Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio dalla Fondazione Famiglia Iacocca, Rosalind Franklin University di start-up dei fondi, e la National Institutes of Health di Grant DK092721 (a RVI). Gli autori desiderano ringraziare Nikki Intine di aiuto nella preparazione del manoscritto.

Tutte le procedure vengono eseguite seguendo le indicazioni riportate in &quot;Principi di cura degli animali da laboratorio&quot; (National Institutes of pubblicazione Sanità n. 85-23, riveduta 1985) e approvato Rosalind Franklin per la cura degli animali dell&#39;Università istituzionale e uso degli animali Comitato protocollo 08-19. Ci sono 2 sigle importanti che vengono utilizzati in questo manoscritto. 1) DM: si riferisce a pesci che si trovano in una acuta (300 mg / dl) stato iperglicemico e sono stati per almeno 3 settimane. 2) MM: si riferisce al pesce che sono stati 21 giorni (vedi protocollo) pesce DM e ha permesso di ripristinare il controllo glicemico attraverso la rigenerazione del pancreas. Questo viene raggiunto entro (14) giorni dalla rimozione del farmaco. I pesci sono considerati pesci MM da questo punto in avanti. E &#39;anche importante notare che il pesce che sono indicati come controllo vengono trattati nello stesso come pesci DM o MM in termini di numero di iniezioni (soluzione salina solo), i tempi di incubazione a temperature diverse e il numero ei tempidelle amputazioni della pinna caudale. 1. Generazione di Zebrafish con diabete mellito, Pesce DM <ol><li> Preparare sia di recupero e serbatoi d&#39;acqua anestetici. Il recupero è acqua pesci di acqua normale. Per l&#39;acqua anestetico sufficiente aggiungere 2-fenossietanolo in modo che un 1:1000 diluizione in pesci di acqua normale è raggiunto. </li><li> Preparare una soluzione di 0,3% (sotto cappa) di streptozocina (STZ) con l&#39;aggiunta di 6 mg di STZ a 2 ml di cloruro di sodio 0,09% e collocare immediatamente la soluzione su ghiaccio. Ciò fornirà soluzione iniettabile sufficiente per l&#39;iniezione di circa 20 pesci in 20 min. Se si supera il segno di 20 minuti, fermarsi, e fare una nuova soluzione STZ prima di procedere. In un altro soluzione aliquota tubo abbastanza salina per pesci di controllo. Una volta che il STZ viene solubilizzato tutti i passaggi successivi non richiedono l&#39;uso dei fumi cappa. </li><li> Riempire una siringa da cc ½ dotata di un ago calibro 27 1/2 con le soluzioni STZ o di controllo che garantiscano l&#39;assenza di bolle d&#39;aria intrappolate. </li><li> AnestesiaTize ogni pesce individualmente mettendo il pesce in acqua anestesia, e attendere che il loro movimento nuoto cessa (1-2 min). </li><li> Una volta brevemente anestetizzato luogo il pesce su un tovagliolo di carta per assorbire l&#39;acqua in eccesso, collocare il pesce in peso dell&#39;imbarcazione e misurare la massa del pesce. </li><li> Mettere il pesce su una superficie stabile (coperchio scatola Petri) per iniezione. </li><li> Iniettare la soluzione di controllo STZ o nella cavità peritoneale del pesce inserendo l&#39;ago passato lo smusso nella faccia posteriore del peritoneo ventrale. </li><li> 0,35 mg / g (350 mg / kg) di STZ dovrebbe essere consegnato a ciascun pesce e il volume della soluzione di 0,3% necessario può essere calcolato nel modo seguente. <ol class="lalpha"><li> Moltiplicare massa di pesce (g) da 0,35 a produrre la quantità di STZ in mg richiesto. </li><li> dividere il prodotto generato sopra del 3 per ottenere il volume della soluzione di 0,3% necessaria per iniezione in microlitri. Esempio: Per un pesce 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 microlitri. Lo stesso volume senza STZ sarebbe iniettato per un pesce controllo. Un foglio per volumi da iniettare per massa pesci dovrebbero essere generati e utilizzati per una rapida consultazione. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;iniezione mettere il pesce nel serbatoio dell&#39;acqua di recupero e il monitoraggio per l&#39;attività di nuotare normalmente. Una volta che questo è stato raggiunto il pesce viene trasferito in un serbatoio vita normale che viene mantenuta alla temperatura minore di 22 ° C - 24 ° C. Questa temperatura ridotta è critico per l&#39;induzione efficiente di iperglicemia (diabete mellito, DM). </li><li> Sebbene l&#39;iperglicemia viene rilevato entro 24 ore della prima iniezione, al fine di indurre uno stato di iperglicemia prolungata molto elevato il zebrafish richiedono una frequente fase di induzione iniezione seguita da iniezioni settimanali di manutenzione come mostrato di seguito. </li></ol> Settimana 1: 3 iniezioni (giorno 1, 3, 5), Settimana 2: 1 iniezione (giorno 12), Settimana 3: 1 iniezione (giorno 19), Settimana 4: (Giorno 21) Eseguiresaggio di interesse. A questo punto il pesce zebra sono considerati di essere stato in un prolungato stato di iperglicemia e di esporre le complicanze del diabete di retinopatia, nefropatia e la rigenerazione della pinna anche compromessa. Questi sono indicati come pesci DM. Inoltre, se si desidera il pesce può essere mantenuta allo stato iperglicemico con iniezioni settimanali di manutenzione. Circa il 5% la morte nel corso di questo processo dovrebbe essere previsto. 