Gli studi che forniscono gli animali sono stati finanziati dal Ministero britannico per l'alimentazione, l'ambiente e gli affari rurali e dall'Unione europea (attraverso il finanziamento del laboratorio di riferimento delle TSE dell'UE). Riconosciamo il supporto dei project manager, dr.M. Simmons e Dr.M. Jeffrey.

1. Valutazione della postura
<ol><li>Valutare la postura dell'animale mentre è indisturbato.</li>
	<li>Gli animali affetti da TSE possono stare con arti a base larga, possono apparire curvo o stare con un carrello a testa bassa.</li>
</ol>2. Valutazione del comportamento
<ol><li>Studia il comportamento dell'animale, quando viene lasciato solo, quando viene avvicinato e quando viene maneggiato.</li>
	<li>Gli animali colpiti dalle TSE possono mostrare una mutazione alterata stando separati dagli altri ovini o non immediatamente dopo altri ovini.</li>
	<li>Quando l'animale viene avvicinato, può scappare e crollare, o collassa sul pavimento quando viene maneggiato. Il cerchio compulsivo in senso orario o antiorario può essere visto nelle pecore con scrapie atipica.</li>
</ol>3. Test di risposta alle minacce
<ol><li>Tieni la testa dell'animale per testare la risposta della minaccia: sposta la mano o più dita più volte verso ogni occhio dell'animale per indurre una risposta lampeggiante, ma fai attenzione a non toccare i peli del viso o creare turbolenze d'aria che possono causare l'animale a lampeggiare.</li>
	<li>La risposta alla minaccia può essere assente negli animali colpiti dalla scrapie, in particolare negli ovini con scrapie atipica. Sebbene il test della risposta alla minaccia sia l'unico test del nervo cranico utilizzato come parte del protocollo, l'ispezione visiva del viso durante questa procedura può rivelare altri segni di deficit neurologici normalmente non visti nella scrapie, ad esempio la paralisi facciale. Se l'animale non lampeggia in risposta alla minaccia, è consigliabile testare il riflesso palpebrale toccando le palpebre per garantire che l'incapacità dell'animale di lampeggiare non sia causata dalla paralisi facciale.</li>
</ol>4. Test della risposta ai graffi
<ol><li>Assicurati che l'animale sia calmo durante questa procedura perché il test non può essere interpretato in un animale in difficoltà.</li>
	<li>Graffiare le aree della schiena nelle regioni toracica, lombare e sacrale, fermandosi tra ogni episodio graffiante.</li>
	<li>Se l'animale risponde con movimenti ritmici della testa o del corpo, o si muove o lecca le labbra graffiando una particolare area, ripetere il test scratch per confermare la riproducibilità della risposta graffiante.</li>
	<li>Una risposta ripetibile viene solitamente suscitata in animali che sono pruritosi, che di solito include pecore con scrapie classica o capre con la forma pruritica di scrapie, ma generalmente non c'è risposta negli ovini con scrapie atipica a meno che non siano presenti altre condizioni cutanee pruritiche o ectoparassiti.</li>
</ol>5. Controllo della perdita di lana e delle lesioni cutanee
<ol><li>Ispezionare la pelle.</li>
	<li>Il prurito dovuto alla scrapie di solito causa la caduta dei capelli, che può essere sul sondaggio, sulla schiena, sulla groppa, sul lato del torace o sull'addome a causa di uno sfregamento eccessivo o graffio in cui la pelle sottostante appare normale.</li>
	<li>Le abrasioni possono apparire in seguito se l'animale ha l'opportunità di strofinare oggetti appuntiti. Possono apparire ferite da morso, in particolare sugli arti, a causa di un eccessivo rosicchiamento degli arti.</li>
</ol>6. Condizione del corpo di punteggio
<ol><li>Valutare le condizioni del corpo dell'animale palpando i processi dorsali e trasversali delle vertebre lombari.</li>
	<li>La scrapie può causare una progressiva perdita delle condizioni del corpo in cui i processi trasversali delle vertebre lombari possono essere facilmente sentiti individualmente e le estremità dei processi appaiono nitide.</li>
</ol>7. Bendare l'animale
<ol><li>Coprire gli occhi dell'animale con un cappuccio, che può essere fatto utilizzando qualsiasi sacchetto non trasparente in cui un angolo viene tagliato per consentire la respirazione dell'animale.</li>
	<li>Rilasciare l'animale solo se non ci sono problemi di sicurezza e non vi è alcun rischio di lesioni a causa di un animale in preda al panico; altrimenti tenere in mano gli ovini e studiare i movimenti degli animali pur mantenendo il controllo dell'animale.</li>
	<li>Bendare può esacerbare i segni di un sistema vestibolare o disfunzione cerebellare, che può essere oscurata dalla capacità dell'animale di compensare attraverso la sua visione. La perdita di equilibrio, l'incoordinazione o il circling possono essere provocati, in particolare in ovini altrimenti clinicamente insignificanti con scrapie atipica.</li>
</ol>8. Valutazione del movimento degli animali
<ol><li>Studia l'andatura e i movimenti muscolari dell'animale quando si muove liberamente.</li>
	<li>L'incoordinazione può essere caratterizzata da movimenti a base ampia degli arti posteriori, saltellando con entrambi gli arti posteriori o ondeggiando eccessivamente nei quarti posteriori, il che può causare inciampare o sedersi brevemente.</li>
	<li>La presenza di un tremore alla testa è spesso sottile quando l'animale è indisturbato ma può diventare più evidente durante o dopo il completamento dell'esame clinico.</li>
</ol>9. Interpretazione
<ol><li>Si consideri l'importanza dei risultati per quanto riguarda la scrapie.</li>
	<li>Sebbene la presenza di singoli segni, come una risposta ripetibile a graffi, tremore, comportamento anomalo, giri, episodi collassante, atassia o una risposta di minaccia assente, possa avere varie cause, il verificarsi combinato di due o più di questi segni è altamente suggestivo della scrapie nelle pecore o nelle capre.</li>
</ol>

