Name: high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
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The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

これらのプロトコルは、科学施設内動物管理使用委員会のためのカーネギー研究所（プロトコル番号139）によって承認されています。 1.動物の準備<ol><li> 10時間明：暗サイクル14時間で28℃で大人と幼虫を維持します。シェル無料アルテミア （デカプセル化、非ハッチング、14 DPFで開始）と商用マイクロペレット1日2回大人フィード。 </li><li>これらのプロトコルは、ABの背景の自然産卵により収集6-7 DPFの幼虫の使用に最適化されています。プロトコルは、他の年齢や背景の幼虫のために改変することができます。前6 DPFに外因性の食べ物を提供しないでください。 </li><li> （ミリリットルは、EMは100あたり4 mg / mlでトリカインの4.2ミリリットル）を室温（RT）で胚のメディア（EM）にトリカインで幼虫を麻酔します。 </li></ol>脂質の豊富な卵黄フィードの調製<ol><li>鶏の卵黄を準備し、格納します。 12鶏卵の卵黄と白を分離します。 1.5に卵黄、アリコート1ミリリットルをプールmlチューブ、および1年のCまで-80℃で保存してください（12黄身は〜80アリコートを行います）。白人のプール、店舗、および脂質に乏しい、タンパク質が豊富な飼料として使用します。 </li><li>所望であれば、卵黄飼料に添加される蛍光脂質類似体（複数可）を準備します。 <ol><li>製造元の指示に従って、不透明なガラス管に、アリコート（次の注意溶剤を議論を参照してください）/μlの0.1μgので100％エタノールまたは100％クロロホルムで購入し、粉末状の蛍光脂質類似体をサスペンドパラフィルムで密封し、そして店。有機溶媒の急速な蒸発に長期保存のために〜400μlのより少ない分量のボリュームを使用しないでください。 注：脂質類似体をエタノール中に懸濁されている場合、それはクロロホルムよりN 2下でより速く乾燥するので、脂質類似体の大ボリュームが使用されます。脂質アナログをエタノールに懸濁された場合には、ステップ2.2.4でリポソームフィードに追加する前に乾燥させ、再懸濁する必要はありませんが、全体のエタノール濃度が0を超えてはなりません。リポソーム飼料中1％エタノールの潜在的に交絡生理学的効果を回避します。 </li><li>蛍光脂肪酸類似体の場合：EMで20ミリリットルの5％卵黄乳剤の総容量を準備します。それから、ライブ共焦点イメージングおよび食物摂取アッセイまたはを1μg/ mlの6.4μM4,4-ジフルオロ-4-ボラ- 3A、4a-ジアザ-s-インダセン（BODIPY C 16）の最終濃度で5ミリリットルのアリコートを調製実体顕微鏡イメージングのためのBODIPY C 12。 1.5ミリリットルのプラスチックチューブに蛍光脂質類似体の所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。 </li><li>すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペットで5μlの100％エタノール中に再懸濁は、95μlのEMを追加し、よく混ぜます。 注：混合物が均質に表示されます。着色された脂質は、チューブの側面に残るか、液体が塊状の表示された場合、脂質は完全に可溶化し、より多くのエタノールを必要としていません。あちこちにチューブを守ります氷の上メートルの光とストア。 </li><li>蛍光コレステロールアナログの場合：ライブイメージング研究のための5ミリリットル百分の0.5から5卵黄エマルジョン中2.4 / mlのコレステロールの最終濃度を準備します。 1.5mL容のプラスチックチューブにコレステロールの所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。 </li><li>すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペッティングし、精製し、H 2 O中にRTの1％脂肪酸フリーBSAの85μlのと混合することによって、RTの100％エタノール15μlの中で再懸濁光からチューブを保護し、氷上で保存します。 </li></ol></li><li>卵黄リポソームフィードを準備します。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブにEMに卵黄の解凍アリコートを追加します。ボルテックス1-2分間希釈した卵黄の混合物;混合物は、均質なエマルションであることが表示されます。 </li><li>タンパク質のコングロマリットを削除し、新しい、新鮮な50mlコニカルチューブに収集するために、細かいメッシュストレーナーを通して混合物を注ぎます。 </li><li>パルスソニカリポソームを作成するために、RTで：;四分の一インチテーパーマイクロチップ（6 W出力強度5倍（上の5×1秒、1秒オフ）が5月10日各セット間の秒の一時停止）と卵の混合物TE。