この作品は、アイアコッカファミリー財団、ロザリンドフランクリン大学スタートアップ資金、健康グラントDK092721（RVIまで）の国立研究所からの研究助成金によって支えられている。著者は、原稿作成の援助のためのニッキ内膜に感謝したいと思います。

すべての手順は、（85から23までは、。研究所国立保健出版物のいかなる1985年改訂） &quot;実験動物ケアの原則&quot;で説明したガイドラインに従って実施され、承認ロザリンドフランクリン大学機関動物実験委員会、動物プロトコル08から19を使用しています。 この原稿で使用されている2つの重要な略語があります。 1）DMは、急性（300 mg / dl）は、高血糖状態になっている魚を意味し、少なくとも3週間となっていました。 2）MMは：21日であった魚（プロトコルを参照してください）​​、DM魚を指し、膵臓再生を通じて血糖コントロールを復元することができました。これは薬剤の除去（14）日以内に達成されています。魚はこの時点以降からMM魚とみなされます。コントロールと呼ばれている魚を注意することも重要であることは、DM又はMM注射の数の点で魚（生理食塩水のみ）、様々な温度でのインキュベーション時間数とタイミングと同じように扱われます尾鰭切断の。 1。糖尿病は、DMとゼブラフィッシュの発生<ol><li>回復と麻酔薬の水タンクの両方を準備します。回復水は通常の魚の水である。麻酔薬水は通常の魚の水中で1:1000希釈が達成されるように、2 - フェノキシエタノールを十分追加します。 </li><li> 0.09％塩化ナトリウム2mlにSTZ 6mgのを追加し、直ちに氷上にソリューションを配置することによってストレプトゾシン（STZ）の0.3％溶液（ドラフト内で）を用意します。これは、20分で約20魚を注入するための十分な注射液を提供するでしょう。あなたは20分のマークを超えた場合、停止、続行する前に、新鮮なのSTZ溶液を作る。コントロール魚用に別のチューブアリコート十分な生理食塩水で。 STZが可溶化された後、後続のすべての手順は、ヒュームフードの使用を必要としません。 </li><li>に気泡がトラップされていないことを確実にSTZまたはコントロールソリューションで27 1/2ゲージの針を装備半ccシリンジを埋める。 </li><li> Anesthe麻酔水に魚を置くことによって、個々の魚をtize、およびそれらの水泳の動きは（1-2分）止まるまで待ちます。 </li><li>一度麻酔簡単には余分な水分を吸収するペーパータオルの上に魚を置いて、船の重さで魚を置き、魚の質量を測定する。 </li><li>注入のためのしっかりした面（シャーレのふた）に魚を置きます。 </li><li>腹側腹膜の後面にベベルを過ぎて針を挿入することによって、魚の腹腔内にSTZまたはコントロール溶液を注入する。 </li><li> STZの0.35 mg / gの（350 mg / kgの）はそれぞれの魚に配信されるべきであり、必要な0.3％溶液の体積は次のように計算することができます。 <ol class="lalpha"><li>必要なのmg STZ量を得るために0.35で魚の質量（g）を掛けます。 </li><li> μlの注入に必要な0.3％溶液の体積を得るために3で生成された上記の製品を分割します。 サンプル：0.5グラムの魚の場合：）0.5×0.35 = 0.175 b）は0.0175 / 3 = 0.058ミリリットル= 58μlの。 STZなしで同じボリュームがコントロール魚のために注入されるであろう。魚質量当たりの注入するボリューム用シートが生成され、クイックリファレンスとして使用されるべきである。 </li></ol></li><li>注入後の回復水槽で魚を置き、通常の水泳活動のためにそれらを監視します。 24℃ - この設定が完了すると、22℃での還元温度範囲に維持されている通常の生活タンクに移送された魚を達成されているこの減少温度は、高血糖の効率的な誘導（糖尿病、DM）のために不可欠です。 </li><li>高血糖は、最初の注射の24時間以内に検出されていますが、非常に高血糖の状態が長期化を誘導するために、ゼブラフィッシュでは、下図のように毎週の保守注射続く頻繁な注射誘導段階を必要とします。 </li></ol>第1週：3回の注射（1日目、3、5）、第2週：1注射（12日目）、第3週：1注射（19日目）、 第4週（21日目）を実行関心のアッセイ。 この時点で、ゼブラフィッシュは、高血糖の長期状態になっていると考えられ、網膜症、腎症とも損なわフィン再生の糖尿病合併症を発揮しています。これらは、DMの魚と呼ばれています。必要に応じてさら​​に魚は毎週メンテナンス注射で高血糖状態に維持することができる。