<ol>
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Tutte le procedure riguardanti gli animali sono state eseguite in conformità con l'Animal (Scientific Procedures) Act del 1986, su licenza del ministero degli Interni del governo del Regno Unito. Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La scrapie è una malattia elencata dall'Organizzazione mondiale della sanità per la salute degli animali (OIE), che, in assenza di un test ante mortem rapido e affidabile, si basa sulla capacità degli agricoltori o dei veterinari di riconoscere i segni clinici associati a questa malattia. La maggior parte dei casi di scrapie, in particolare quelli atipici, tuttavia, sono attualmente riscontrati mediante sorveglianza mirata delle TSE, vale a dire mediante esame cerebrale di piccoli ruminanti soggetti a macellazione o animali morti. Allevare pecore per la resistenza alla scrapie classica, che ha ridotto il numero di casi classici di scrapie, molto probabilmente ha anche ridotto la consapevolezza delle persone per la malattia in modo che sia meno spesso considerata nella diagnosi differenziale dei disturbi neurologici negli ovini. La scrapie atipica ha anche una bassa prevalenza con circa cinque casi nei mattatoi e otto casi in scorte cadute ogni 10.000 testati in Europa4. Inoltre, il prurito, solitamente evidente come alopecia con o senza escoriazione, è spesso considerato un segno caratteristico della scrapie13. Pertanto, una malattia neurologica senza prurito concomitante osservata nella scrapie atipica12 o nella forma nonpruritica della scrapie caprina11 non può sollevare sospetti di scrapie.
Questo protocollo d'esame è stato concepito per identificare i segni clinici delle TSE negli ovini valutando specifici segni clinici associati a vari tipi di scrapie (scrapie atipica e classica, quest'ultima rappresentata da un'pecora atipica inoculata all'ESB, che presentava segni classici simili a scrapie). Nella scrapie classica, la percentuale di casi che mostravano una risposta graffiata positiva ("riflesso del mordicchiare") variava da 50-77 in oltre 100 pecorestudiate 5,8. I disturbi del movimento possono essere osservati fino all'81% dei casi classici di scrapie sulla base di varistudi 18. L'incoordinazione è anche un segno importante in vari casi naturali di scrapie atipica, spesso accompagnata da cambiamenti comportamentali1, ma ulteriori segni riportati sia nelle pecore scrapie atipiche naturalmente che sperimentalmente infette stavano girando e lacompromissione visiva 12,15,16, motivo per cui la benda e il test della risposta alla minaccia sono inclusi nel protocollo d'esame. Il punteggio della condizione corporea, ad esempio utilizzando un sistema di punteggio di 6 punti14, consente la valutazione dell'emaciazione, che può essere osservata nelle pecore colpite dalla scrapie5. Sebbene in precedenza siano stati proposti criteri clinici per aiutare l'individuazione della scrapienegli ovini 2, questi riguardavano solo l'individuazione della scrapie classica e prendevano in considerazione la storia clinica, che potrebbe non essere disponibile se gli animali vengono presentati in un mattatoio.
L'attuale protocollo consente lo screening di molti animali per i segni di scrapie in un breve periodo di tempo. Inoltre, il protocollo d'esame può essere applicato a studi sperimentali sulla scrapie negli ovini e nei caprini per monitorare l'insorgenza clinica, la progressione e il punto finale. Tuttavia, non sostituisce un esame fisico e neurologico più dettagliato con un'adeguata registrazione della casistica clinica, eventualmente seguita da esami diagnostici accessori (esame del sangue e del liquido cerebrospinale; tecniche di imaging più sofisticate, se del caso), che possono essere necessarie successivamente per escludere varie altre condizioni in piccoli ruminanti che presentano segni simili , come malattie neurologiche metaboliche o infiammatorie, ascessi cerebrali o tumori.
Sebbene un esame clinico sia generalmente meno sensibile nell'individuazione degli animali affetti da TSE rispetto ai test post mortem basati sull'individuazione della proteina prione2,11, in particolare in una fase precoce del periodo di incubazione, questo è attualmente l'unico metodo di rilevamento negli animali vivi e più rilevante per quei paesi che non hanno un sistema di sorveglianza mirato per identificare i piccoli ruminanti colpiti dalle TSE.