2. Il prelievo di sangue e digiuno livello di glucosio nel sangue (FBGL) Determinazione <ol><li> Ogni gruppo di pesci DM e controllo deve essere composto di pesce sufficiente per determinare con precisione la FBGL media del gruppo in quanto questo test richiede questi pesci per essere sacrificato. </li><li> Preparare una provetta PCR per ciascun campione di sangue contenente 5 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Per la raccolta del sangue, anestetizzare i pesci come sopra, togliere tutta l&#39;acqua, mettere il pesce su un vetrino da microscopio e con un bisturi, rimuovere la testa del pescealla base dell&#39;opercolo. </li><li> Raccogliere il sangue (fino a 2 microlitri) che viene rilasciato dal pesce sulla slitta e rapidamente aggiungere al 5 microlitri di soluzione salina normale pipettando su e giù per assicurarsi che il sangue non si intasa. Porre immediatamente il campione in ghiaccio. </li><li> Determinare il volume del campione di sangue misurando il volume totale del liquido (soluzione salina + sangue) e sottraendo il 5 microlitri di soluzione salina. </li><li> Trasferire 5 pl di sangue diluito da ogni provetta PCR in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e determinare la concentrazione di glucosio nel sangue con il QuantiChrome Assay Kit glucosio. Questo viene eseguito seguendo il protocollo del produttore senza eccezione. Risultati attesi: normale / controllo di pesce 60 mg / dl e DM pesce 310 mg / dl. </li></ol> 3. Pinna caudale Rigenerazione Studi <ol><li> Anestetizzare i pesci come descritto nella 1,0-1,4. </li><li> Mettete i pesci su un coperchio piastra di Petri e amputare la pinna caudale in linea retta utilizzando una dimensione sterile10 bisturi prossimale al primo punto lepidotrichia ramificazione durante la visualizzazione della pinna attraverso un microscopio da dissezione. </li><li> Permettere il pesce di recuperare in 1,10 ma posizionare il pesce a 33 ° C per la fase di crescita e la rigenerazione del dosaggio. Questa è una temperatura stabilita per l&#39;analisi accelerata rigenerazione pinna. </li><li> Le alette possono essere ripreso in qualsiasi momento dopo amputazione tuttavia abbiamo routinariamente esaminare la crescita e la rigenerazione a 24, 28 e 72 ore dopo trans-sezione. </li><li> Anestetizzare i pesci come prima (vedi 1,0-1,4), posizionare il pesce sotto un microscopio da dissezione dotato di una fotocamera (si usa una Nikon SMZ-1500 dotato di un Q-imaging telecamera) e raccogliere tutte le immagini finali con ingrandimento 1X con il software NIS elementi . La pinna deve essere diffuso per l&#39;imaging in modo che sia completamente esteso senza tirare o danneggiare il tessuto e deve essere esente da eventuali gocce d&#39;acqua. Per motivi di coerenza è necessario posizionare il lato dorsale a destra. </li><li> Stampa di immagini e misurare la GRO rigenerativaArea wth utilizzando software Image J e l&#39;uso di un foglio da disegno. Tracciare tutta la zona di nuova crescita e determinare l&#39;area. Ogni misurazione deve essere eseguita cinque volte e una media per garantire la precisione di tracciamento. È importante che le immagini utilizzate non hanno ombre o d&#39;acqua da questi errori nella misurazione della superficie outgrowth. </li><li> Misurare la lunghezza del sito amputazione lungo l&#39;asse dorso-ventrale e dividere la superficie determinata in 3,6 da questa misura. Questo permette pesci di diverse dimensioni per essere confrontati direttamente. </li></ol> 4. Generazione di memoria metabolica (MM) Zebrafish <ol><li> Avviare un gruppo di pesci DM e dei loro controlli appropriati come descritto al punto 1. </li><li> A 21 giorni per determinare la FBGL un sottoinsieme del gruppo e dividere il pesce DM in 2 sottogruppi. Continua settimanale STZ iniezioni per uno dei gruppi come controlli DM per la durata dell&#39;esperimento. Cessate iniezione STZ per il secondo gruppo e incubate il pesce a temperatura normale. Entro 14 giorni questi zebrafish ripristinerà il normale insulina nel sangue e il controllo del glucosio attraverso la rigenerazione del pancreas. Questi pesci sono ora chiamati MM (pesce memoria metabolica). </li><li> Al 30 ° giorno dopo la rimozione del farmaco amputare le pinne caudali di controllo, DM e MM pesce tramite il metodo descritto al punto 3.2. </li><li> Ritorno pesce alle condizioni dell&#39;acqua normali per la rigenerazione pinna per 30 giorni. Questo permette la crescita di ciò che chiamiamo, tessuto della memoria metabolica. </li><li> Al giorno 60 eseguire una seconda amputazione (come descritto in 3.2) all&#39;interno del tessuto che è stato rigenerato nel periodo 30-60 giorni ed eseguire la rigenerazione pinna caudale dosaggio (3,1-3,7) Figura 1. </li><li> Isolare tessuto ed eseguire analisi di interesse. Vedi Tabella 1 per una sintesi protocollo. </li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il diabete mellito è una malattia di alterazioni metaboliche, inizialmente diagnosticati come l&#39;iperglicemia, che in ultima analisi, i danni dei vasi sanguigni che porta a molte complicazioni che tutti persistono anche dopo euglicemia è ottenuta mediante intervento farmaceutico. Tale persistenza di complicazioni è chiamata memoria metabolica e diversi studi recenti hanno esaminato il ruolo che meccanismi epigenetici svolgere in questo fenomeno. Qui abbiamo descritto un protocollo che permette la generazione di en...