超音波処理器の電源設定は、機器に依存しているため、各楽器やマイクロチップのための最適化を必要とします。 注：継続的に使用するまで均質性を維持するために、RTでリポソーム混合物を揺すります。 </li></ol></li><li>必要に応じて、卵黄リポソームに蛍光脂質類似体を追加します。すぐに超音波処理した後、リポソームに組み込む30秒間高速でリポソーム混合渦に準備脂質をピペット。ホイルでチューブを包むことにより、光から混合物を保護し、室温で揺れ続けます。 </li></ol> 3.摂食パラダイム<ol><li>給餌のために幼虫を準備します。 <ol><li>摂食を妨げることが明らかな形態学的欠陥のための飼料、画面の幼虫を開始する前に。 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿または6または12ウェルのPLAへの転送の幼虫TES、最小限にEMを削減し、準備されたリポソーム溶液5mlで置き換えます。 </li><li>必要に応じて、5ミリリットルEMに無給電制御の幼虫を転送および/または5ミリリットル5％卵白EMおよび並列に扱います。 </li></ol></li><li>ゆっくり蛍光脂質類似体が存在する場合、光から遮蔽するために継続しながら、食物摂取を奨励するために、フィードを通じてインキュベートロッカー内の幼虫（30 rpmで29-31°C）を揺すります。幼虫は、光にさらされる必要がある場合は、着色ガラスインキュベーターカバーで露出を最小限に抑えることができます。 </li><li>給餌期間の終了時に、EMで3回、自由に泳ぐ幼虫をすすぎます。 注：幼虫は、フィード中の任意の時点でリポソームを消費し始めることができます。それは幼虫が同時に供給開始することが重要である場合には、食物摂取のための画面送りの1時間後（3.4を参照）、フィードを完了するために、卵黄エマルジョンへの給電を開始している唯一の幼虫を返します。 </li><li>少数EAない可能性食物摂取のために、この時点で幼虫を選別トン（一般〜0から5パーセント）。彼らが供給されているかどうかを判断するために麻酔またはわずかに氷の上の金属ブロック上で冷却された幼虫の腸を調べます。リポソームを消費した幼虫は暗く腸（ 図1）を持つことになります。 </li><li>すぐに食物摂取のための画像やプロセスの幼虫。代わりに、新鮮なEMにおける場所の幼虫および代謝処理が発生することを可能にするために28℃でインキュベートします。 </li></ol>ライブイメージング用4.取付幼虫<ol><li>マウントメディアを準備します。 <ol><li> 3％メチルセルロースの場合：-20°Cで年間の沸点近くEM、渦、4°Cで2〜3日間完全に溶解するまで室温でロック、店舗の25ミリリットルに0.75グラムのメチルセルロースを追加します。 4℃での凍結および解凍の繰り返しサイクルは、気泡を除去します。幼虫を搭載しながら、氷上で3％のメチルセルロースを保管してください。 </li><li> 1.2％の低マウントアガロースの場合：25 mLのEMにアガロース低溶融、沸騰させることによって溶解し、2ミリリットルのトンへの一定分量の0.3グラムを追加ubes、およびヒートブロック上で26から28℃に維持します。未使用のアリコートを室温で保存するか、または-20℃と使用時に再び煮沸することができます。アガロースは幼虫にさらすか、加熱過剰とすることができる前に処理するのに十分クールであることを確認してください。 </li></ol></li><li>低倍率、中スループットライブイメージングのために、氷の上の金属ブロックに組織上のスライドガラスを配置し、スライドを冷却するのを待ちます。フィッシングラインの火かき棒を使用して、3％メチルセルロースに幼虫を転送する、スライド上に（氷上で4℃に維持されている）、3％メチルセルロースの寛大な量を適用するに接着（0.41ミリメートルの直径釣り糸ガラス毛細管の端）メチルセルロースが希釈されないように（過剰EMドレイン）、必要に応じて幼虫を配置するための婚約を作成します。 </li><li>直立オイル出現を目的とした短期（&lt;20分）、高倍率のライブイメージングのため、希薄に法カバーガラスで幼虫をマウントします。 <ol><li>にシアノアクリレートベースの接着剤（スーパーグルー）を使用しますスライドガラスの一端にAA 22ミリメートル×30ミリメートルカバースリップを添付します。カバーガラスに隣接してスライド上の3％メチルセルロースの細い線を入れて、広い口径パスツールピペットを用いてスライドに幼虫を転送するためにポーカーを使用してください。それはメチルセルロースを希釈しないように余分なEMを削除します。 </li><li>カバースリップの隣に自分の頭でポーカーを使用して、そっとその両側にメチルセルロースで幼虫を配置（アップ肝臓の複数の画像を左、右の画像に胆嚢をアップ側）。 </li><li>優しく第二カバーガラスのコーナーとのスポット瞬間接着剤は、幼虫をブリッジ、取り付けられたカバースリップ上にカバースリップ、スライド上の他の一端を配置します。幼虫は無傷のままであるように、このステップの間、またはイメージングしながら目的で、過剰な圧力をかけないように注意してください。 </li></ol></li><li>直立浸対物レンズとの長期、高倍率のイメージングでは、アガロースで幼虫をマウントします。