動物を提供する研究は、英国食糧環境農村省と欧州連合(EU TSE参照研究所の資金提供を通じて)によって資金提供されました。私たちは、プロジェクトマネージャー、シモンズ博士、ジェフリー博士.M.Mサポートを受け入れます。

1. 姿勢評価
<ol><li>邪魔されない間に動物の姿勢を評価する。</li>
	<li>TSEの影響を受ける動物は、広いベースの手足で立ったり、ハンチングしているように見えたり、頭のキャリッジが低い状態で立ったりすることがあります。</li>
</ol>2. 行動評価
<ol><li>動物の行動を研究する,放置したとき,近づくと,取り扱われた時。</li>
	<li>TSEの影響を受けた動物は、他の羊とは別に立っているか、他の羊の直後に立つことによって、変化したメンテーションを示す可能性があります。</li>
	<li>動物が近づくと、逃げ出して倒れたり、取り扱い時に床に倒れたりする。非定型のスクレーピーを持つ羊では、時計回りまたは反時計回りに強制的に回っているのが見られます。</li>
</ol>3. 脅威反応試験
<ol><li>脅威反応のテストのために動物の頭を保持する:点滅応答を誘発するために動物の各目に向かって手または数本の指を数回動かすが、顔の毛に触れたり、動物が点滅する原因となる空気の乱気流を作り出さないように注意してください。</li>
	<li>脅威反応は、スクレーピーの影響を受けた動物、特に非定型の擦り傷を持つ羊では存在しない可能性がある。脅威応答の検査はプロトコルの一部として使用される唯一の脳神経検査であるが、この処置の間に顔の目視検査は、例えば顔面麻痺 など 、擦り傷に通常見られない神経学的欠損の他の徴候を明らかにすることができる。動物が脅威に反応して点滅しない場合は、動物が点滅できないことが顔面麻痺によって引き起こされていないことを確認するために、まぶたに触れることによって触手反射をテストすることをお勧めします。</li>
</ol>4. スクラッチ応答のテスト
<ol><li>この手順では、苦しんでいる動物ではテストを解釈できないため、動物が落ち着いているかどうかを確認してください。</li>
	<li>胸部、腰椎、仙骨領域の背中のスクラッチ領域は、各スクラッチエピソードの間に一時停止します。</li>
	<li>動物がリズミカルな頭や体の動きに反応する場合、または特定の領域の傷を付けて唇を動かしたり舐めたりする場合は、スクラッチテストを繰り返してスクラッチ応答の再現性を確認します。</li>
	<li>反復可能な応答は、通常、古典的なスクレーピーを持つ羊または掻痒の形態のヤギを含む掻痒性の動物で引き出されるが、他の掻痒性皮膚状態または外在植物が存在しない限り、一般的に非定型スクレーピーを持つ羊では反応がない。</li>
</ol>5. ウールの損失と皮膚病変のチェック
<ol><li>皮膚を点検します。</li>
	<li>擦傷による掻痒は通常、下層の皮膚が正常に見える過度の擦り傷や引っ掻き傷のために、世論調査、背中、ランプ、胸部または腹部の側面にある可能性のある脱毛を引き起こす。</li>
	<li>動物が鋭利な物体をこする機会がある場合、擦り傷は後で現れる可能性があります。咬傷は、特に手足の過度のニブリングのために、手足に現れる可能性があります。</li>
</ol>6. スコアリングボディコンディション
<ol><li>腰椎の背中と横のプロセスを触診することによって、動物の体の状態を評価します。</li>
	<li>擦り傷は、腰椎の横方向のプロセスが個別に容易に感じることができ、プロセスの終わりが鋭く見える体の状態の進行性喪失を引き起こす可能性があります。</li>
</ol>7. 動物の目隠し
<ol><li>動物の目をフードで覆い、動物の呼吸を可能にするために1つのコーナーが切り取られた非見の袋を使用して作ることができます。</li>
	<li>安全上の懸念がなく、パニック動物による怪我の危険性がない場合にのみ、動物を解放します。それ以外の場合は、羊を保持し、動物の制御中に動物の動きを研究します。</li>
	<li>目隠しは、前庭系または小脳機能障害の徴候を悪化させる可能性があり、これは動物がその視力を補う能力によって隠される可能性がある。バランスの喪失、不整合、または旋回は、特に非定型スクレーピーを有する臨床的に顕著でない羊において引き起こされ得る。</li>
</ol>8. 動物の動きの評価
<ol><li>動物が自由に動くときの歩行と筋肉の動きを研究する。</li>
	<li>不整合は、後肢の広いベースの動き、両方の後肢でホッピング、または後ろの四肢で過度に揺れ、つまずいたり一時的に座ったりする可能性があります。</li>
	<li>頭部振戦の存在は、動物が邪魔されないが、臨床検査の完了中または後により顕著になる可能性がある場合、しばしば微妙である。</li>
</ol>9. 解釈
<ol><li>スクレーピーに関する調査結果の重要性を考えてみましょう。</li>
	<li>個々の徴候の存在は、傷、振戦、異常行動、回り回り、崩壊するエピソード、運動失調、または不在の脅威反応に対する反復可能な応答など、様々な原因を有する可能性があるが、これらの徴候の2つ以上の組み合わせの発生は、羊またはヤギの擦傷を非常に示唆している。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Benestad, S. L., Arsac, J. N., Goldmann, W., N&#246;remark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical/Nor98+scrapie:+properties+of+the+agent,+genetics,+and+epidemiology.">Atypical/Nor98 scrapie: properties of the agent, genetics, and epidemiology.</a> Vet Res.. 39 (4), 19 (2008).</li><li>D&#39;Angelo, A., Maurella, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+clinical+criteria+to+diagnose+scrapie+in+Italy.">Assessment of clinical criteria to diagnose scrapie in Italy.</a> Vet. J. 174 (1), 106-112 (2007).</li><li>Eloit, M., Adjou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSE+agent+signatures+in+a+goat.">BSE agent signatures in a goat.</a> Vet. 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動物に関するすべての手続きは、英国政府内務省のライセンスの下で、1986年の動物(科学的手続き)法に従って行われました。 著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

