬物」の画像がグループ化される必要がある）。 「グループ化」を持つ単一のデータポイントにこのメタデータ·フィールドの同じ値を持つすべてのイメージを折りたたむ。例えば、薬物によるグループ化は、薬剤ごとに1ポイントを得るために、各薬剤の中に画像を平均化する。散布図に近い（または遠隔）の点は、同様の（または異なる）細胞の表現型を引き出す条件を反映している。解釈可能を支援するために利用可能なメタデータに基づいて、色やラベルの点（データ表示]メニュー）。 3Dプロットは、「回転可能」チェック·ボックスをクリックして、左ボタンをクリックして、その上でマウスをドラッグして回転可能である。 </li><li>これらを直接比較するために2つの異なる点を選択します。画像パネルは、各ポイントのサンプル画像が表示され、バーグラフパネルは、その出現頻度が2点間の最も異なるブロックタイプが表示されます。 </li><li> Cを起動しますブロックの種類や実験条件との関係をよりグローバルな視点を提供するために、「クラスタグラムメニュー」からlustergram。ブロックの種類と状態の両方をグループ化することによって、この表現は、最良の条件のグループ（ 図5）を区別する細胞の表現型を強調しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明するワークフローは、迅速かつ簡単に特性評価と顕微鏡画像の比較を可能にする。まず、このワークフローを迅速顕微鏡画像上の品質管理を行うことで、例えば、実験の最適化を助けることができる方法を説明しました。次に、我々は、ハイスループットスクリーニングデータを解析するための可能性を実証：我々は、それらの作用機序に基づいてグループ薬物することができた?...

過去10年間で、画像技術の急速な進歩は、多くのラボのハイスループット顕微鏡法を実行する能力を与えている。現在の課題は、分析の1に画像の1から移行している。どのように我々は、特性評価の比較、および、典型的なハイスループット撮像画面で生成された複雑なまだ微妙な表現型の急流を探索することができます？ 画像解析と情報プラットフォームの数は、画像の大規模なコレクションからの生物学的情報を抽出するためのユーザー洗練されたツールボックスの1-3を与えている。しかし、多くの重大な障害は、高スループットの画像ベースの画面からデータを分析するにとどまる。 （興味のあるシステムへの）イメージとアルゴリズムパラメータの微調整の適切な特徴付けを選択することに関わる困難さは、多くの場合、特に画像解析の専門知識を持たないユーザーのための長いセットアップ時間をもたらす。具体的には、細胞分割、内の個々の細胞を同定する工程n個の画像は、この点での主なボトルネックである。セグメンテーションは、細胞型、細胞密度、バイオマーカーなどの実験パラメータに非常に敏感であり、頻繁には大きなデータセットに対して繰り返し調整を必要とすることができる。これらの理由から、画像解析は、多くの場合、専門家ではなく、実験的なワークフローの一部として統合することによって実施した独立端末工程である。これは解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクル、アッセイ開発の重要な部分を排除する。 ここでは、ハイスループット蛍光顕微鏡用に最適化され、前述の問題点の多くを回避している別のワークフローを記載している。この目的のために、我々はPhenoRipper 4、顕微鏡画像の迅速な調査と分析のためのオープンソース·ソフトウェア·プラットフォームを利用しています。重要なことは、PhenoRipperは、単一の細胞を同定しようとしていないことにより、細胞の分割に関わる課題の多くを避けることができます。その代わり、PhenoRipperは画素に画像を分割細胞内のサイズのブロックとそこに含まれるブロック単位で画像を特徴付ける。具体的には、PhenoRipperはマーカーの共局在ベースの機能の面でブロックをプロファイルし、自動的に訓練画像の中で最も代表的なブロックタイプの4識別します。 PhenoRipperは、各ブロック最も類似する代表的なブロックタイプに割り当て、最終的にそれらが含むブロックの種類に基づいて画像を特徴付ける。 より伝統的な単一セルベースの​​アプローチと比較すると、このアプローチは、最小限の微調整と専門知識を必要とします。ブロックサイズと閾値強度（画像の非細胞部分を破棄すること）、グラフィカルなフィードバックが設定され、どちらも：そのように、ユーザーは二つのパラメータを設定する必要があります。重要なことに、ここで説明したワークフローは、速度と最小限の微調整が大きく、時間と信頼性の向上を提供する非常に大きなデータセットに容易に拡張する4が示されている。実際には、我々はこのアプリがわかりローチは、両方の大きさは4の倍数桁のセットアップと実行に必要な時間が短縮されます。 PhenoRipperのプライマリ出力は、細胞が同様の表現型を表示させる実験条件のグループを識別することを可能にする、画像類似度を視覚的に表現したものである。一般的に見つけPhenoRipperグループ化は、より多くの時間がかかり、セル·ベースの方法4によって生成されたものに匹敵する「生物学的解釈可能」を持っている。実際には、これは、しばしば、典型的な96ウェル蛍光顕微鏡実験を行った30分以内に、前の画像解析経験のない実験者が彼または彼女の実験のパフォーマンスに関する信頼性の高い読み出しを得ることができることを意味する。実験者は次いで、異なる実験条件間の関係を探索を開始し、画像の表現型へのこれらの関係に関連することができる。 私たちは、効果を分析することによって、このワークフローを実証DNAや細胞骨格マーカーについて染色HeLa細胞上の異なるメカニズムのクラスにおける薬物の。薬の同じクラスで処理された細胞の画像がグループ化され、（というように、フォーカス細胞外染色のアーティファクト、）悪い品質の画像を識別し、潜在的に破棄するためにそれらが容易、外れ値として登場した。 このワークフローは、画像ベースの多数のアッセイのために有用であるが、別のアプローチは、潜在的に、より有益である可能性が明らかに多くの状況があります。例えば、PhenoRipperからの出力は、主に実験条件間での蛍光パターンの相対比較である。特定の単一細胞形質の絶対的特徴付けは、（セル内のスペックルの例えば数）の代わりに必要とされた場合、単一細胞ベースの分析が必要とされるであろう。それにもかかわらず、さらにこの種の状況において、PhenoRipperは、これらの単一細胞の表現型の変化を検出し、従って、アッセイの最適ための有用なツールである可能性が高いmization。