転送アガロースその後、1.2％の低融点の小アリコートに幼虫を追加します。シャーレにアガロースの小容積の幼虫。 <ol><li>迅速アガロースが固化する前に、ポーカーで幼虫を置きます。アガロースは2-3分間乾燥し、乾燥からそれを防ぐために、新鮮なEMと完全にアガロースをカバーすることができます。 </li></ol></li><li>長期的には、反転を目的とした高倍率のイメージングは​​、アガロースでガラスボトムディッシュに幼虫をマウントします。 <ol><li>氷の上の金属ブロックを冷却します。過冷却と幼虫の凍結を防止するために組織によって分離された金属ブロック上に皿を置きます。皿に幼虫を移し、組織で吸上により、EMを削除します。 </li><li>幼虫の上に28°C低融点アガロース（1.2％）の低下を置き、すぐにポーカー（ダウン最高の画像を左側肝臓、ダウン胆嚢像に右側）と位置付けます。寒ブロックから皿を外し、2-3分間乾燥させ、そしてアガロースをカバーするために、新鮮なEMの十分なボリュームを追加（〜2〜5ミリリットル）。 </li></ol></li></ol> 5.食物摂取検定<ol><li> 6.4μMBODIPY C 16を含む卵黄リポソームフィードの終わりには、EMを取り外し、プラスチック1.5または2ミリリットルチューブに10洗浄幼虫の最小値をプールし、凍結スナップ。サンプルは、数ヶ月間、光から保護し、-80℃で保存してもよいです。 注：可能な場合は、複数の複製を収集します。バックグラウンド脂質蛍光（同クラッチから理想的に幼虫が使用されている）のために正規化するために、この段階で未吸血幼虫を収集することが重要です。 </li><li>修正されたブライ・ダイアーの脂質抽出3,21を実行します 。 <ol><li> （代替的に精製されたH 2 Oを使用することができる）、氷上でサンプルに100μlの均質化緩衝液（20mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA）を加えます。マイクロチップ超音波処理装置（：1秒間オフに1秒5秒の合計）と氷上でホモジナイズします。その幼虫を確認し、完全に均質化されています。ない場合は、繰り返します。 13 mlの使い捨てガラス培養チューブに移す（他のガラス管を使用してもよいです）。 注：クロロホルムは危険です。後続のすべての脂質の元を実行します化学フード内で室温で牽引段階。 </li><li> 2（クロロホルム：メタノール）を使用均質化緩衝液の各100μlのために、1の375μlを添加します。ボルテックス30-60秒、10分間インキュベート、使用100μlの均質化緩衝液、渦30秒あたりのクロロホルム125μlを添加します。 </li><li> （光から保護2000のx グラム 、5分、RT）を用い、100μlの均質化緩衝液、ボルテックス30秒、および遠心あたり200 mMトリスpH7.5の125μlのを追加します。慎重に遠心分離機からサンプルを削除します。上部相は水性である幼虫破片のインターフェースを、下部有機相（脂質を含有する）：これらは2相に分離されます。 </li><li>きれいなガラスピペットを用いて底部、有機相を回収し、清潔な13 mLのガラス管にそれを転送します。 注：界面における水相と幼虫破片を避けるように注意してください。汚染が発生した場合には、遠心分離工程および再収集を繰り返します。上部の水相を捨てます。削除して、これを破棄するために役立つかもしれません有機相を収集する前に相。サンプルは、最大1ヶ月間-80℃で保存することができます。 </li><li>光から保護しながら、真空下での有機相（0.12気圧）を乾燥させます。それは、脂質溶解性を低下させるように、液体が蒸発した後の試料を乾燥し続けないでください。 1（クロロホルム：メタノール）2に脂質を再懸濁し、氷上で保存します。クロロホルムの最適量：メタノール溶液を使用する検出方法に依存します。低起動し、必要に応じて希釈するために続けています。一般的なガイドラインは、10プールされた幼虫のために10μLを使用することです。 </li></ol></li><li>チャネリングTLCプレート上に等間隔でサンプル全体のボリュームを発見し、日常的に生体分子イメージングのために使用されるレーザスキャナ（ 例えば 、蛍光プレートリーダー）でプレートをスキャンします。 510から665ナノメートルから500〜650 nmおよび発光極大からの励起極大を有する物質のリストに含まれる蛍光脂質類縁体は、520 nmで488 nmのレーザー発光コレクションでの使用。 <ol><li>イメージングソフトウェアで各スポットの全蛍光を定量化します。 注意：自然対になった、未吸血幼虫サンプルの蛍光を差し引くことにより、バックグラウンド脂質蛍光を発生するための正しいです。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここに記載された技術は、研究者は、脂質の豊富な飼料と幼虫のゼブラフィッシュを扱うライブ幼虫に食餌脂質処理を可視化し、幼虫の食物摂取量を定量化することができます。成功を確実にするために、特別な注意は、いくつかの重要なステップに与えられるべきです。コマーシャル鶏の卵は異なります。潜在的な変動を最小限に抑えるために、我々は、オメガ3脂肪酸について濃縮されて...