このプロセスの間に約5％の死亡が予想されるべきです。 2。採血や空腹時血糖値（FBGL）判定<ol><li> DMとコントロール魚の各グループは、このアッセイは、これらの魚が犠牲にする必要があるため、正確にはグループの平均FBGLを決定するのに十分な魚を含める必要があります。 </li><li>滅菌生理食塩水5μlを含む各血液サンプルのために標識PCRチューブを準備します。 </li><li>採血については、上記のように魚を麻酔し、すべての水を除去顕微鏡スライド上に魚を置いて、メスを用いて、魚の頭を削除蓋の基部にある。 </li><li>スライド上に魚から解放され、迅速に血液が詰まらないことを確認するために上下にピペッティングし滅菌生理食塩水を5μlに追加された血液（最大2μl）を収集します。すぐにサンプルを氷上に置きます。 </li><li>液体（生理食塩水+血液）の総量を測定することにより、血液検体量を決定してから、生理食塩水5μlを差し引く。 </li><li> 1.5 mlのマイクロチューブに各PCRチューブから希釈血液5μlを移し、QuantiChromeグルコースアッセイキットを用いて、血中グルコース濃度を測定します。これは、例外なく、製造業者のプロトコルに従って行われます。期待される結果：制御/通常魚60 mg / dlとし、DM魚310 mg / dlと。 </li></ol> 3。尾びれ再生研究<ol><li> 1.0から1.4で説明したように魚を麻酔。 </li><li>シャーレの蓋の上に魚を置き、無菌のサイズを使用して直線で尾びれを切断10解剖顕微鏡を介してフィンを見ながら第一lepidotrichia分岐点に近接したメス。 </li><li>魚が1.10のように回復するが、アッセイの回生成長期のため33℃で魚を配置することができます。これは、加速されたフィン回生分析のための確立された温度である。 </li><li>フィンは、しかし、我々は日常的にトランス節後24、28および72時間で回生成長を調べ、いつポスト切断で撮像することができる。 </li><li>前と同じように魚を麻酔（1.0から1.4を参照）、カメラ（私たちは、Q-イメージングカメラを搭載したニコンSMZ-1500を使用）を装備した解剖顕微鏡下で魚​​を置き、NISの要素ソフトウェアと1X倍率ですべてのフィン画像を収集。フィンは、それが完全に組織を伸ばしたり、損傷することなく拡張され、また、水滴があってはならないように、イメージングのために分散させる必要があります。一貫性を保つため、常に右側に背側に配置します。 </li><li>画像を印刷すると回生GROを測定イメージJソフトウェアおよび描画パッドの使用を使用してwthのエリア。新たな成長の全体の領域の周りにトレースして、面積を求める。各測定は5回行い、トレースの精度を確保するために平均化されるべきである。それは、これらが伸長面積を測定する際の誤差に寄与として使用されている画像は、影や水滴を持っていないことが重要です。 </li><li>背腹軸に沿って切断部位の長さを測定し、この測定で3.6で決定された領域を分割する。これは、異なるサイズの魚を直接比較することができます。 </li></ol> 4。メタボリックメモリ（MM）ゼブラフィッシュの発生<ol><li>セクション1で説明したように、DM魚とその適切なコントロールのグループを開始します。 </li><li> 21日目にグループのサブセットに対してFBGLを決定し、2つのサブグループにDMの魚を分ける。実験期間中のDMコントロールなどのグループのいずれかのために毎週のSTZ注射を続けています。第二のグループとincubat用STZ注射をやめる電子常温で魚。 14日以内にこれらのゼブラフィッシュは、膵臓の再生を通じて、正常な血中インスリンと血糖コントロールを復元することになります。これらの魚は現在、MM（メタボリックメモリの魚）と呼ばれています。 </li><li>一日で30ポスト薬物除去には、3.2で説明されたメソッドを使ってコントロールの尾鰭は、DMとMM魚を切断。 </li><li> 30日間フィンの再生のための通常の水の条件に魚を戻す。これは、私たちの用語、メタボリックメモリ組織の成長を可能にします。 </li><li>一日で60は30〜60日の期間に再生された組織内で第二切断を（3.2で説明）を実行すると尾鰭再生アッセイ（3.1から3.7） 図1を実行します 。 </li><li>組織を分離し、興味のある検定を実行します。プロトコルの概要については、 表1を参照してください。 </li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