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>High Glucose, L-Glutamine</td></tr><tr><td>Marker Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Marker phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Primary Antibody &amp;alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol</td></tr><tr><td>Aldosterone</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Apicidin</td><td></td><td></td><td>concentration used: 20 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Colchicine</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.16 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Cortisol</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>concentration used: 20 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>concentration used: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Prednisolone</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Scriptaid</td><td></td><td></td><td>concentration used: 70 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Taxol</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.3 &amp;mu;M</td></tr></tbody></table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

ハイスループット顕微鏡法の急速な進歩にもかかわらず、定量的な画像ベースのアッセイは、依然として重大な課題を提起する。専門的な画像解析のさまざまなツールが利用可能であるが、最も伝統的な画像解析ベースのワークフローは、（解析パラメータの微調整のために）急な学習曲線を持っているとイメージングと解析間の長いターンアラウンド時間をもたらす。具体的には、細胞分割は、画像内の個々のセルを識別するプロセスは、この点での主なボトルネックである。 ここでは、代替、PhenoRipper、顕微鏡画像の迅速な分析と探査のために設計されたオープンソースのソフトウェアプラットフォームに基づいて、セルセグメンテーションないワークフローを紹介。ここで紹介するパイプラインは、細胞培養の免疫蛍光顕微鏡画像用に最適化されており、最小限のユーザの介入を必要としている。 30分以内に、PhenoRipperは、典型的な96ウェル実験からのデータを解析し、画像のプロファイルを生成することができる。ユーザーことができます目視、そのデータを調査、その実験に品質管理を行う、摂動に対する応答性を確保し、反復実験の再現性を確認してください。これは、アッセイの最適化の際に非常に重要である、解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクルを容易にします。このプロトコルだけでなく、品質管理のための最初のパス解析として有用であるだけでなく、エンドツーエンドのソリューションとして使用することができる、特にスクリーニングのため。ここで説明したワークフローは、例えば、ハイスループットスクリーニングによって生成されるような大規模なデータセットに拡張し、正確に生物系の広範囲の表現型によって基実験条件に示されている。 PhenoBrowserインタフェースは、表現型の空間を探索し、生物学的な注釈に画像のプロパティを関連付けるための直感的なフレームワークを提供します。一緒になって、ここに記載されているプロトコルは、イメージベースのスクリーニングの定量分析を採用への障壁を低くします。

ここでは、それらの作用機序に基づいてグループの薬剤に対してこのワークフローの能力を試験した。 HeLa細胞を384ウェルプレートの30ウェルに播種し、DNA /アクチン/α-チューブリンについて染色した。使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体、および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。ウェルを三機構的クラス（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、微小管を標的化およびDNA損傷）24?...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ここでは、急速にPhenoRipper、最近開発された画像解析プラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の集合を分析し、探索するためのワークフローを記載している。

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. ここでは、急速にPhenoRipper、最近開発された画像解析プラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の集合を分析し、探索するためのワークフローを記載している。 

ビデオ: Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

免疫・感染学

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence signals were proven cumbersome until the advent of hyperspectral imaging, in which fluorescence sources can be separated from each other as well as from background signals and autofluorescence (given knowledge of their spectral signatures). However, traditional, emission-scanning hyperspectral imaging suffers from slow acquisition times and low signal-to-noise ratios due to the necessary filtering of both excitation and emission light. It has been previously shown that excitation-scanning hyperspectral imaging reduces the necessary acquisition time while simultaneously increasing the signal-to-noise ratio of acquired data. Using commercially available equipment, this protocol describes how to assemble, calibrate, and use an excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy system for separation of signals from several fluorescence sources in a single sample. While highly applicable to microscopic imaging of cells and tissues, this technique may also be useful for any type of experiment utilizing fluorescence in which it is possible to vary excitation wavelengths, including but not limited to: chemical imaging, environmental applications, eye care, food science, forensic science, medical science, and mineralogy.

Spectral imaging has become a reliable solution for identification and separation of multiple fluorescence signals in a single sample and can readily distinguish signals of interest from background or autofluorescence. Excitation-scanning hyperspectral imaging improves on this technique by decreasing the necessary image acquisition time while simultaneously increasing the signal-to-noise ratio.

蛍光信号を効率的に判別する励起走査察ハイパースペクトルイメージング顕微鏡

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

工学

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

生物工学

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

生物学

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...