Os estudos que fornecem os animais foram financiados pelo Departamento de Alimentos, Meio Ambiente e Assuntos Rurais do Reino Unido e pela União Europeia (por meio de financiamento do Laboratório de Referência do TSE da UE). Reconhecemos o apoio dos gerentes de projeto, Dr.M. Simmons e Dr.M. Jeffrey.

1. Avaliação da Postura
<ol><li>Avalie a postura do animal enquanto não foi perturbado.</li>
	<li>Os animais afetados por TSEs podem ficar com membros de base larga, podem parecer curvados ou podem ficar com um carro de cabeça baixa.</li>
</ol>2. Avaliação do Comportamento
<ol><li>Estude o comportamento do animal, quando deixado sozinho, quando abordado, e quando manuseado.</li>
	<li>Animais afetados pelo TSE podem apresentar mentação alterada ficando separadamente de outras ovelhas ou não seguindo imediatamente outras ovelhas.</li>
	<li>Quando o animal é abordado, ele pode fugir e desmaiar, ou ele cai no chão quando manuseado. O sentido horário compulsivo ou no sentido anti-horário pode ser visto em ovelhas com raspagem atípica.</li>
</ol>3. Teste de resposta a ameaças
<ol><li>Segure a cabeça do animal para testar a resposta à ameaça: mova a mão ou vários dedos várias vezes em direção a cada olho do animal para induzir uma resposta piscando, mas tenha cuidado para não tocar em nenhum pelos faciais ou criar qualquer turbulência de ar que possa fazer o animal piscar.</li>
	<li>A resposta à ameaça pode estar ausente em animais afetados por sucata, particularmente em ovelhas com raspagem atípica. Embora o teste da resposta à ameaça seja o único teste nervoso craniano usado como parte do protocolo, a inspeção visual do rosto durante este procedimento pode revelar outros sinais de déficits neurológicos normalmente não vistos em scrapie, por exemplo, paralisia facial. Se o animal não piscar em resposta à ameaça é aconselhável testar o reflexo palpebral tocando as pálpebras para garantir que a incapacidade do animal de piscar não seja causada por paralisia facial.</li>
</ol>4. Teste da resposta de arranhões
<ol><li>Certifique-se de que o animal está calmo durante este procedimento porque o teste não pode ser interpretado em um animal em dificuldades.</li>
	<li>Raspar áreas das costas nas regiões torácica, lombar e sacral, parando entre cada episódio de arranhão.</li>
	<li>Se o animal responder com movimentos rítmicos da cabeça ou do corpo, ou se mover ou lamber os lábios ao arranhar uma determinada área, repita o teste de arranhão para confirmar a reprodutibilidade da resposta ao arranhão.</li>
	<li>Uma resposta repetível é geralmente provocada em animais que são pruriticos, que geralmente incluem ovelhas com scrapie clássico ou cabras com a forma pruritica de scrapie, mas geralmente não há resposta em ovelhas com sucata atípica a menos que outras condições de pele pruritica ou ectoparasitas estejam presentes.</li>
</ol>5. Verificação de perda de lã e lesões de pele
<ol><li>Inspecione a pele.</li>
	<li>Prurido devido a raspagem geralmente causa queda de cabelo, que pode estar na pesquisa, costas, garupa, lado do peito ou abdômen devido a esfregar ou arranhar excessivamente onde a pele subjacente parece normal.</li>
	<li>As abrasões podem aparecer mais tarde se o animal tiver a oportunidade de esfregar objetos pontiagudos. Ferimentos de mordida podem aparecer, particularmente nos membros, devido ao excesso de mordiscar os membros.</li>
</ol>6. Condição do corpo de pontuação
<ol><li>Avalie a condição corporal do animal palpando os processos dorsais e transversais das vértebras lombares.</li>
	<li>Scrapie pode causar uma perda progressiva da condição corporal onde os processos transversais das vértebras lombares podem ser facilmente sentidos individualmente, e as extremidades dos processos parecem nítidas.</li>
</ol>7. Vendar o Animal
<ol><li>Cubra os olhos do animal com um capuz, que pode ser feito usando qualquer saco não-ver-através onde um canto é cortado para permitir a respiração do animal.</li>
	<li>Solte o animal somente se não houver preocupações de segurança, e não há risco de ferimentos devido a um animal em pânico; caso contrário, manter o porão das ovelhas e estudar os movimentos dos animais enquanto ainda está no controle do animal.</li>
	<li>A venda pode exacerbar sinais de um sistema vestibular ou disfunção cerebelar, que pode ser obscurecida pela capacidade do animal de compensar através de sua visão. A perda de equilíbrio, a incoordenação ou a circlínica podem ser provocadas, particularmente em ovelhas clinicamente não notáveis com scrapie atípico.</li>
</ol>8. Avaliação do Movimento animal
<ol><li>Estude a marcha e os movimentos musculares do animal quando ele se move livremente.</li>
	<li>A incoordenação pode ser caracterizada por movimentos de base ampla dos membros traseiros, pulando com ambos os membros traseiros, ou balançando excessivamente nos quartos traseiros, o que pode resultar em tropeços ou brevemente sentados.</li>
	<li>A presença de um tremor na cabeça é muitas vezes sutil quando o animal não é perturbado, mas pode se tornar mais perceptível durante ou após a conclusão do exame clínico.</li>
</ol>9. Interpretação
<ol><li>Considere o significado dos achados em relação ao scrapie.</li>