糖尿病は、究極的にはすべての正常血糖値は薬剤介入にもかかわらず達成された後も持続し、多くの合併症につながる血管損傷につながる最初に高血糖と診断された代謝調節異常の病気、です。合併症のこの固執は代謝メモリと呼ばれ、いくつかの最近の研究では、エピジェネティックなメカニズムがこの現象に果たす役割を検討した。ここでは、急性の糖尿病やメタボリックメモリ（復元?...

糖尿病（DM）は、深刻かつ成長健康問題であることを特定の微小血管疾患（網膜症、腎症、神経障害、障害、創傷治癒）および大血管（心臓病や脳卒中）合併症1による平均寿命の低下をもたらす。一度開始されると、糖尿病の合併症は、血糖コントロールが2,3を達成した場合であっても中断せずに進行していき、この現象は、代謝メモリまたはレガシー効果と呼ばれています。この現象の存在は、 &quot;糖尿病コントロールと合併症試験（DCCT）&quot;として、1990年代初頭の間に臨床的に認識され、進行し、複数の追加の臨床試験4,5,6,7,8,9,10によってサポートされているので、 11,12,13,14。 DMの動物モデルは、糖尿病の合併症とメタボリックメモリの病態生理学に関連する発見のために重要であった。実際には、糖尿病合併症の永続性は第一糖尿病のイヌのモデルで記述されていました以来、 体外培養系および動物モデル15,16,17,18,19,20,21 でのさまざまな方法を使って実験的ないくつかの証拠によって支えられてきた網膜症。これらの研究は、はっきり標的臓器/細胞の永久的な異常（異常な遺伝子発現を含む）の初期の高血糖期間の結果ことを示していると機構的エピゲノムの関与を示唆している。 Epigenomesは、指定されたセル·タイプのすべてのクロマチン修飾から構成され、細胞のユニークな遺伝子発現プロファイルを担当している。染色体の変更は、開発、サポート細胞分化の間に動的であり、外部刺激に応答する、有糸分裂的に安定して22,23を継承され、病気24,25,26に変更することができます。これらのエピジェネティックなメカニズムは次のとおり翻訳後ヒストン修飾、octomersにおける非正規ヒストンバリアントの取り込み、DNAメチル化を介してクロマチンアクセスの変更、および遺伝子をノンコーディングRNAはマイクロ27,28,29,30を介して発現制御。要するに、エピジェネティックなプロセスは細胞/生物は速やかに環境刺激に31,32,33の変化に対応できるように、彼らはまた、これらの刺激が23,22を除去され、一度遭遇&quot;暗記&quot;する細胞の能力を付与する。エピジェネティックなプロセスから生じる変化した遺伝子発現プロファイルは、それらを開始し、細胞分裂を介して遺伝している信号（S）の非存在下で安定しているようなので、、彼らは、メタボリックメモリーを含む人間の病態の分子メカニズムの根底として大きな関心を集めている。高血糖によって誘発されるエピジェネティックな変化の茄多細胞（34,35,36,37,38で検討）の転写ネットワークの著しい持続的な変化を引き起こすという点で、他の疾患のDMとエピジェネ平行進化の文脈で出現している結果。 ゼブラフィッシュは、長い学生に最初のモデル生物であったdyは、過去15年間しかし開発を脊椎動物、ヒトの疾患の研究のためにこの生物を利用した指数関数的に成長を遂げている39。ヒト疾患のゼブラフィッシュモデルは遺伝性疾患や後天性疾患40,41,42を含む人間の病理学の広い範囲にまたがる確立されている。他の脊椎動物のモデル生物上ゼブラフィッシュの多くの利点は、高い繁殖力、短い世代時間、早期成人期を通じて透明性、減少住宅費と遺伝子操作のためのツールの配列が含まれています。また、脊椎動物およびハイスループット薬物スクリーニングを実行するための能力の間の遺伝的な経路および細胞生理の広範な保全のため、ゼブラフィッシュが正常医薬品発見のために使用されてきました。 我々は、糖尿病薬、ストレプトゾシンを使用して、I型糖尿病の成人のゼブラフィッシュモデルを開発した。