Il diabete mellito (DM) è un problema di salute grave e crescente che si traduce in riduzione dell&#39;aspettativa di vita a causa di malattia microvascolare specifica (retinopatia, nefropatia, neuropatia, la guarigione delle ferite) e macrovascolari (malattie cardiache e ictus) complicazioni 1. Una volta avviato, complicanze del diabete continuare a progredire senza interruzioni, anche quando il controllo glicemico si ottiene 2,3 e questo fenomeno è stato chiamato memoria metabolica o l&#39;effetto legacy. La presenza di questo fenomeno è stato riconosciuto clinicamente nei primi anni 1990 come &quot;The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)&quot; progredito e poiché è stata sostenuta da diversi studi clinici aggiuntivi 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Modelli animali di DM sono stati critici per le scoperte relative alla fisiopatologia delle complicanze del diabete e della memoria metabolica. Infatti, la persistenza di complicanze diabetiche è documentata in un modello canino di diabeticaretinopatia che da allora è stata sostenuta da diverse linee di evidenze sperimentali utilizzando una varietà di sistemi di coltura in vitro e su modelli animali 15,16,17,18,19,20,21. Questi studi mostrano chiaramente che un primo risultato iperglicemici periodo nelle anomalie permanenti (compresa l&#39;espressione genica aberranti) di organi bersaglio / cellule e meccanicamente suggerisce il coinvolgimento del epigenoma. Epigenomes costituiti da tutte le modificazioni della cromatina per un dato tipo di cellula e sono responsabili profilo unico gene di una cellula espressione. Le modifiche cromosomiche sono dinamiche durante lo sviluppo, differenziamento supporto cellulare, sono sensibili agli stimoli esterni, sono mitoticamente stabilmente ereditati 22,23 e può essere modificato in malattia 24,25,26. Questi meccanismi epigenetici includono: inviare traduzionali modificazioni degli istoni, non canonico inclusione variante dell&#39;istone in octomers, i cambiamenti di accesso cromatina tramite metilazione del DNA e genicontrollo dell&#39;espressione attraverso RNA non codificanti micro 27,28,29,30. Nel complesso, i processi epigenetici consentono alle cellule / organismi di rispondere rapidamente alle mutevoli stimoli ambientali 31,32,33, hanno anche la possibilità di conferire alla cellula di &quot;memorizzare&quot; questi incontri una volta lo stimolo viene rimosso 23,22. Pertanto, come alterati profili di espressione genica derivanti da processi epigenetici sono stabili in assenza di segnale (s) che li avviato e sono ereditarie attraverso la divisione cellulare, hanno guadagnato grande interesse come base dei meccanismi molecolari di patologie umane quali memoria metabolica. I risultati che stanno emergendo nel contesto di DM e dell&#39;epigenetica progressi paralleli in altre malattie in quanto una pletora di modifiche epigenetiche indotte da iperglicemia causare notevoli cambiamenti persistenti nelle reti trascrizionali di cellule (recensione in 34,35,36,37,38). Il pesce zebra è stato a lungo un organismo modello premier a study sviluppo dei vertebrati tuttavia negli ultimi 15 anni ha visto una crescita esponenziale nell&#39;utilizzo questo organismo per lo studio delle malattie umane. 39. Zebrafish modelli di malattie umane sono state stabilite coprono una vasta gamma di patologie umane quali i disordini genetici e malattie acquisite 40,41,42. I molti vantaggi del pesce zebra su altri organismi modello vertebrati comprendono alta fecondità, tempo di generazione breve, la trasparenza attraverso la prima età adulta, le spese di alloggio ridotti e una serie di strumenti per la manipolazione genetica. Inoltre, a causa della conservazione estesa di percorsi genetici e della fisiologia cellulare tra i vertebrati e la capacità di eseguire elevate proiezioni di droga di throughput, il pesce zebra è stato utilizzato con successo