	<li>Embora a presença de sinais individuais, como uma resposta repetível a arranhões, tremores, comportamento anormal, circulando, episódios em colapso, ataxia, ou uma resposta à ameaça ausente, possa ter várias causas, a ocorrência combinada de dois ou mais desses sinais é altamente sugestiva de scrapie em ovelhas ou cabras.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Benestad, S. L., Arsac, J. N., Goldmann, W., N&#246;remark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical/Nor98+scrapie:+properties+of+the+agent,+genetics,+and+epidemiology.">Atypical/Nor98 scrapie: properties of the agent, genetics, and epidemiology.</a> Vet Res.. 39 (4), 19 (2008).</li><li>D&#39;Angelo, A., Maurella, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+clinical+criteria+to+diagnose+scrapie+in+Italy.">Assessment of clinical criteria to diagnose scrapie in Italy.</a> Vet. J. 174 (1), 106-112 (2007).</li><li>Eloit, M., Adjou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSE+agent+signatures+in+a+goat.">BSE agent signatures in a goat.</a> Vet. 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Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Lei de 1986, sob licença do Ministério do Interior do Governo do Reino Unido. Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Scrapie é uma doença listada pela Organização Mundial da Saúde Animal (OIE), que, na ausência de um teste pré-mortem rápido e confiável, conta com a capacidade dos agricultores ou veterinários de reconhecer os sinais clínicos associados a essa doença. A maioria dos casos de scrapie, particularmente atípicos, no entanto, são atualmente encontrados pela vigilância do TSE, ou seja, por exame cerebral de pequenos ruminantes sujeitos a abate ou animais de estoque caídos. A criação de ovelhas para resistência ao scrapie clássico, que reduziu o número de casos clássicos de scrapie, provavelmente também reduziu a conscientização das pessoas para a doença, de modo que é menos frequentemente considerada no diagnóstico diferencial de distúrbios neurológicos em ovinos. O scrapie atípico também tem baixa prevalência com aproximadamente cinco casos em matadouros e oito casos em estoque caído por 10.000 testados na Europa4. Além disso, o prurido, geralmente evidente como alopecia com ou sem excoriação, é muitas vezes considerado um sinal característico de scrapie13. Assim, uma doença neurológica sem prurido concomitante como observado no scrapie atípico12 ou na forma nãoprúrida de scrapie11 caprino não pode levantar suspeita de scrapie.
Este protocolo de exame foi concebido para identificar sinais clínicos do TSE em ovinos, avaliando sinais clínicos específicos associados a vários tipos de scrapie (scrapie atípico e clássico, este último representado por uma ovelha atípica BSE-inoculada, que apresentava sinais clássicos de scrapie). No scrapie clássico, a porcentagem de casos que apresentaram uma resposta positiva de risco ("reflexo de mordiscar") variou de 50 a 77 em mais de 100 ovinos estudados5,8. Os transtornos de movimento podem ser observados em até 81% dos casos clássicos de scrapie com base em vários estudos18. A incoordenação também é um grande sinal em vários casos de scrapie atípico, muitas vezes acompanhados de alterações comportamentais1, mas sinais adicionais relatados tanto em ovelhas de scrapie atípicas e experimentalmente infectadas foram circulantes e deficiência visual12,15,16, razão pela qual a venda de olhos e os testes da resposta à ameaça estão incluídos no protocolo de exame. A pontuação da condição corporal, por exemplo, utilizando um sistema de pontuação de 6 pontos14,permite a avaliação da emaciação, que pode ser observada em ovelhas afetadas por sucata5. Embora os critérios clínicos para auxiliar na detecção de scrapie em ovelhas tenham sido propostos anteriormente2, estes apenas relacionados à detecção de scrapie clássico e levaram em conta o histórico clínico, que pode não estar disponível se os animais forem apresentados em um matadouro.
O protocolo atual permite a triagem de muitos animais para sinais de sucata em um curto período de tempo. Além disso, o protocolo de exame pode ser aplicado a estudos experimentais de sucata em ovinos e caprinos para monitorar o início clínico, a progressão e o ponto final. No entanto, não substitui um exame físico e neurológico mais detalhado pelo registro adequado do histórico de casos clínicos, possivelmente seguido de testes diagnósticos auxiliares (exame de sangue e fluido cefalorraquidiano; técnicas de imagem mais sofisticadas, se for o caso), o que pode ser necessário posteriormente para descartar várias outras condições em pequenos ruminantes que apresentam sinais semelhantes , como doenças neurológicas metabólicas ou inflamatórias, abscessos cerebrais ou tumores.
Embora um exame clínico seja geralmente menos sensível na detecção de animais afetados pelo TSE do que testes post mortem baseados na detecção de proteína de prípria2,11, particularmente em um estágio inicial do período de incubação, este é atualmente o único método de detecção em animais vivos e mais relevante para os países que não possuem um sistema de vigilância direcionado para identificar pequenos ruminantes afetados pelo TSE.