私たちにはその糖尿病ゼブラフィッシュを表示するには、このモデルを特徴付けなかったtは唯一の既知のヒト二次的合併症を表示するが、それに加えて、高血糖環境の結果として障害四肢再生（尾鰭再生）を示す。加えて、我々は高血糖ゼブラフィッシュは、生理学的に正常な血糖状態となる内因性膵β細胞の再生のために薬物除去から2週間以内に正常な血糖に戻すことを報告している。この合併症を示す急性糖尿病の状態が続くとメタボリックメモリに影響されやすいようにしかし、これとは対照的に、これらの魚類における四肢再生が同程度に損なわれたまま。このモデルを生成するための主な原動力は、以前の高血糖環境のバックグラウンドノイズのない状態で代謝メモリ現象をサポートする有糸分裂的に安定したエピジェネティックな成分を研究するためのシステムを提供することでした。プロトコルの結論ではゼブラフィッシュおよびまたは選択組織がreseaに適した任意のアッセイによって処理することができ、ここで提供rchersが必要です。我々は、正常な代謝メモリ状態21に保持され高血糖によって誘発されるDNAメチル化のゲノムワイドな永続的な変更を識別するためにこのプロシージャを使用している。 我々は、I型糖尿病のこのゼブラフィッシュモデルはメタボリックメモリーを調べるため、他のモデルのシステムに比べていくつかの革新的な利点を持っていることを感じています。 1）私たちの研究のすべては 、in vivo で行うことができ、以前の高血糖魚は内因性インスリン産生の再生を通じて正常血糖値に戻すように、彼らは、外因性のインスリン注射を必要としません。したがって、これは外因性のインスリンを必要とする動物で発生する可能性が血糖コントロールの複雑スパイクや谷を回避します。 2）上記のように、前の糖尿病の状態（ すなわち、終末糖化産物および活性酸素種のマーカーの継続的な存在）から、背景刺激が除去されるため、1つは、純粋epigを調べることができますメタボリックメモリのenetic要因。それは糖尿病誘導からメタボリックメモリ検査まで約80日かかるので3）の実験を迅速に行うことができます。 4）尾鰭の再生は、実験的に非常に親しみやすいとツールの広大な配列があるどのやすい遺伝的および実験的な操作を可能にする。 5）尾鰭の再生は、メタボリックメモリーを評価するため、将来の創薬が可能になる非常にシンプルかつ定量方法を提供するものである。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ストレプトゾシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2フェノキシエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td>スカルペル（サイズ10） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> 27 1/2ゲージニードル付き½ccシリンジ、 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome gluc大証アッセイキット。 </td><td>バイオアッセイシステム</td><td> DIGL-100 </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> TMZ-1500 </td><td>任意の解剖顕微鏡で結構です。 </td></tr><tr><td>イメージング用カメラ</td><td>ニコン</td><td> Qイメージング</td><td>任意のカメラが適しています。 </td></tr><tr><td>画像Jソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td> NIHのイメージ</td><td></td></tr><tr><td> NISの要素</td><td>ニコン</td><td></td><td>任意のイメージングソフトウェアが適しています。 </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