per la scoperta farmaceutica. Abbiamo sviluppato un modello di zebrafish adulto di tipo I diabete mellito con il farmaco diabetogeno, streptozocina. Abbiamo caratterizzato questo modello per dimostrare che zebrafish diabetico nont visualizzare solo le note complicazioni secondarie umani, ma in aggiunta, esporre rigenerazione compromissione dell&#39;arto (rigenerazione caudale) come conseguenza dell&#39;ambiente iperglicemici. Inoltre, abbiamo riportato che zebrafish iperglicemico tornare alla glicemia normale entro 2 settimane dalla rimozione del farmaco a causa di rigenerazione delle cellule beta pancreatiche endogene con conseguente stato glicemico fisiologicamente normale. Tuttavia, in contrasto, rigenerazione degli arti in questi pesci resta compromessa nella stessa misura come nello stato diabetico acuto indica tale complicanza persiste ed è suscettibile di memoria metabolica. L&#39;impulso principale per la generazione di questo modello è di fornire un sistema per studiare le componenti mitoticamente stabili epigenetici che supportano il fenomeno metabolico memoria in assenza del rumore di fondo dell&#39;ambiente iperglicemico precedente. Alla conclusione del protocollo fornito qui i tessuti e zebrafish o selettivi possono essere elaborati da qualsiasi saggio adatto al researchers bisogno. Abbiamo utilizzato con successo questa procedura per identificare i cambiamenti persistenti genoma nella metilazione del DNA indotte da iperglicemia che sono mantenuti nello stato di memoria metabolica 21. Riteniamo che questo modello zebrafish di tipo I diabete mellito ha diversi vantaggi rispetto ai sistemi innovativi altri modelli per l&#39;esame della memoria metabolica. 1) Tutti i nostri studi possono essere condotti in vivo e come il pesce iperglicemico precedente tornare euglicemia attraverso la rigenerazione della produzione di insulina endogena, non richiedono iniezioni di insulina esogena. Pertanto, questo evita i picchi e le valli complicanti controllo glicemico che possono verificarsi negli animali richiedono insulina esogena. 2) Come descritto sopra, la stimolazione sfondo dallo stato diabetico precedente (cioè la presenza continua di glicazione avanzata prodotti finali e specie di ossigeno reattive marcatori) sono eliminati e quindi si può esaminare l&#39;puramente epigfattori enetic della memoria metabolica. 3) Gli esperimenti possono essere eseguiti rapidamente come ci vogliono circa 80 giorni dalla induzione di diabete fino al momento dell&#39;analisi della memoria metabolica. 4) la rigenerazione pinna caudale è sperimentalmente molto accessibile e permette un facile manipolazione genetica e sperimentale per i quali ci sono una vasta gamma di strumenti. 5) rigenerazione Pinna caudale fornisce un metodo molto semplice e quantificabili per valutare la memoria metabolica e quindi permetterà la scoperta di farmaci futuro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Streptozocina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2 fenossietanolo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel (taglia 10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> Petri Piatti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> ½ cc siringa, con 27 1/2 gauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome Glucose test kit. </td><td> Sistemi di saggi biologici </td><td> Digl-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Microscopio </td><td> Nikon </td><td> TMZ-1500 </td><td> Ogni microscopio da dissezione va bene. </td></tr><tr><td> Telecamera per immagini </td><td> Nikon </td><td> Q di imaging </td><td> Ogni telecamera è adatta. </td></tr><tr><td> Immagine J software </td><td> National Institutes of Health </td><td> NIH Image </td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements </td><td> Nikon </td><td></td><td> Qualsiasi software di imaging è adatto. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