Scrapie é uma encefalopatia espongiforme transmissível (TSE) de ovelhas e cabras, que pertence ao grupo de distúrbios de dobra de proteínas, como encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, doença de desocupação crônica em veados e doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos. O diagnóstico é feito após a morte, detectando a forma anormal da proteína prion, que é resistente à proteína, geralmente no cérebro. Duas grandes formas de scrapie que ocorrem naturalmente podem ser distinguidas, que são epidemiológicas, patologicamente e bioquimicamente diferentes: scrapie clássico e scrapie atípico. Além disso, uma doença neurológica com sinais clínicos clássicos semelhantes a scrapie pode ser induzida em ovelhas e cabras por infecção experimental com o agente BSE6,10-11. De fato, a EE de ocorrência natural foi diagnosticada em cabras3,17. O controle do scrapie clássico (e da EE em ovelhas se ocorreu naturalmente) tem sido alcançado pela reprodução para resistência genética visando o gene da proteína prion, mas isso é mais difícil para o scrapie atípico, que acredita-se ser uma doença esporádica e foi diagnosticado em países considerados livres de scrapie clássico, por exemplo, Nova Zelândia7.
Scrapie é uma doença neurológica de ovinos e caprinos adultos que resultam em mudanças de comportamento, sensação e movimento, mas a doença é lentamente progressiva, e os sinais clínicos muitas vezes não são reconhecidos porque o protetor animal ou cirurgião veterinário pode não estar familiarizado com os sinais clínicos, ou scrapie não é considerado em tudo no diagnóstico diferencial de doenças neurológicas em pequenos ruminantes.
O protocolo de exame proposto foi concebido para auxiliar no diagnóstico clínico de scrapie com dois propósitos em mente: deve ser consideravelmente breve permitir a varredura de muitos animais em um curto período de tempo, mas específico o suficiente para permitir a detecção de animais afetados por sucata, o que é alcançado avaliando a presença de sinais clínicos frequentemente encontrados em animais afetados por sucata. Este protocolo é uma pequena modificação do usado para monitorar cabras em busca de sinais de scrapieclássico 11 e inclui vendagen do animal, o que pode exacerbar sinais clínicos normalmente não associados ao scrapie9.

clinical examination protocol to detect atypical and classical scrapie in sheep

O diagnóstico de scrapie, uma encefalopatia esponiforme transmissível (TSEs) de ovelhas e cabras, baseia-se atualmente na detecção de proteína prion associada à doença por testes post mortem. A menos que uma amostra aleatória da população de ovinos ou caprinos seja ativamente monitorada para scrapie, a identificação de casos de scrapie depende do relato de suspeitos clínicos, o que depende da familiarização do indivíduo com a doença e da capacidade de reconhecer sinais clínicos associados ao scrapie. O scrapie não pode ser considerado no diagnóstico diferencial de doenças neurológicas em pequenos ruminantes, particularmente em países com baixa prevalência de scrapie, ou não reconhecido se apresenta como forma nãoprúrrica como sucata atípica. Para auxiliar na identificação de suspeitos clínicos, é apresentado um protocolo de exame curto para avaliar a exibição de sinais clínicos específicos associados a formas pruriticas e nãoprúrticas de TSEs em ovinos, que também poderiam ser aplicadas às cabras. Isso inclui avaliação de comportamento, visão (por teste da resposta à ameaça), prurido (testando a resposta ao arranhão) e movimento (com e sem vendas). Isso pode levar a um exame neurológico mais detalhado de relatar animais como suspeitos de sucata. Também pode ser usado em estudos experimentais do TSE de ovinos ou caprinos para avaliar a progressão da doença ou identificar ponto final clínico.

Ovelhas clinicamente saudáveis. Poll Dorset wether de um rebanho sem arranhões intracerebrally inoculado com cérebro bovino de origem neozelandesa e examinado aos 49 meses após a inoculação. Esta ovelha tem uma postura normal, se comporta normalmente, exibe uma resposta normal de ameaça(Figura 1),não reage ao teste de arranhão, tem um velo intacto, e uma condição corporal muito boa. É clinicamente incomum quando vendado e não mostra sinais de distúrbio de movimento.
Ovelhas de scrapie atípicas apresentando a forma nãoprúrtica de TSEs em ovelhas. Cheviot wether de um rebanho livre de arranhões intracerebrally inoculado com homogeneizar cérebro de um caso atípico de campo de sucata do mesmo genótipo de proteína de prion (AHQ/AHQ) e examinado aos 36 meses após a inoculação. Esta ovelha também tem uma postura normal, mas se comporta de forma diferente com as outras ovelhas na caneta e circula no sentido horário. Não pisca quando a resposta à ameaça é testada. Arranhar não provoca nenhuma resposta, e nenhuma mudança de lã é aparente, mas a condição corporal é justa. Ele circula no sentido horário quando vendado(Figura 2) e perde o equilíbrio. A marcha é ataxic, e um tremor fino na cabeça é visível.
Ovelhas BSE atípicas apresentando a forma pruritica de TSEs em ovelhas, que é clinicamente semelhante à apresentação clínica de ovelhas clássicas afetadas por scrapie. Por essa razão, um caso clássico de scrapie não está incluído. Poll Dorset wether de um rebanho sem raspagem intracerebrally inoculado com peitoico atípico (tipo L) cérebro BSE e examinado aos 50 meses pós-inoculação. Esta ovelha fica ligeiramente curvada, tende a manter os membros traseiros de base larga e cai no chão quando pego. A resposta à ameaça é fraca. O arranhão de várias áreas da parte de trás provoca movimentos de cabeça ou lábio(Figura 3),e há perda de lã com trauma de pele menor na pesquisa. O estado do corpo é bom. Quando vendado, reluta em se mover e descansa sua parte traseira no obstáculo para manter o equilíbrio. A ovelha é ataxic e exibe hipermetria de membros do antepé.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1.jpg"> Figura 1. Teste de resposta à ameaça. Gesto ameaçador em direção ao olho do animal induz uma resposta piscando. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2.jpg"> Figura 2. Vendando. No sentido horário, circulando provocado por vendar as ovelhas com um capuz. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3.jpg"> Figura 3. Teste da resposta de arranhões. O arranhão da parte de trás provoca lambida labial com movimentos laterais da cabeça <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

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Clinical Examination Protocol to Detect Atypical and Classical Scrapie in Sheep

Um protocolo de exame clínico curto é apresentado para auxiliar na detecção de sucata clássica e atípica em ovelhas e cabras.

Protocolo de Exame Clínico para Detectar Scrapie Atípico e Clássico em Ovelhas

The diagnosis of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy (TSEs) of sheep and goats, is currently based on the detection of disease-associated ...

clinical-examination-protocol-to-detect-atypical-classical-scrapie

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K visualizações.  Animal Health and Veterinary Laboratories Agency Weybridge. Um protocolo de exame clínico curto é apresentado para auxiliar na detecção de sucata clássica e atípica em ovelhas e cabras.