La scrapie è un'encefalopatia spongiforme trasmissibile (EST) di ovini e caprini, che appartiene al gruppo dei disturbi da errata delle proteine, come l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini, la malattia cronica da sprecare nei cervi e il morbo di Creutzfeldt-Jakob nell'uomo. La diagnosi viene fatta post mortem rilevando la forma anomala della proteina prione, che è resistente alle proteinasi, di solito nel cervello. Si possono distinguere due grandi forme di scrapie presenti in natura, che sono epidemiologicamente, patologicamente e biochimicamente diverse: scrapie classica e scrapie atipica. Inoltre, una malattia neurologica con segni clinici classici simili alla scrapie può essere indotta negli ovini e nei caprini da un'infezione sperimentalecon l'agente dell'ESB 6,10-11. In effetti, l'ESB presente in natura è stata diagnosticata nelle capre3,17. Il controllo della scrapie classica (e dell'ESB negli ovini se si è verificata naturalmente) è stato ottenuto mediante allevamento per una resistenza genetica mirata al gene delle proteine prioniche, ma ciò è più difficile per la scrapie atipica, che si ritiene sia una malattia sporadica ed è stata diagnosticata in paesi considerati esenti dalla scrapie classica, ad esempio la Nuova Zelanda7.
La scrapie è una malattia neurologica di pecore e capre adulte che porta a cambiamenti nel comportamento, nella sensazione e nel movimento, ma la malattia è lentamente progressiva e i segni clinici spesso non sono riconosciuti perché il custode o il veterinario potrebbe non avere familiarità con i segni clinici o la scrapie non è affatto considerata nella diagnosi differenziale delle malattie neurologiche nei piccoli ruminanti.
Il protocollo d'esame proposto è stato concepito per aiutare nella diagnosi clinica della scrapie con due scopi in mente: dovrebbe essere considerevolmente breve consentire la scansione di molti animali in un breve periodo di tempo, ma abbastanza specifico da consentire l'individuazione di animali colpiti da scrapie, che si ottiene valutando la presenza di segni clinici frequentemente riscontrati negli animali colpiti dalla scrapie. Questo protocollo è una leggera modifica rispetto a quello utilizzato per monitorare le capre alla ricerca di segni di scrapieclassica 11 e include la benda dell'animale, che può esacerbare i segni clinici non normalmente associati alla scrapie9.

clinical examination protocol to detect atypical and classical scrapie in sheep

La diagnosi di scrapie, un'encefalopatia spongiforme trasmissibile (EST) di ovini e caprini, si basa attualmente sull'individuazione di proteine prionali associate alla malattia mediante test post mortem. A meno che un campione casuale della popolazione ovina o caprina non sia attivamente monitorato per la scrapie, l'identificazione dei casi di scrapie si basa sulla segnalazione di sospetti clinici, che dipende dalla familiarizzazione dell'individuo con la malattia e dalla capacità di riconoscere i segni clinici associati alla scrapie. La scrapie non può essere considerata nella diagnosi differenziale delle malattie neurologiche nei piccoli ruminanti, in particolare nei paesi a bassa prevalenza di scrapie, o non riconosciuta se si presenta come forma nonpruritica come la scrapie atipica. Per aiutare nell'identificazione degli indagati clinici, viene presentato un breve protocollo di esame per valutare la visualizzazione di segni clinici specifici associati a forme pruriginotiche e nonprurito di TSE negli ovini, che potrebbero essere applicati anche alle capre. Ciò include la valutazione del comportamento, della visione (testando la risposta della minaccia), del prurito (testando la risposta ai graffi) e del movimento (con e senza benda). Ciò può portare a un esame neurologico più dettagliato della segnalazione degli animali come sospetti scrapie. Potrebbe anche essere utilizzato in studi sperimentali sulle TSE su ovini o caprini per valutare la progressione della malattia o per identificare il punto finale clinico.