Il diabete mellito colpisce attualmente 346 milioni gli individui e questo si prevede un aumento a 400 milioni entro il 2030. Le prove sia dal laboratorio e ampi studi clinici scala ha rivelato che il progresso complicazioni diabetiche senza impedimenti attraverso il fenomeno della memoria metabolica, anche quando il controllo glicemico è farmaceuticamente raggiunto. L&#39;espressione genica può essere stabilmente alterata attraverso cambiamenti epigenetici che non solo permettono cellule e organismi di rispondere rapidamente alle mutevoli stimoli ambientali ma anche conferire la capacità della cella per &quot;memorizzare&quot; una volta che questi incontra lo stimolo viene rimosso. Come tale, i ruoli che questi meccanismi giocano nel fenomeno memoria metabolica sono attualmente allo studio. Abbiamo recentemente riportato lo sviluppo di un modello di zebrafish di tipo I diabete mellito e caratterizzato questo modello per dimostrare che zebrafish diabetico non solo visualizzare le note complicazioni secondarie, tra cui i cambiamenti associaticon la retinopatia diabetica, la nefropatia diabetica e la guarigione delle ferite, ma anche esporre compromessa la rigenerazione pinna caudale. Questo modello è unico in quanto il pesce zebra è in grado di rigenerare il suo pancreas danneggiato e ripristinare uno stato euglicemico simile a quello che ci si aspetterebbe in pazienti umani post-trapianto. Inoltre, vari cicli di amputazione caudale consentire la separazione e lo studio di puri effetti epigenetici in un sistema in vivo senza potenziali complicazioni dal precedente stato diabetico. Anche se euglicemia si ottiene seguendo la rigenerazione del pancreas, la complicazione diabetica secondaria di rigenerazione pinna e la guarigione delle ferite della pelle persiste indefinitamente. Nel caso di rigenerazione fin alterata, questa patologia viene mantenuta anche dopo vari cicli di rigenerazione fin nei tessuti viene indicata l&#39;esatta figlia. Queste osservazioni indicano un sottostante processo epigenetico esistente nello stato di memoria metabolica. Qui vi presentiamo i metodi necessari per successo generazionemoderata dei gruppi di memoria diabetici e metabolici di pesce e discutere i vantaggi di questo modello.