スクレイは、世界保健機関(OIE)によってリストされた病気であり、迅速かつ信頼性の高い アンティ死後 検査がない場合、この疾患に関連する臨床徴候を認識する農家または獣医師の能力に依存しています。しかし、ほとんどのスクラッパー症例、特に非定型スククレーピー症例は、現在、標的となるTSE監視、 すなわち 殺処分または落下したストック動物の対象となる小さな反すう人の脳検査によって発見されている。古典的なスクラッパーの数を減らした古典的なスクレーピーに対する耐性のために羊を繁殖させることは、羊の神経疾患の鑑別診断であまり考慮されにくくなるように、病気に対する人々の意識を低下させた可能性が最も高い。非定型スクラッパーはまた、アバトワールで約5例、ヨーロッパ4でテストされた10,000人当たりの下落株で8例と低い有病率を有する。また、掻痒は、通常、排泄の有無にかかわらず脱毛症として明らかであり、しばしば擦物13の特徴的な徴候と考えられる。したがって、非定型スククレーピー12 または非不作尿形態のカプリンスクレーピー11 で観察される付随性掻痒のない神経疾患は、スクレーピーの疑いを引き起こさない可能性がある。
この検査プロトコルは、様々なタイプのスククレー(非定型で古典的なスクラッパー、後者は非定型BSE接種羊に代表される非定型のスクラッパー)に関連する特定の臨床徴候を評価することによって、羊のTSEの臨床徴候を同定するように設計された。古典的なスクラッパーでは、肯定的な傷反応(「ニブル反射」)を示した症例の割合は、100頭以上の羊の50-77の範囲であった5,8を研究した。運動障害は、様々な研究に基づいて古典的なスククレーピー症例の最大81%で観察することができる18.また、非整型スクリューの様々な自然発生症例の主要な兆候であり、しばしば行動変化を伴う1が、自然および実験的に感染した非定型スククレーピー羊の両方で報告された追加の徴候は、目隠しおよびメナス応答の検査が試験プロトコルに含まれる理由である12,15,16を回っていた。体の状態をスコア付けすると、例えば6点スコアリングシステム14を用いて、斑点に影響を受けた羊5で観察され得る気化の評価が可能になる。羊のスクレーピーの検出を支援するための臨床基準は以前2に提案されているが、これらは古典的なスクラッパーの検出にのみ関連し、動物がアバトワールで提示された場合には利用できない可能性のある臨床歴を考慮に入れた。
現在のプロトコルは、短期間でスクレーピーの兆候のために多くの動物のスクリーニングを可能にする。さらに、検査プロトコルは、臨床発症、進行、および終点を監視するために、羊およびヤギのスクイチーの実験的研究に適用することができる。しかし、より詳細な身体的および神経学的検査を臨床症例歴の適切な記録に置き換えるものではなく、おそらく補助的な診断検査(血液および脳脊髄液の検査;適切であればより洗練されたイメージング技術)が続き、その後、同様の徴候を有する小さな反すrumants剤の様々な他の状態を排除する必要があるかもしれない代謝や炎症性の神経疾患、脳膿瘍、腫瘍など。
臨床検査は、プリオンタンパク質2,11の検出に基づく死後の検査よりも一般的にTSEの影響を受けた動物の検出にあまり敏感ではありませんが、特にインキュベーション期間の初期段階では、これは現在、生きている動物の唯一の検出方法であり、TSEの影響を受けた小さな反する動物を識別するための標的監視システムを持たない国に最も関連しています。