Pecore clinicamente sane. Sondaggio Dorset wether da un gregge senza scrapie intracerebrally inoculato con cervello bovino di origine neozelandese ed esaminato a 49 mesi dopo l'inoculazione. Questa pecora ha una postura normale, si comporta normalmente, mostra una normale risposta di minaccia (Figura 1), non reagisce al test dei graffi, ha un pile intatto e un'ottima condizione corporea. È clinicamente insignificante quando bendata e non mostra segni di un disturbo del movimento.
Ovini scrapie atipici che presentano la forma nonpruritica delle TSE negli ovini. Cheviot wether da un gregge privo di scrapie intracerebrally inoculato con omogeneato cerebrale da un caso di campo scrapie atipico dello stesso genotipo di proteina prione (AHQ/AHQ) ed esaminato a 36 mesi dopo l'inoculazione. Questa pecora ha anche una postura normale ma si comporta in modo diverso dalle altre pecore nella penna e gira in senso orario. Non lampeggia quando viene testata la risposta di minaccia. Graffiare non suscita alcuna risposta e nessun cambiamento di pile è evidente, ma le condizioni del corpo sono solo giuste. Gira in senso orario quando è bendato (Figura 2) e perde equilibrio. L'andatura è atassica e un bel tremore alla testa è visibile.
Ovini atipici dell'ESB che presentano la forma pruritica delle TSE negli ovini, che è clinicamente simile alla presentazione clinica degli ovini classici colpiti dalla scrapie. Per questo motivo, un classico caso di scrapie non è incluso. Sondaggio Dorset wether da un gregge privo di scrapie intracerebrally inoculato con omogeneato cerebrale bovino atipico (tipo L) BSE ed esaminato a 50 mesi dopo l'inoculazione. Questa pecora è leggermente curva, tende a mantenere gli arti posteriori a base larga e cade sul pavimento quando viene catturata. La risposta della minaccia è debole. Graffiare varie aree della schiena provoca movimenti della testa o delle labbra (Figura 3), e c'è perdita di lana con un piccolo trauma cutaneo sul sondaggio. Le condizioni del corpo sono buone. Quando è bendato, è riluttante a muoversi e poggia la sua parte posteriore sull'ostacolo per mantenere l'equilibrio. La pecora è atassica e mostra ipermetria dell'arto anteriori.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1.jpg"> Figura 1. Test di risposta alla minaccia. Un gesto minaccioso verso l'occhio dell'animale induce una risposta lampeggiante. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2.jpg"> Figura 2. Bendaggio. Girando in senso orario suscitato bendando le pecore con un cappuccio. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3.jpg"> Figura 3. Test della risposta graffiante. Graffiare la parte posteriore provoca leccare le labbra con movimenti laterali della testa Fare clic qui <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" target="_blank">per visualizzare un'immagine più grande.</a>

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Clinical Examination Protocol to Detect Atypical and Classical Scrapie in Sheep

Viene presentato un breve protocollo di esame clinico per aiutare nell'individuazione della scrapie classica e atipica negli ovini e nei caprini.

Protocollo di esame clinico per rilevare la scrapie atipica e classica negli ovini

The diagnosis of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy (TSEs) of sheep and goats, is currently based on the detection of disease-associated ...

clinical-examination-protocol-to-detect-atypical-classical-scrapie

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K Views.  Animal Health and Veterinary Laboratories Agency Weybridge. Viene presentato un breve protocollo di esame clinico per aiutare nell'individuazione della scrapie classica e atipica negli ovini e nei caprini.