Diabetico di tipo I zebrafish non solo visualizzare le complicazioni note secondarie di retinopatia e nefropatia, ma anche, mostrano un ulteriore complicazione: ridotta rigenerazione pinna caudale. Questa complicanza in seguito persiste a causa della memoria metabolica nei pesci che hanno ripristinato il controllo normale di glucosio dopo un periodo di iperglicemia. In Figura 2A (controllo) e Figura 2B (memoria metabolica) immagini rappresentative di pinne rigenerazione catturate a 72 o...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Memoria metabolica è il fenomeno per cui complicanze diabetiche persistono e progredire senza ostacoli anche dopo euglicemia si ottiene farmaceutico. Qui si descrive un modello di diabete mellito zebrafish che è unica in quanto permette di esame dei componenti mitoticamente trasmissibili epigenetiche di memoria metabolica<em&gt; In vivo</em&gt;.

Un modello Zebrafish di diabete mellito e di memoria metabolica

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

25.7K Views.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Memoria metabolica è il fenomeno per cui complicanze diabetiche persistono e progredire senza ostacoli anche dopo euglicemia si ottiene farmaceutico. Qui si descrive un modello di diabete mellito zebrafish che è unica in quanto permette di esame dei componenti mitoticamente trasmissibili epigenetiche di memoria metabolica In vivo.

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Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

Modelli acuti e cronici di iperglicemia in Zebrafish: un metodo per valutare l&#39;impatto dell&#39;iperglicemia sulla neurogenesi e la biodistribuzione delle molecole radiomarcate

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or cognitive impairment. We have modified and developed a three-chamber choice cognitive task similar to that used with rodents for use with hyperglycemic zebrafish. The testing chamber consists of a centrally located starting chamber and two choice compartments on either side, with a shoal of conspecifics used as the reward. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task at least 8 weeks later. Our data indicate that zebrafish respond robustly to this reward, and we have identified cognitive deficits in hyperglycemic fish after 4 weeks of treatment. This behavioral assay may also be applicable to other studies related to cognition and memory.

We present a behavioral chamber designed to assess cognitive performance. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task 8 weeks later. We also show that hyperglycemic zebrafish have altered cognitive performance, indicating that this paradigm is applicable to studies assessing cognition and memory.

L'attività comportamentale di scelta a tre camere utilizzando Zebrafish come sistema modello

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or ...

Comportamento

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Medicina

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Biologia

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

Immersione alternativa nel glucosio per produrre iperglicemia prolungata in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Neuroscienze

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l&#39;imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

An Introduction to the Zebrafish: Danio rerio

Zebrafish (Danio rerio) are small freshwater fish that are used as model organisms for biomedical research. The many strengths of these fish include their high degree of genetic conservation with humans and their simple, inexpensive maintenance. Additionally, gene expression can be easily manipulated in zebrafish embryos, and their transparency allows for observation of developmental processes.
This overview video first introduces basic zebrafish biology, including their phylogeny, life cycle, and natural environment, before presenting the features that make them so useful in the lab. A brief history of zebrafish research is also provided through a review of major discoveries made in fish, ranging from the early establishment of methods for efficient genetic screening to the discovery of novel therapeutics for human diseases such as cancer. Finally, some of the many avenues of experimentation performed in zebrafish are discussed, including immunological and developmental studies.

Danio rerio Zebrafish as a Model Organism

Introduzione al pesce zebra: Danio rerio

Zebrafish (Danio rerio) are small freshwater fish that are used as model organisms for biomedical research. The many strengths of these fish include their ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia di base

Biologia II: topo, zebrafish e pollo

Zebrafish Maintenance and Husbandry

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and screening for novel therapeutics. Due to their small size, large numbers of zebrafish can be housed in the laboratory at low cost. Although zebrafish are relatively easy to maintain, special consideration must be given to both diet and water quality to in order to optimize fish health and reproductive success.
This video will provide an overview of zebrafish husbandry and maintenance in the lab. After a brief review of the natural zebrafish habitat, techniques essential to recreating this environment in the lab will be discussed, including key elements of fish facility water recirculation systems and the preparation of brine shrimp as part of the zebrafish diet. Additionally, the presentation will include information on how specific zebrafish strains are tracked in a laboratory setting, with specific reference to the collection of tail fin samples for DNA extraction and genotyping. Finally, experimental modifications of the zebrafish environment will be discussed as a means to further our understanding of these fish, and in turn, ourselves.

Maintenance and Husbandry of Danio rerio Zebrafish

Manutenzione e allevamento di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and screening for novel therapeutics. Due to ...

Un modello Zebrafish di diabete mellito e di memoria metabolica

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Modelli acuti e cronici di iperglicemia in Zebrafish: un metodo per valutare l'impatto dell'iperglicemia sulla neurogenesi e la biodistribuzione delle molecole radiomarcate

L'attività comportamentale di scelta a tre camere utilizzando Zebrafish come sistema modello

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo β-Cell Function

Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Immersione alternativa nel glucosio per produrre iperglicemia prolungata in Zebrafish

High Throughput

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l'imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

Introduzione al pesce zebra: Danio rerio

Manutenzione e allevamento di zebrafish