スクレーピーは、牛の牛海綿状脳症(BSE)、鹿の慢性消耗性疾患、ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病などのタンパク質誤折障害のグループに属する羊とヤギの伝染性スポンジ状脳症(TSE)です。診断は、通常脳内でプロテイナーゼ耐性であるプリオンタンパク質の異常な形態を検出することによって死後に行われる。2つの主要な天然のスクレーピー形態は、疫学的、病理学的、および生化学的に異なる区別することができる:古典的なスククレーピーおよび非定型スククレーピー。また、古典的な擦り傷のような臨床徴候を有する神経疾患は、BSE剤6,10-11との実験的感染によって羊およびヤギに誘発され得る。実際、天然に発生するBSEはヤギ3,17で診断されている。プリオンタンパク質遺伝子を標的とした遺伝的抵抗性の繁殖によって古典的なスクラッパー(および天然に生じた場合は羊のBSE)の制御が達成されたが、これは散発性疾患であると考えられており、古典的なスクラッパーから解放されていると考えられている国で診断されている非定型スクラッパーにとってより困難である7。 
スクイリーは、成人の羊やヤギの神経疾患であり、行動、感覚、運動の変化をもたらすが、この疾患は徐々に進行性であり、動物飼育員や獣医が臨床徴候に精通していないか、または小さな反すう動物の神経疾患の鑑別診断ではスクレーピーが全く考慮されていないため、臨床徴候はしばしば認識されない。
提案された検査プロトコルは、2つの目的を念頭に置いてスクレーピーの臨床診断を支援するように設計されました:それは短期間で多くの動物のスキャンを可能にするためにかなり簡単であるべきですが、スクレーピーの影響を受けた動物の検出を可能にするのに十分な具体的なものである必要があります。このプロトコルは、古典的なスクラッパー11 の徴候についてヤギを監視するために使用されるものからのわずかな変更であり、通常はスククレーピー9に関連しない臨床徴候を悪化させる可能性のある動物の目隠しを含む。