Video: Clinical Examination Protocol to Detect Atypical and Classical Scrapie in Sheep

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l&#39;infezione intraperitoneale

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedure per l&#39;identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l&#39;apparato digerente di una specie aviaria

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Valutare l&#39;encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Protein Assay Conversion

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Medicina

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, there is a need to validate additional diagnostic techniques to improve rabies surveillance, particularly in developing countries. Here, we present a standard protocol for the DRIT as an alternative, laboratory or field-based testing option that uses light microscopy as compared to the DFA. Touch impressions of brain tissue collected from suspect animals are fixed in 10% buffered formalin. The DRIT uses rabies virus-specific monoclonal or polyclonal antibodies (conjugated to biotin), a streptavidin-peroxidase enzyme, and a chromogen reporter (such as acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) to detect viral inclusions within infected tissue. In approximately 1 h, a brain tissue sample can be tested and interpreted by the DRIT. Evaluation of suspect animal brains tested from a variety of species in North America, Asia, Africa, and Europe have illustrated high sensitivity and specificity by the DRIT approaching 100% with results compared to DFA. Since 2005, the United States Department of Agriculture&#8217;s Wildlife Services (USDA WS) program has conducted large-scale enhanced rabies surveillance efforts using the DRIT to test &#62;94,000 samples collected from wildlife in strategic rabies management areas. The DRIT provides a powerful, economical tool for rabies diagnosis that can be used by laboratorians and field biologists to improve current rabies surveillance, prevention and control programs globally.

The direct rapid immunohistochemical test (DRIT) offers a World Organization for Animal Health and World Health Organization (OIE/WHO) recognized alternative to the direct fluorescent antibody (DFA) test for rabies diagnosis. This test allows for field-based applications that can be performed in approximately 1 h upon brain impressions using light microscopy.

Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the entire state, with the exception of New York City. The Rabies laboratory necropsies a variety of animals ranging in size from bats to bovids. Most of these specimens are animals exhibiting neurological signs, however, less than 10% actually test positive for rabies; implying trauma, lesions or other infectious agents as the cause of these symptoms. Due to the risk of aerosolizing undiagnosed infectious agents, the Rabies Laboratory does not use power tools or saws. Three necropsy techniques will be presented for animals whose skulls are impenetrable with scissors. The laboratory has implemented these techniques to decrease potential exposure to infectious agents, eliminate unnecessary manipulation of the specimen and reduce processing time. The advantages of a preferred technique opposed to another is subject to the trained individual processing the specimen.

The goal of this protocol is to demonstrate safe necropsy techniques in small and large animals to obtain satisfactory tissue samples for rabies testing.

Tecniche di necropsia della rabbia negli animali grandi e piccoli

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the ...

Neuroscienze

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Test di strisciamento del laboratorio di sicurezza dei prioni

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Induzione e valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale nel topo

Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS). It is characterized by different prevalence in the sexes, affecting more women than men, and different outcomes, showing more aggressive forms in men than in women. Furthermore, MS is highly heterogeneous in terms of clinical aspects, radiological, and pathological features. Thus, it is necessary to take advantage of experimental animal models that allow the investigation of as many aspects of the pathology as possible. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) represents one of the most used models of MS in mice, modeling different disease features, from the activation of the immune system to CNS damage. Here we describe a protocol for the induction of EAE in both male and female C57BL/6J mice using myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) immunization, which leads to the development of a chronic form of the disease. We also report the evaluation of the daily clinical score and motor performance of these mice for 28 days post immunization (28 dpi). Lastly, we illustrate some basic histological analysis at the CNS level, focusing on the spinal cord as the primary site of disease-induced damage.

Autore in primo piano: Creazione di un modello sperimentale versatile di encefalomielite autoimmune rilevante sia per i topi maschi che per le femmine 

Experimental autoimmune encephalomyelitis is one of the most widely used murine models of multiple sclerosis. In the current protocol, C57BL/6J mice of both sexes are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide, resulting mainly in ascending paresis of the tail and limbs. Here we discuss the protocol of EAE induction and evaluation.

Protocollo di esame clinico per rilevare la scrapie atipica e classica negli ovini

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l'infezione intraperitoneale

Procedure per l'identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l'apparato digerente di una specie aviaria

Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Tecniche di necropsia della rabbia negli animali grandi e piccoli

Test di strisciamento del laboratorio di sicurezza dei prioni

Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG_35-55

Protocollo di esame clinico per rilevare la scrapie atipica e classica negli ovini

Riepilogo

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Procedure per l'identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l'apparato digerente di una specie aviaria

Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Tecniche di necropsia della rabbia negli animali grandi e piccoli

Test di strisciamento del laboratorio di sicurezza dei prioni

Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG_35-55