腸は食物脂質の処理を調節する機構は、肝臓は、複合脂質の合成およびリポタンパク質代謝を制御し、これらの器官は、食物摂取量を制御するために、中枢神経系でどのように機能するか完全には理解されています。これは、肥満、心臓血管疾患、糖尿病、および非アルコール性脂肪肝疾患の現在の流行に照らして、この生物学を解明するために、生物医学的関心です。細胞培養およびマウスにおける研究食物中の脂肪と病気の間の機械的な関係の理解の大部分を提供している、およびゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、この作業を補完する理想的なモデルとして浮上しています。 ゼブラフィッシュは、急速に発展、高等脊椎動物1,2と同様の胃腸（GI）器官、脂質代謝、およびリポタンパク質の輸送があり、遺伝的に扱いやすいです。幼虫のゼブラフィッシュの光学的透明性は、in vivo試験で particulaを容易にGI系の研究のためのRの利点その細胞外環境（ すなわち 、胆汁、微生物、内分泌シグナリングは）ex vivoでのモデル化することは事実上不可能であるように。とゼブラフィッシュ幼生のイメージングを生きるために、遺伝的扱いやすさとconducivenessを組み合わせた研究によれば、体食物の操作（高脂肪3,4、 -コレステロール5、および-炭水化物ダイエット6,7）、および心血管疾患8の様々なモデル、糖尿病9,10、脂肪肝11-13、および肥満14-16、代謝洞察のホストを提供するために浮上しています。 代謝研究に幼虫のゼブラフィッシュの移行の重要な側面は、ゼブラフィッシュとゼブラフィッシュの独自の強みを活用した新規アッセイの開発に他のモデル動物で開発された技術の最適化です。このプロトコルは、技術がLIPI幼虫のゼブラフィッシュを養うために開発され、最適化された提示しますDが豊富な食事は、細胞内の解像度に全身から食餌脂質処理を可視化し、食物摂取量を測定します。それが脂肪やコレステロールの高レベルが含まれているとして、鶏の卵黄を〜（脂質が構成する脂質の豊富な食事を構成するために〜5％がコレステロールであるそのうちの鶏の卵黄の58％を、選ばれた、60％はトリグリセリドであり、35％がリン脂質であります）。ゼブラフィッシュダイエットと摂食連隊は、ラボ17全体で標準化されていないとして、鶏の卵黄は、典型的な市販のゼブラフィッシュマイクロペレット食品（〜15％の脂質）、それは特定の脂肪酸種の既知の割合で標準化された飼料であるという利点よりも多くの脂肪を提供します。また、卵黄に設けられた蛍光脂質類似食物脂質18の輸送および蓄積を可視化、脂質滴を含む画像の細胞成分複合脂質に両方としてバイタル色素3および共有結合の取り込みを介して作用することにより、薄層クロマトグラフィー（TLC）を介して代謝を調査19 </sup&gt;高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（SAF未発表データ）、および総食物摂取量20についての定量的アッセイを提供します。