糖尿病は、現在3.46億個人に影響を与え、これは2030年を400万人に増加すると予測されています。実験室および大規模臨床試験の両方からの証拠は、糖尿病合併症の進行が血糖コントロールは、薬学的に達成されていても代謝のメモリ現象を介して、妨げられないことを明らかにした。遺伝子発現を安定細胞および生物が迅速に環境刺激の変化に対応できるようにするだけでなく、これらは刺激が除去され、一度遭遇 &quot;記憶&quot;する細胞の能力を付与するだけでなく、エピジェネティックな変化によって変更することができます。このように、これらのメカニズムはメタボリックメモリ現象で果たす役割は、現在検討されている。 我々は最近、I型糖尿病のゼブラフィッシュモデルの開発を報告し、関連する変更を含む既知の二次的合併症を表示するだけでなく、その糖尿病のゼブラフィッシュを表示するには、このモデルを特徴づけてきた糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症や障害創傷治癒を持つだけでなく、障害のある尾鰭の再生を示す。このモデルでは、ゼブラフィッシュは、その損傷した膵臓を再生し、移植後のヒト患者で予想されるものと同様の正常血糖の状態を復元することが可能であるという点でユニークです。また、尾鰭の切断の複数のラウンドは、前糖尿病状態からの潜在的な複雑な要因なしで分離し 、in vivo系で純粋なエピジェネティックな効果の研究を可能にします。正常血糖値は、膵臓の再生後に達成されるが、フィンの再生と皮膚創傷治癒の糖尿病二次性合併症は無期限に存続します。障害フィン再生の場合には、この病態であっても娘フィン組織におけるフィンの再生の複数のラウンド後も保持されます。これらの観​​察結果は、メタボリックメモリ状態に存在する基礎エピジェネティックなプロセスを指す。ここで我々は正常の世代に必要な手法を提示魚の糖尿病とメタボリックメモリーグループをerate、このモデルの利点について説明します。

障害尾鰭再生：私の糖尿病だけでなく、ゼブラフィッシュ網膜症や腎症の既知の二次的合併症を表示するだけでなく、追加の合併症を呈するを入力します。この後の合併症は、高血糖期間の後、通常の血糖コントロールを復元した魚の代謝メモリが原因で解決しない。 図2A（コントロール）および図2B（メタボリックメモリ）72時間後に切断で捕獲された再生フィン?...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

メタボリックメモリは、糖尿病合併症が持続し、正常血糖値は、薬学的に達成された後でも妨げられることなく進行する現象である。ここで我々はそれがメタボリックメモリの分裂伝染エピジェネティックな部品の検査を可能にするという点でユニークである糖尿病のゼブラフィッシュモデルを記述<em生体内で&gt;</em&gt;。

糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

a-zebrafish-model-of-diabetes-mellitus-and-metabolic-memory

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

25.7K ビュー.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. メタボリックメモリは、糖尿病合併症が持続し、正常血糖値は、薬学的に達成された後でも妨げられることなく進行する現象である。ここで我々はそれがメタボリックメモリの分裂伝染エピジェネティックな部品の検査を可能にするという点でユニークである糖尿病のゼブラフィッシュモデルを記述。

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Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

発生生物学

The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or cognitive impairment. We have modified and developed a three-chamber choice cognitive task similar to that used with rodents for use with hyperglycemic zebrafish. The testing chamber consists of a centrally located starting chamber and two choice compartments on either side, with a shoal of conspecifics used as the reward. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task at least 8 weeks later. Our data indicate that zebrafish respond robustly to this reward, and we have identified cognitive deficits in hyperglycemic fish after 4 weeks of treatment. This behavioral assay may also be applicable to other studies related to cognition and memory.