Vídeo: Clinical Examination Protocol to Detect Atypical and Classical Scrapie in Sheep

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Imunologia e Infecção

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Conversão Protein Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Medicina

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, there is a need to validate additional diagnostic techniques to improve rabies surveillance, particularly in developing countries. Here, we present a standard protocol for the DRIT as an alternative, laboratory or field-based testing option that uses light microscopy as compared to the DFA. Touch impressions of brain tissue collected from suspect animals are fixed in 10% buffered formalin. The DRIT uses rabies virus-specific monoclonal or polyclonal antibodies (conjugated to biotin), a streptavidin-peroxidase enzyme, and a chromogen reporter (such as acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) to detect viral inclusions within infected tissue. In approximately 1 h, a brain tissue sample can be tested and interpreted by the DRIT. Evaluation of suspect animal brains tested from a variety of species in North America, Asia, Africa, and Europe have illustrated high sensitivity and specificity by the DRIT approaching 100% with results compared to DFA. Since 2005, the United States Department of Agriculture&#8217;s Wildlife Services (USDA WS) program has conducted large-scale enhanced rabies surveillance efforts using the DRIT to test &#62;94,000 samples collected from wildlife in strategic rabies management areas. The DRIT provides a powerful, economical tool for rabies diagnosis that can be used by laboratorians and field biologists to improve current rabies surveillance, prevention and control programs globally.

The direct rapid immunohistochemical test (DRIT) offers a World Organization for Animal Health and World Health Organization (OIE/WHO) recognized alternative to the direct fluorescent antibody (DFA) test for rabies diagnosis. This test allows for field-based applications that can be performed in approximately 1 h upon brain impressions using light microscopy.

Vigilância aumentada da raiva usando um teste Imunoistoquímico rápido direto

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the entire state, with the exception of New York City. The Rabies laboratory necropsies a variety of animals ranging in size from bats to bovids. Most of these specimens are animals exhibiting neurological signs, however, less than 10% actually test positive for rabies; implying trauma, lesions or other infectious agents as the cause of these symptoms. Due to the risk of aerosolizing undiagnosed infectious agents, the Rabies Laboratory does not use power tools or saws. Three necropsy techniques will be presented for animals whose skulls are impenetrable with scissors. The laboratory has implemented these techniques to decrease potential exposure to infectious agents, eliminate unnecessary manipulation of the specimen and reduce processing time. The advantages of a preferred technique opposed to another is subject to the trained individual processing the specimen.

The goal of this protocol is to demonstrate safe necropsy techniques in small and large animals to obtain satisfactory tissue samples for rabies testing.

Técnicas de necropsia da raiva em animais grandes e pequenos

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the ...

Neurociência

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Teste de furto do laboratório de segurança de príons

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Indução e avaliação da encefalomielite autoimune experimental em camundongos

Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS). It is characterized by different prevalence in the sexes, affecting more women than men, and different outcomes, showing more aggressive forms in men than in women. Furthermore, MS is highly heterogeneous in terms of clinical aspects, radiological, and pathological features. Thus, it is necessary to take advantage of experimental animal models that allow the investigation of as many aspects of the pathology as possible. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) represents one of the most used models of MS in mice, modeling different disease features, from the activation of the immune system to CNS damage. Here we describe a protocol for the induction of EAE in both male and female C57BL/6J mice using myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) immunization, which leads to the development of a chronic form of the disease. We also report the evaluation of the daily clinical score and motor performance of these mice for 28 days post immunization (28 dpi). Lastly, we illustrate some basic histological analysis at the CNS level, focusing on the spinal cord as the primary site of disease-induced damage.

Autor em destaque: Criando um modelo experimental versátil de encefalomielite autoimune relevante para camundongos machos e fêmeas 

Experimental autoimmune encephalomyelitis is one of the most widely used murine models of multiple sclerosis. In the current protocol, C57BL/6J mice of both sexes are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide, resulting mainly in ascending paresis of the tail and limbs. Here we discuss the protocol of EAE induction and evaluation.

Protocolo de Exame Clínico para Detectar Scrapie Atípico e Clássico em Ovelhas

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Vigilância aumentada da raiva usando um teste Imunoistoquímico rápido direto

Técnicas de necropsia da raiva em animais grandes e pequenos

Teste de furto do laboratório de segurança de príons

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG_35-55

Protocolo de Exame Clínico para Detectar Scrapie Atípico e Clássico em Ovelhas

Resumo

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Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Vigilância aumentada da raiva usando um teste Imunoistoquímico rápido direto

Técnicas de necropsia da raiva em animais grandes e pequenos

Teste de furto do laboratório de segurança de príons

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG_35-55