<table><tbody><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anesthesia for larval zebrafish</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids</td></tr><tr><td>Ultrasonic processor 3000 sonicator</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Sonabox acoustic enclosure</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; tapered microtip</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>To make egg yolk liposomes</td></tr><tr><td>Amber vials (4 ml, glass)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&amp;nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Incubated shaker for feeds</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td></tr><tr><td>TopFluor cholesterol&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>For TopFluor cholesterol solubilization</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Mounting media for live larval imaging; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR microscope slides&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Coverslips&amp;nbsp;</td><td>Cover Glass</td><td>12-544A</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Mounting larvae for live imaging</td></tr><tr><td>FluoroDish (glass bottom dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscope for high magnification live imaging</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Microscope for low magnification live imaging</td></tr><tr><td>Glass culture tubes&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&amp;nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Lipid extraction</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Fluorescent plate reader for food intake assay</td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analysis of food intake assay</td></tr><tr><td>5 3/4&amp;rsquo; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Transfering larvae</td></tr></tbody></table>

high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

29-31℃でロッカーに供給すると、健康な幼虫（≥95％）の大半は、1時間以内に食べるようになります。卵黄エマルジョンを消費すると、幼虫の腸は、カラーで暗くなります。非常に暗い腸2時間（ 図1）で観察することができます。幼虫が未吸血されているか、または供給するために失敗した場合、腸は透明なまま。幼虫供給卵白展示色で暗くしない膨張した腸管腔。 <p class="jo...

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High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K ビュー.  Carnegie Institution for Science. Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques. 

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Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

環境学

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

がん研究

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

神経科学

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

発生生物学

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

生物学

バーチャルリアリティインタラクションによるゼブラフィッシュ心収縮の解析

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

著者スポットライト:Zebrafishの高分解能4Dライトシートイメージングとバーチャルリアリティによる心機能のシングルセル解析

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

生物工学

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

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稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

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電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

高スループット