clinical examination protocol to detect atypical and classical scrapie in sheep

羊とヤギの伝染性スポンジ状脳症(TSE)であるスクレーピーの診断は、現在、 死後 の検査による疾患関連プリオンタンパク質の検出に基づいています。羊やヤギの集団のランダムなサンプルがスクレーピーについて積極的に監視されていない限り、スククレー症例の同定は、病気に関する個人の精通と擦り傷に関連する臨床徴候を認識する能力に依存する臨床容疑者の報告に依存する。スクレーピーは、小さな反する人の神経疾患の鑑別診断では考慮されない場合があります, 特にスクレーピーの有病率が低い国で, またはそれは非定型のスクレーピーのような非不作尿形態として提示する場合は認識されません.臨床容疑者の同定を支援するために、短い検査プロトコルが提示され、ヤギにも適用できる羊の掻痒および非不全形態のTSEに関連する特定の臨床徴候の表示を評価する。これには、行動の評価、視力(脅威反応のテストによる)、掻痒(スクラッチへの応答をテストすることによる)、および動き(目隠しの有無にかかわらず)が含まれます。これは、スクレーピー容疑者として動物を報告するより詳細な神経学的検査につながる可能性があります。また、病気の進行を評価したり、臨床の終点を特定するために、羊やヤギの実験的なTSE研究で使用することができます。

臨床的に健康な羊。ニュージーランド起源の牛の脳を脳内に接種し、接種後49ヶ月で調べたスクレーピーフリーの群れからのポーリングドーセットウェザー。この羊は正常な姿勢を持ち、正常に動作し、正常な脅威反応(図1)を表示し、スクラッチテストに反応せず、無傷のフリースを有し、非常に良好な体の状態を有する。目隠しをすると臨床的に顕著で、運動障害の徴候を示さない。
羊の中のTSEの非不作尿形態を呈する非定型のスクレイピー羊。同じプリオンタンパク質遺伝子型(AHQ/AHQ)の非定型スククレーピーフィールドケースから脳ホモゲネートで脳ホモゲネートを接種し、接種後36ヶ月で調べたスクレーピーフリーの群れからシェビオット・ウェザー。この羊はまた、通常の姿勢を持っていますが、ペンの他の羊とは異なる振る舞い、時計回りに円を描きます。脅威反応がテストされたときに点滅しません。傷は何の反応も引き出さないし、フリースの変化は明らかではないが、体の状態は公正に過ぎない。目隠しをすると時計回りに回り、バランスが崩れる。歩行は無数で、細かい頭部の揺れが見える。
古典的な擦り傷に影響を受けた羊の臨床プレゼンテーションに臨床的に似ている羊のTSEの慎重な形態を提示する非定型BSE羊。このため、古典的なスクレーピーケースは含まれていません。ペールドーセットは、ウシ非定型(L型)BSE脳ホモゲネートで脳内に接種された脳内で排他性の群れからドーセットウェザーをポーリングし、接種後50ヶ月で調べた。この羊は少し腰を下ろし、後肢を広く保ち、捕まえると床に落ちる傾向があります。脅威反応は弱い。背中の様々な領域の傷は頭や唇の動きを引き出し(図3)、世論調査では軽度の皮膚外傷を伴う羊毛の損失がある。体の状態が良いです。目隠しをすると、動きに消極的で、バランスを保つために後端をハードルの上に置きます。羊は無菌であり、前肢のハイパーメトリアを表示します。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1.jpg"> 図 1.脅威応答テスト。 動物の目に向かって威圧的なジェスチャーは、瞬き応答を誘発する。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2.jpg"> 図 2.目隠し。 フードで羊を目隠しすることによって引き出される時計回りの周りを回る。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3.jpg"> 図 3.スクラッチ応答のテスト。 背中の引っ掻きは、頭の横方向の動きで唇を舐める引き出す <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示します。</a>

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Clinical Examination Protocol to Detect Atypical and Classical Scrapie in Sheep

短い臨床検査プロトコルは羊およびヤギの古典的および非定型的なスククレーピーの検出を助けるために提示される。

羊の非定型および古典スククレープを検出する臨床検査プロトコル

The diagnosis of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy (TSEs) of sheep and goats, is currently based on the detection of disease-associated ...

clinical-examination-protocol-to-detect-atypical-classical-scrapie

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K ビュー.  Animal Health and Veterinary Laboratories Agency Weybridge. 短い臨床検査プロトコルは羊およびヤギの古典的および非定型的なスククレーピーの検出を助けるために提示される。

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

免疫・感染学

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する<em&gt;インビトロ</em&gt;プリオンタンパク質変換アッセイ

