私たちの学際的なグループは、感染性タンパク質であるプリオンが複雑な生物学的タスクをどのように実行できるかを理解しようとしています。また、プリオンが数年から数十年にわたって環境中に残留する方法にも興味があります。プリオン除染手順の後、プリオン不活化の有効性を決定するための堅牢な方法は利用できませんでした。
私たちはこの課題を研究で解決しようとしています。スワブ法とRT-QuICを組み合わせることで、プリオン播種活性を検出するための幅広い表面のサンプリングが可能になります。これは、実験室、臨床、または環境設定で表面関連プリオンを検出するために使用できます。
私は、プリオンが表面とどのように相互作用するか、また表面結合プリオンが感染を確立するための要件を理解することに興味があります。まず、スワブに適した監視エリアを特定し、ラベルを付けます。特定された領域ごとに2本の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブを準備し、最初のチューブに250マイクロリットルのDPBSを追加し、2番目のチューブを空のままにします。
先端が発泡スワブの入った綿棒は、プリオン汚染のない場所で保管場所から取り出します。DPBS中の適切な脳ホモジネートまたはBHを使用して、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを調製します。清潔な手袋を使用して、必要な数のフォームスワブをパッケージから取り出し、ハンドル側を下にしてチューブラックに置きます。
先端が他の表面に接触しないようにします。ハンドルできれいなフォームスワブを保持し、それぞれのポジティブおよびネガティブコントロールサンプルの50マイクロリットルをスワブの先端に塗布します。はさみを使用して、綿棒の余分なハンドルをその長さの約半分に切り取り、綿棒をプリロードされたマイクロ遠心分離チューブに入れて、フォームの先端をDPBSに沈めます。
ハンドルのそばにきれいなフォームチップスワブを持ち、フォームチップを分子グレードの水で事前に濡らし、余分な水を振り落とします。湿らせたフォームチップを監視用に選択した領域に置き、表面上で綿棒の先端を回転させながら、領域を前後に約10回綿棒で拭きます。はさみを使用して、綿棒の余分なハンドルをその長さの約半分に切り取り、綿棒をプリロードされたマイクロ遠心分離管に入れてフォームの先端をDPBSに沈め、蓋が完全に閉じることができるようにします。
手袋を廃棄し、新しい手袋と交換してから、次の綿棒サイトに進むと、相互汚染を最小限に抑えることができます。綿棒抽出の場合は、マイクロ遠心分離管を円形チューブラックに入れ、ラックをカップホーンソニケーターウォーターバスに沈めます。チューブ内のDPBSのフォームスワブが水面の下にあることを確認し、ハンドル部分が水没していないことを確認します。
サンプルを合計15秒間超音波処理し、5秒間オンと5秒のオフサイクルで行います。超音波処理後、チューブを約15秒間遠心分離して、移す前にチューブの底にDPBSを収集します。250マイクロリットルに設定されたP 1000ピペットを使用して、底からすべての液体綿棒抽出物を対応する事前ラベル付きの空のチューブに慎重に収集します。
綿棒が入った使用済みのチューブを廃棄します。サンプルを真空濃縮器に濃縮し、チューブキャップが開いていることを確認し、サイクルが完了したら、サンプルが完全に濃縮され、ペレットのみが残ることを確認します。ペレットは、さらに使用するまで摂氏マイナス80度で保管してください。
RT-QuIC分析では、組織希釈溶液で希釈した対応する脳ホモジネートを用いて、ネガティブプレートおよびポジティブプレートコントロールを調製します。次に、保存されていたスワブ抽出物ペレットをマイナス80°Cの冷凍庫から解凍し、乾燥したスワブ抽出物をピペッティングで50マイクロリットルの分子グレードの水で再懸濁します。短時間ボルテックスし、サンプルを室温で放置します。
2マイクロリットルのネガティブプレートコントロールとポジティブプレートコントロールをロードし、続いてスワブ抽出物をそれぞれのRT-QuICプレートウェルにロードします。ネガティブコントロールスワブは陽性蛍光閾値を超えず、処置中に汚染がないことが確認されました。ポジティブコントロールスワブ抽出物は、すべてのレプリケートウェルで一貫した播種を示し、適切な検出感度を示しました。
汚染されていない地域から採取した地表の綿棒サンプルでは、閾値を超える播種は見られず、プリオンの陰性性が確認されました。プリオンで汚染された表面は、対照と比較して、最大ポイント比と蛍光時間が異なる閾値を超える播種を示しました。漂白剤処理されたプリオンで汚染された表面はRT-QuICの播種に失敗し、効果的な消毒が実証されました。
一部の表面アーチファクトは、運動曲線の変化と長い蛍光時間を示し、表面上のほこりや残留化学物質の存在による可能性のある誤検出を示しています。