We present a behavioral chamber designed to assess cognitive performance. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task 8 weeks later. We also show that hyperglycemic zebrafish have altered cognitive performance, indicating that this paradigm is applicable to studies assessing cognition and memory.

ゼブラフィッシュをモデルシステムとして用いた3部屋選択行動課題

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or ...

行動学

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

医学

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

生物学

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

ゼブラフィッシュで長期高血糖を生み出すグルコースの交互浸漬

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

神経科学

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

An Introduction to the Zebrafish: Danio rerio

Zebrafish (Danio rerio) are small freshwater fish that are used as model organisms for biomedical research. The many strengths of these fish include their high degree of genetic conservation with humans and their simple, inexpensive maintenance. Additionally, gene expression can be easily manipulated in zebrafish embryos, and their transparency allows for observation of developmental processes.
This overview video first introduces basic zebrafish biology, including their phylogeny, life cycle, and natural environment, before presenting the features that make them so useful in the lab. A brief history of zebrafish research is also provided through a review of major discoveries made in fish, ranging from the early establishment of methods for efficient genetic screening to the discovery of novel therapeutics for human diseases such as cancer. Finally, some of the many avenues of experimentation performed in zebrafish are discussed, including immunological and developmental studies.

Danio rerio Zebrafish as a Model Organism

ゼブラフィッシュ入門: Danio rerio

Zebrafish (Danio rerio) are small freshwater fish that are used as model organisms for biomedical research. The many strengths of these fish include their ...

Education

JoVE Science Education

基礎生物学

生物学Ⅱ：マウス、ゼブラフィッシュ、ヒヨコ

Zebrafish Maintenance and Husbandry

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and screening for novel therapeutics. Due to their small size, large numbers of zebrafish can be housed in the laboratory at low cost. Although zebrafish are relatively easy to maintain, special consideration must be given to both diet and water quality to in order to optimize fish health and reproductive success.
This video will provide an overview of zebrafish husbandry and maintenance in the lab. After a brief review of the natural zebrafish habitat, techniques essential to recreating this environment in the lab will be discussed, including key elements of fish facility water recirculation systems and the preparation of brine shrimp as part of the zebrafish diet. Additionally, the presentation will include information on how specific zebrafish strains are tracked in a laboratory setting, with specific reference to the collection of tail fin samples for DNA extraction and genotyping. Finally, experimental modifications of the zebrafish environment will be discussed as a means to further our understanding of these fish, and in turn, ourselves.

Maintenance and Husbandry of Danio rerio Zebrafish

ゼブラフィッシュのメンテナンスと飼育

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and screening for novel therapeutics. Due to ...

糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

要約

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この動画の章

ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

ゼブラフィッシュをモデルシステムとして用いた3部屋選択行動課題

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo β-Cell Function

魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイセクション

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

ゼブラフィッシュで長期高血糖を生み出すグルコースの交互浸漬

高スループット

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

ゼブラフィッシュ入門: Danio rerio

ゼブラフィッシュのメンテナンスと飼育

糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

要約

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ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

ゼブラフィッシュをモデルシステムとして用いた3部屋選択行動課題

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魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

ゼブラフィッシュで長期高血糖を生み出すグルコースの交互浸漬

高スループット

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

ゼブラフィッシュ入門: Danio rerio

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魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイセクション