Ringraziamo Adam Coster e tutti gli altri membri dei laboratori Altschuler e Wu per il feedback utili e discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Health concede R01 GM085442 e CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), e la Welch Fondazione I-1619 (SJA) e I-1644 (LFW).

1. Campioni Preparazione e Imaging <ol><li> Coltura cellulare <ol><li> Split culture di routine e mantenere al 20-70% di confluenza. Un giorno prima dell&#39;esperimento, crescere cellule HeLa in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, vedi Tabella dei Materiali) e completata con il 10% FBS (siero fetale bovino) e 1x penicillina / streptomicina. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, le celle divise in crescita in coltura (circa il 50% confluenti). </li><li> Lavare le cellule con PBS (Phosphate Buffered Saline), esporre a circa 2 ml di tripsina / EDTA (Etilendiammintetraacetato) per alcuni secondi. Aspirare eccesso tripsina / EDTA e mantenere le cellule immerse in una sottile pellicola di tripsina / EDTA nella cappa a temperatura ambiente per ~ 3 min. </li><li> Meccanicamente scuotere fiaschi due volte e staccare le cellule con siero integrato dei media. Contare le celle e diluire a 5.000 cells/50 microlitri di media e piastra subito 50 microlitri / pozzetto su una piastra inferiore di vetro 384 pozzetti utilizzando una manipolazione liquido robot automatico (solo il 30 benes della piastra sono usati qui). </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti per minimizzare gli effetti di bordo in pozzetti 5. Dopo RT incubazione, posto piastre a 37 ° C 5% CO 2 incubatore / notte. </li><li> Ogni farmaco viene saggiata in duplicato. Aggiungere 25 ml di farmaco ai corrispondenti pozzetti sulla piastra già contenente supporti. </li><li> Fissare la piastra con una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS a 24 ore dopo trattamento farmacologico. </li></ol></li><li> Colorazione Gli anticorpi specifici primari, anticorpi secondari fluorescente-etichettati e altre macchie fluorescenti che sono stati utilizzati qui sono elencati nella Tabella dei Materiali. <ol><li> Permeabilize cellule fissate con 0,2% Triton X-100 soluzione in TBS (soluzione salina tamponata con Tris) per 3 minuti, e lavare con TBST (soluzione salina tamponata con Tris + Tween 20) 3x. Aggiungere la soluzione 5% BSA (Bovine Serum Albumin) in TBST per il blocco. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore e poi lavare con TBST 3x. </li><li> Fai dilut anticorpo primarioioni a 5% BSA in TBST (vedi Tabella dei Materiali) e aggiungere 10 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore, e poi lavare 3x con TBST. </li><li> Fai dilutionin anticorpo secondario 5% BSA in TBST (vedi Tabella dei Materiali) e aggiungere 10 microlitri / pozzetto. </li><li> Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 2 ore e poi lavare due volte con TBST. </li><li> Preparare diluizioni per la Hoechst e falloidina (vedi Tabella dei Materiali) in PBS e aggiungere 10 microlitri / pozzetto. </li><li> Incubare la piastra al buio per 30 minuti a RT. </li><li> Dopo 2 lavaggi TBST, piastre di copertura in fogli e conservare a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imaging Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza con obiettivo 20X con la macchina fotografica 1x1 binning. Acquisire sedici immagini per ogni pozzetto, per un totale di 480 immagini (canali x3). </li></ol> 2. Analizzando Immagini Scaricare e installare PhenoRipper da phenoripper.org, e lanciare PhenoRipper per iniziare l&#39;analisi di imaGES. PhenoRipper attualmente supporta TIFF, PNG e JPEG e tutti gli altri formati supportati da MATLAB (software microscopio in genere supportano l&#39;esportazione in TIFF). 2.1 Caricamento dei dati <ol><li> Non esiste alcuna convenzione di denominazione / organizzazione standard per immagini di microscopia, che possono rendere il caricamento delle immagini e metadati associazione (vale a dire annotazione sperimentale come il tipo di trattamento, anche il numero e così via) la parte più impegnativa del flusso di lavoro. Scegliere uno dei metodi presentati (descritto di seguito). <ol><li> PhenoLoader: Scegliere questa opzione per semi-automatico caricare i dati quando il nome del file e / o la struttura di directory contengono informazioni sufficienti per immagini di gruppo, se lo desideri (es. B16 HeLa_Drug5-DAPI.png potrebbe indicare che l&#39;immagine è di ben B16, le cellule vengono trattate con il farmaco il cui ID è 5, e l&#39;immagine cattura la macchia DAPI nucleare - con questa convenzione di denominazione, tutte le immagini di ben A1 o trattati con Droga 5 potrebbe essere facilmente raggruppati). La procedura guidataguidare l&#39;utente passo passo per associare metadati con gruppi di immagini e definire i marcatori come segue: <ol><li> Clicca su &quot;Struttura del file&quot; per accedere alla finestra PhenoLoader. </li><li> Clicca su &quot;Definisci Directory Root&quot; per selezionare la directory che contiene il set di dati immagine. Poi filtrare i file che non vengono utilizzati (inutilizzato File) per l&#39;analisi (opzionale, può essere lasciato vuoto). </li><li> Clicca su &quot;Definire indicatori&quot; per specificare i biomarcatori utilizzati nell&#39;esperimento e associarli con le immagini. In particolare, fare clic su un file di immagine, quindi selezionare una parte del nome del file che identifica in modo univoco i biomarcatori. Infine, immettere un nome per ogni biomarker. </li><li> Clicca su &quot;Definisci metadati&quot; per associare le informazioni di ciascuna immagine. In particolare, fare clic su un file di immagine, e quindi selezionare una parte del nome del file informazioni identificative immagine (ad esempio &quot;B16&quot; per il nome bene). Una finestra chiedendo il nome del gruppo (ad esempio, &quot;Noill &quot;) si aprirà, inserire un nome. membri del gruppo estratto dal nome del file sarà mostrato sul tavolo di gruppo (ad esempio l&#39;elenco completo dei nomi e). Per aggiungere ulteriori informazioni non presenti nel nome del file, fare clic su&quot; (opzionale) Avanti &quot;. Clicca su&quot; Aggiungi Metadata Group &quot;, inserire il nome del gruppo aggiuntivo (ad esempio&quot; Drug &quot;) e per ogni valore del gruppo predefinito (ad esempio,&quot; Well &quot;), immettere il relativo valore (ad esempio&quot; Taxol &quot;) . Non c&#39;è limite al numero di gruppi aggiuntivi che possono essere aggiunti. </li><li> Infine, fare clic su &quot;Crea MetaDataFile&quot; per generare il file di metadati e continuare l&#39;analisi. Se un file di metadati è stato generato in precedenza, i passaggi di cui sopra possono essere evitati caricando direttamente il file utilizzando l&#39;opzione &quot;File Metadata&quot; (descritto al punto 3). </li></ol></li><li> Modelli Regular Expression base: espressioni regolari sono un approccio standard per la corrispondenza modellinel testo. Scegliere questa opzione se il nome del file e / o la struttura di directory contengono informazioni sufficienti per immagini di gruppo e la convenzione di denominazione corrisponde uno dei modelli pre-esistenti. I modelli personalizzati basati su espressioni regolari possono anche essere definiti e riutilizzati manualmente. Questa opzione avanzata è consigliata solo per gli utenti che hanno familiarità con le espressioni regolari. </li><li> Metadati File: Scegliere questa opzione per personalizzazione finale. Definire e caricare un file di valori separati da virgola (CSV) contenente i nomi dei file e dei metadati associati ad ogni immagine. Un esempio del formato è disponibile da parte di download del sito web (phenoripper.org). Basta caricare il file tramite l&#39;interfaccia per visualizzare le informazioni in esso contenute. </li></ol></li><li> Selezionare il campo metadati che definiscono repliche nell&#39;esperimento per evitare campionamento ridondante. Per i set di dati che contengono repliche (ad esempio, tutte le immagini in un pozzo dovrebbero essere simili), raggruppandole (ad esempio bene) può improve le prestazioni. Nella maggior parte dei casi è ragionevole scegliere l&#39;opzione di default &quot;Random (non so)&quot; che seleziona un sottoinsieme casuale. </li></ol> 2.2 Impostazione Parametri di analisi Clicca su &quot;Impostazione dei parametri&quot; per definire i parametri necessari per elaborare il dataset. I parametri da definire sono sul pannello di sinistra. Il pannello di destra mostra un esempio dalla fusione del dataset. Clicca sulle frecce sinistra / destra per passare tra le diverse immagini. <ol><li> Soglia Intensità: Scegliere un valore di soglia appropriato per identificare grossolanamente le porzioni cellulari (anziché i precedenti, regioni non cellulari) di immagini. Una soglia viene precalcolata da PhenoRipper, ma può essere modificata per migliorare evidenziazione di regioni cellulari utilizzando la barra di scorrimento disponibili sopra l&#39;immagine. Se una soglia scelta non funziona tra tutte le immagini, abbassare la soglia in modo da includere regioni non cellulari anziché cadere regioni cellulari. </li><li> Block Size: Scegli una dimensione del blocco appropriata (in pixel) alla rete l&#39;immagine. Blocchi di dimensioni specificate verranno sovrapposte sull&#39;immagine. Regolare la dimensione del blocco per ottenere una media di 20-30 blocchi / cell. Per sovrapporre la griglia sopra l&#39;immagine clicca sulla casella di controllo davanti al campo &quot;Block Size&quot;. </li><li> Parametri facoltativi: Se le immagini di auto in scala non visualizzano marcatori con intensità relative desiderato (ad esempio un colore è saturo) o se i marcatori devono essere caduto dall&#39;analisi, usa l&#39;opzione &quot;Regola Intensità Channel&quot;. Per identificare regioni cellulari su un sottoinsieme di marcatori utilizzare i &quot;Canali utilizzati soglia di&quot; opzione. Le scelte di default di altri parametri sono di solito sufficienti, ma se necessario, regolare utilizzando le &quot;Opzioni di analisi avanzate&quot;. </li><li> Eseguire l&#39;analisi premendo il tasto &quot;PhenoRip&quot; sul pannello principale dell&#39;applicazione. PhenoRipper identifica automaticamente i tipi di blocco ricorrenti nelle immagini. Verranno generati i profili fenotipici perciascuna immagine a seconda delle frazioni dei diversi tipi di blocco in esso. </li></ol> 3. Risultati Esplorare <ol><li> Esplorare le relazioni tra i profili fenotipici delle immagini utilizzando la PhenoBrowser (Figura 1). L&#39;interfaccia PhenoBrowser si compone di quattro pannelli: il pannello in alto a sinistra è una rappresentazione grafica (scatter plot) della relativa somiglianza tra immagini diverse / condizioni, i due pannelli a destra immagini campione visualizzazione di condizioni selezionate, e il pannello finale (grafico a barre ) mette a confronto i loro profili fenotipici. </li><li> &quot;Scartare Frames vuote&quot; utilizzando il menu &quot;Data Processing&quot;. </li><li> Rimuovere immagini di scarsa qualità: in primo luogo, per studiare le singole immagini spegnere raggruppamento dal menu &quot;elaborazione dati&quot;. Successivamente, fare clic attraverso i punti outlier nel grafico a dispersione ed eliminare immagini di bassa qualità (ad esempio, fuori fuoco, artefatto colorazione). </li><li> Esplorare i dati: Decidere quale metadati definisce campouna unità di base di confronto (ad esempio per confrontare farmaci, immagine con lo stesso valore del campo metadati &quot;farmaco&quot; devono essere raggruppati). Chiudi tutte le immagini con lo stesso valore di questo campo metadati in un singolo punto di dati con &quot;Raggruppamento&quot;. Ad esempio, il raggruppamento da farmaco media le immagini all&#39;interno di ciascun farmaco a cedere un punto per droga. Punti del diagramma a dispersione nelle vicinanze (o lontani) riflettono le condizioni che provocano fenotipi cellulari simili (o dissimili). Colori o etichette punti (menu di visualizzazione dei dati) basato su metadati disponibili per aiutare interpretabilità. La trama 3D è ruotabile facendo clic sulla casella di controllo &quot;ruotabile&quot; e cliccando sul tasto sinistro e trascinando il mouse su di esso. </li><li> Selezionare due punti diversi per confrontarli direttamente. I pannelli di immagini verranno visualizzate immagini di esempio per ogni punto, e il pannello grafico a barre mostreranno i tipi di blocco le cui frequenze evento sono più differente tra i due punti. </li><li> Avviare il clustergram dal menu &quot;Clustergram&quot; per fornire una visione più globale del rapporto tra i tipi di blocco e le condizioni sperimentali. Raggruppando entrambi i tipi e le condizioni di blocco, questa rappresentazione evidenzia i fenotipi cellulari che meglio distinguono gruppi di condizioni (Figura 5). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il flusso di lavoro qui descritto consente la caratterizzazione e comparazione di immagini di microscopia facile e veloce. In primo luogo abbiamo dimostrato come questo flusso di lavoro può aiutare l&#39;ottimizzazione esperimento, per esempio eseguire rapidamente il controllo di qualità sulle immagini di microscopia. Successivamente, abbiamo dimostrato il suo potenziale per l&#39;analisi high-throughput dati di screening: siamo stati in grado di droghe raggruppare in base al loro meccanismo d&#39;azione. Il raggruppa...

Negli ultimi dieci anni, i rapidi progressi nella tecnologia di imaging hanno dato molti laboratori la capacità di effettuare la microscopia high-throughput. La sfida è ora spostato da una delle immagini di una delle analisi. Come possiamo caratterizzare, confrontare ed esplorare il torrente di complessi fenotipi ancora sottili generati da uno schermo di immagini high-throughput tipico? Un certo numero di piattaforme di image-analisi e informatici hanno dato degli utenti toolbox sofisticati 1-3 per l&#39;estrazione di informazioni biologiche da grandi raccolte di immagini. Eppure molti ostacoli significativi rimangono in analisi dei dati da schermi basati su immagine high-throughput. Difficoltà coinvolti con la scelta di opportune caratterizzazioni delle immagini e messa a punto dei parametri algoritmici (il sistema di interessi) spesso sfociano in lunghi tempi di installazione, in particolare per l&#39;utente meno esperto l&#39;analisi delle immagini. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in unimmagine n, è un serio ostacolo al riguardo. La segmentazione può essere molto sensibili a parametri sperimentali, quali tipo di cellula, densità cellulare e bio-marcatori, e richiede frequentemente regolazione ripetuta per un grande insieme di dati. Per queste ragioni, analisi di immagine è spesso un passo terminale indipendente eseguita da specialisti piuttosto che una parte integrata del flusso di lavoro sperimentale. Questo preclude il ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, una parte cruciale di sviluppo di analisi. Qui si descrive un flusso di lavoro alternativo che è ottimizzato per high-throughput microscopia a fluorescenza ed evita molte delle difficoltà di cui sopra. A tal fine, ci avvaliamo di PhenoRipper 4, una piattaforma software open-source per una rapida esplorazione e l&#39;analisi di immagini di microscopia. Significativamente, PhenoRipper evita molti dei problemi connessi con la segmentazione delle cellule, non tentare di identificare le singole cellule. Invece, PhenoRipper divide le immagini in pixelblocchi di dimensione subcellulare e caratterizza immagini in termini di blocchi che contengono. In particolare, PhenoRipper profili blocchi in termini di-base di colocalizzazione-marcatori caratteristiche e automaticamente identifica 4 tipi più rappresentativi di blocco nelle immagini di formazione. PhenoRipper poi assegna a ciascun blocco il tipo di blocco rappresentante più simile, e caratterizza finalmente immagini basate sui tipi di blocchi che contengono. Rispetto agli approcci basati su celle singole-più tradizionali, questo approccio richiede la messa a punto minimo e competenza. Come tale, gli utenti devono solo impostare due parametri: la dimensione del blocco e una intensità soglia (per eliminare le parti non cellulari di un&#39;immagine), entrambi i quali sono fissato con feedback grafico. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qui descritto è stato dimostrato da 4 a scalare facilmente ai set di dati molto più grandi, dove la velocità e la messa a punto minima fornisce grande tempo e guadagni di affidabilità. In pratica, troviamo che questa appscarafaggio riduce il tempo necessario sia per la configurazione e l&#39;esecuzione da parte di più ordini di grandezza 4. L&#39;output primario di PhenoRipper è una rappresentazione visiva di immagine somiglianza, che consente all&#39;utente di identificare gruppi di condizioni sperimentali che inducono le cellule da visualizzare fenotipi simili. I raggruppamenti PhenoRipper reperti hanno in genere comparabile &quot;interpretabilità biologico&quot; per quelli generati da più in termini di tempo, a base di cellule metodi 4. In pratica, ciò significa che spesso, nel giro di mezz&#39;ora di eseguire un tipico esperimento di microscopia a fluorescenza a 96 pozzetti, uno sperimentatore, senza esperienza immagine-analisi preventiva può ottenere una lettura affidabile sulle prestazioni del suo esperimento. Lo sperimentatore può quindi iniziare ad esplorare le relazioni tra diverse condizioni sperimentali e relative tali relazioni per fenotipi di immagine. Dimostriamo questo flusso di lavoro qui analizzando gli effettidi farmaci in diverse classi meccanicistiche sulle cellule HeLa colorati per DNA e del citoscheletro marcatori. Immagini di cellule trattate con la stessa classe di farmaci sono stati raggruppati insieme, e le immagini di scarsa qualità (artefatti di colorazione, su cellule di fuoco e così via) è apparso come valori anomali, che li rende facili da identificare e potenzialmente scartare. Mentre questo flusso di lavoro è utile per un gran numero di saggi basati su immagini, ci sono chiaramente molte situazioni in cui un approccio diverso potrebbe potenzialmente essere più informativo. Per esempio, l&#39;uscita dal PhenoRipper è principalmente un rapporto relativo di pattern di fluorescenza di tutti condizioni sperimentali. Se una caratterizzazione assoluta di uno specifico tratto della cellula singolo è stato invece richiesto (ad esempio il numero di macchiettature in una cella), una singola base di cellule analisi sarebbe necessario. Tuttavia, anche in questo tipo di situazione, PhenoRipper rischia di rilevare variazioni di questi fenotipi monocellulari e quindi essere un utile strumento per dosaggio ottimalezazione.

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>High Glucose, L-Glutamine</td></tr><tr><td>Marker Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Marker phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Primary Antibody &amp;alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol</td></tr><tr><td>Aldosterone</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Apicidin</td><td></td><td></td><td>concentration used: 20 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Colchicine</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.16 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Cortisol</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>concentration used: 20 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>concentration used: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Prednisolone</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Scriptaid</td><td></td><td></td><td>concentration used: 70 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Taxol</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td></td><td></td><td>concentration used: 0.3 &amp;mu;M</td></tr></tbody></table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Nonostante i rapidi progressi nella microscopia a high-throughput, saggi basati su immagini quantitativi pongono ancora sfide significative. Mentre una varietà di strumenti di analisi di immagine specializzati sono disponibili, la maggior parte dei flussi di lavoro basati-image-analisi tradizionali hanno curve di apprendimento ripide (per la messa a punto dei parametri di analisi) e determinano tempi lunghi di consegna tra imaging e di analisi. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in un&#39;immagine, è un serio ostacolo al riguardo. Qui vi presentiamo un supplente, workflow cellulare privo di segmentazione basata su PhenoRipper, una piattaforma software open-source progettato per l&#39;analisi rapida ed esplorazione di immagini di microscopia. Il gasdotto qui presentato è ottimizzato per le immagini di microscopia di immunofluorescenza su colture cellulari e richiede un intervento minimo da parte dell&#39;utente. Dopo mezz&#39;ora, PhenoRipper può analizzare i dati da un tipico esperimento 96 pozzetti e generare profili immagine. Gli utenti possonopoi esplorare visivamente i dati, effettuare il controllo di qualità sul loro esperimento, garantire una risposta alle perturbazioni e verificare la riproducibilità dei replicati. Questo facilita un ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, che è fondamentale durante l&#39;ottimizzazione del dosaggio. Questo protocollo è utile non solo come una prima analisi pass per il controllo di qualità, ma anche può essere usato come una soluzione end-to-end, in particolare per lo screening. Il flusso di lavoro qui descritto scalabile per grandi insiemi di dati come quelli generati da schermi high-throughput, e ha dimostrato di condizioni sperimentali raggruppare fenotipo con precisione su una vasta gamma di sistemi biologici. L&#39;interfaccia PhenoBrowser fornisce un quadro intuitivo per esplorare lo spazio fenotipica e si riferiscono immagine proprietà alle annotazioni biologiche. Nel loro insieme, il protocollo qui descritto abbasserà le barriere per l&#39;adozione di analisi quantitativa di schermi immagini based.

Qui abbiamo testato la capacità di questo flusso di lavoro per i farmaci del gruppo in base al loro meccanismo d&#39;azione. Cellule HeLa sono state seminate in 30 pozzetti di una piastra da 384 pozzetti e colorate per DNA / actina / α-tubulina. Gli anticorpi specifici primari, anticorpi secondari fluorescenti marcate, e altre macchie fluorescenti che sono stati utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Wells sono stati trattati con 15 farmaci appartenenti a tre classi meccanicistici (istone deacetilasi in...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  UT Southwestern Medical Center.  Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente. 

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence signals were proven cumbersome until the advent of hyperspectral imaging, in which fluorescence sources can be separated from each other as well as from background signals and autofluorescence (given knowledge of their spectral signatures). However, traditional, emission-scanning hyperspectral imaging suffers from slow acquisition times and low signal-to-noise ratios due to the necessary filtering of both excitation and emission light. It has been previously shown that excitation-scanning hyperspectral imaging reduces the necessary acquisition time while simultaneously increasing the signal-to-noise ratio of acquired data. Using commercially available equipment, this protocol describes how to assemble, calibrate, and use an excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy system for separation of signals from several fluorescence sources in a single sample. While highly applicable to microscopic imaging of cells and tissues, this technique may also be useful for any type of experiment utilizing fluorescence in which it is possible to vary excitation wavelengths, including but not limited to: chemical imaging, environmental applications, eye care, food science, forensic science, medical science, and mineralogy.

Spectral imaging has become a reliable solution for identification and separation of multiple fluorescence signals in a single sample and can readily distinguish signals of interest from background or autofluorescence. Excitation-scanning hyperspectral imaging improves on this technique by decreasing the necessary image acquisition time while simultaneously increasing the signal-to-noise ratio.

Microscopia di imaging iperspettrale di eccitazione-scanning per discriminare in modo efficiente i segnali di fluorescenza

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Ingegneria

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Bioingegneria

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biologia

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

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