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

医学

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, there is a need to validate additional diagnostic techniques to improve rabies surveillance, particularly in developing countries. Here, we present a standard protocol for the DRIT as an alternative, laboratory or field-based testing option that uses light microscopy as compared to the DFA. Touch impressions of brain tissue collected from suspect animals are fixed in 10% buffered formalin. The DRIT uses rabies virus-specific monoclonal or polyclonal antibodies (conjugated to biotin), a streptavidin-peroxidase enzyme, and a chromogen reporter (such as acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) to detect viral inclusions within infected tissue. In approximately 1 h, a brain tissue sample can be tested and interpreted by the DRIT. Evaluation of suspect animal brains tested from a variety of species in North America, Asia, Africa, and Europe have illustrated high sensitivity and specificity by the DRIT approaching 100% with results compared to DFA. Since 2005, the United States Department of Agriculture&#8217;s Wildlife Services (USDA WS) program has conducted large-scale enhanced rabies surveillance efforts using the DRIT to test &#62;94,000 samples collected from wildlife in strategic rabies management areas. The DRIT provides a powerful, economical tool for rabies diagnosis that can be used by laboratorians and field biologists to improve current rabies surveillance, prevention and control programs globally.

The direct rapid immunohistochemical test (DRIT) offers a World Organization for Animal Health and World Health Organization (OIE/WHO) recognized alternative to the direct fluorescent antibody (DFA) test for rabies diagnosis. This test allows for field-based applications that can be performed in approximately 1 h upon brain impressions using light microscopy.

直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the entire state, with the exception of New York City. The Rabies laboratory necropsies a variety of animals ranging in size from bats to bovids. Most of these specimens are animals exhibiting neurological signs, however, less than 10% actually test positive for rabies; implying trauma, lesions or other infectious agents as the cause of these symptoms. Due to the risk of aerosolizing undiagnosed infectious agents, the Rabies Laboratory does not use power tools or saws. Three necropsy techniques will be presented for animals whose skulls are impenetrable with scissors. The laboratory has implemented these techniques to decrease potential exposure to infectious agents, eliminate unnecessary manipulation of the specimen and reduce processing time. The advantages of a preferred technique opposed to another is subject to the trained individual processing the specimen.

The goal of this protocol is to demonstrate safe necropsy techniques in small and large animals to obtain satisfactory tissue samples for rabies testing.

大小動物における狂犬病壊死技術

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the ...

神経科学

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

プリオン安全研究所 スワイプ試験

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

免疫組織化学による異常プリオンタンパク質の検出

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と評価

Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS). It is characterized by different prevalence in the sexes, affecting more women than men, and different outcomes, showing more aggressive forms in men than in women. Furthermore, MS is highly heterogeneous in terms of clinical aspects, radiological, and pathological features. Thus, it is necessary to take advantage of experimental animal models that allow the investigation of as many aspects of the pathology as possible. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) represents one of the most used models of MS in mice, modeling different disease features, from the activation of the immune system to CNS damage. Here we describe a protocol for the induction of EAE in both male and female C57BL/6J mice using myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) immunization, which leads to the development of a chronic form of the disease. We also report the evaluation of the daily clinical score and motor performance of these mice for 28 days post immunization (28 dpi). Lastly, we illustrate some basic histological analysis at the CNS level, focusing on the spinal cord as the primary site of disease-induced damage.

著者スポットライト:雄マウスと雌マウスの両方に関連する汎用性の高い実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルの作成 

Experimental autoimmune encephalomyelitis is one of the most widely used murine models of multiple sclerosis. In the current protocol, C57BL/6J mice of both sexes are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide, resulting mainly in ascending paresis of the tail and limbs. Here we discuss the protocol of EAE induction and evaluation.

羊の非定型および古典スククレープを検出する臨床検査プロトコル

要約

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腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化

大小動物における狂犬病壊死技術

プリオン安全研究所スワイプ試験

免疫組織化学による異常プリオンタンパク質の検出

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG_35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

羊の非定型および古典スククレープを検出する臨床検査プロトコル

要約

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腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化

大小動物における狂犬病壊死技術

プリオン安全研究所 スワイプ試験

免疫組織化学による異常プリオンタンパク質の検出

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

プリオン安全研究所スワイプ試験

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG_35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