ペース法が開発され、長年にわたってデュプリー グループ (ケンブリッジ、イギリス) の様々 なメンバーによって最適化され、我々 はすべての彼らの貢献を感謝します。支えられて米国エネルギー省、科学局、オフィスの生物学的、環境調査、契約・ デ ・ AC02 05CH11231 ローレンスの間を通して DOE の共同バイオ研究所 (http://www.jbei.org) の一部として資金が供給されたこの作品バークレー国立研究所と米国エネルギー省。我々 もありがとうテア ピックと Vy Ngo csla9サンプルの準備のヘルプ。

1 です。 植物材料の収穫 <ol><li>新鮮な植物材料 (~ 20 mg) を収穫しすぐに 96% (v/v) エタノールで水没と 70 の ° C で 30 分間インキュベート; 任意の細胞壁分解酵素の存在を非アクティブ化します。乾燥した材料、手順 2 で開始します 。
	注意: エタノールは可燃性 。
	注: 単一の幹またはロゼット葉は分析のための十分な材料を提供します。ただし、エラーの少ない発生組織の大きい量をプールし、これは重量を量りやすく処理を分析する場合</li>。
	<li>は慎重に組織型を記録し、両方によって異なります多糖類の構造と発達段階。たとえば、シロイヌナズナ (ここで使用されて) とステージ ボイズ ら の方法に従って組織 15 注: このプロトコル使用している花房内の茎の下半分、最初の silique は完全に細長い黄変しないが、</li></ol>。
 2 準備のアルコール不溶性残渣 (空気) <ol><li>モーティマー ら の方法に従って、空気の準備。 9 またはデンプンおよびショ糖などの糖を欠けている粉を作り出すために、別の同じような方法です</li>。
</ol> 3。早かったと空気前処理 注: 正確な各サンプルは、(a) (b) によりキチンオリゴ糖の平均サイズと材料に関心の多糖類の豊かさに依存するために必要な空気量GH。オリゴ糖の数は実験の感度を決定しますので、メソッドは単一蛍光分子をそれぞれオリゴ糖の還元末端に追加します。ガイドラインとしてシロイヌナズナ幹 GH5 ・ GH26 (前述)、消化でグルコマンナン 500 μ g お勧め 11 GH11 と消化されるシロイヌナズナ幹のキシラン、100 μ g モーティマーのように勧めに対し &#39; s 研究 3。 <ol><li>15 mL 遠心チューブに空気 (10-15 mg) の重量を量ると H 2 O 最終濃度 2 mg/mL のを追加します。渦もサスペンションを達成するために。これが問題になる場合は、このプロセスを支援するためにガラスのホモジナイザーを使用して。</li>。
	<li>および microfuge に分注 500 μ g チューブ。真空遠心分離機を使用して因数を乾燥 (材料の表 を参照してください) 一晩 30 ° C</li>
	<li>1 M NaOH で前治療空気 (20 μ L) 部屋の温度で 1 時間これは多糖類を脱アセチルし、うねりセルロースミクロフィブリル、バイオマス構造を崩すことや GH アクセス 。
	注: この手順は、精製された多糖類をスキップできます。注意 &#8211; 強い酸/塩基。
	<ol><li>No 酵素航空管制の因数が含まれます (手順 4.1 を除く、すべてのサンプルと同じ扱われますは除外)。</li>。
	</ol></li> <li>追加 200 μ H 2 O と 20 μ L 1 M 塩酸を中和します。テストの pH は 6 ~ 7 を 1 μ L を採取して pH インジケーター短冊にスポッティングします</li>。
	<li>追加 50 μ L 1 M アンモニウム酢酸緩衝液、pH 6.0 (またはいずれかの pH は GHs における使用のために適切) と H 2 O 500 μ L の総ボリュームを与えるにします 。
	注: 乾燥時にのこしたこと、およびサンプルを追加塩を加えないので、酢酸アンモニウムが使用されます。塩の過剰はペースのゲルの悪いバンド形と解像度につながることができます</li>。
</ol> 4。糖加水分解酵素 (GHs) が付いている空気の加水分解 注: の説明で述べたように、GHs の純度が重要です。のみを使用してクローンを表明、アフィニ ティー精製酵素です。メーカーから各ロットの受領、一晩 GH の量を増やすことによる基板 (例えば 500 μ g 空気) の定義の因数分解 (例えば 0.5、1、2、5、10、15、20 μ L) (3 単位/μ L)。GH の過剰がある、ペース指紋が同一になります。酵素の過剰は、それは加水分解反応の終点が近づいていることを特定する必要がありますので、再現性のある結果を提供する必要です。
<ol><li>追加ステップ 3.5 からバッファーに空気採取するマンナナーゼ (GH26 GH5 11) として正の前もって決定された量 (上で見なさい) コントロール (こんにゃくグルコマンナンの 30 μ g)、および no AIR 負コントロール (酵素ミックス、空管)。渦と簡単に管の下で反応混合物を収集するために、スピンします</li>。
	<li>穏やかな撹拌 (~ 100 rpm) で 37 ° C (または選択の GH の適切な温度) で一晩インキュベートします</li>。
	<li>は、95 ° C で 20 分間のインキュベーションで反応を停止 
	注: キャップの閉鎖は、フリップ トップ microfuge の管を密封する使用できます。
	<ol><li>最大速度でベンチ トップおよび microfuge を使用して、10 分間遠心し、上清を保持します</li>。
	</ol></li> <li>250 μ L H 2 O は、上記のように、遠心分離機でペレットを再懸濁します、上澄みを保持します</li>。
	<li>両方の培養上清を組み合わせるし、真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 3 h または加熱しなくても一晩).</li>
</ol> 5。オリゴ糖基準の作成 H 2 O mannopentaose (男 5)、mannotetraose (4) mannotriose (3) mannobiose (2) マンノース (男) の <ol><li>準備 1 mM 在庫ソリューション、mannohexaose (男 6)、すべて β、1-4 リンクします。因数と-20 ° c まで必要なストア</li>。
	<li>1 μ L (標準的な S1)、2 μ L (S2) を組み合わせることにより男の濃度の異なる 3 1 6 混合物を準備またはすべての六つの 5 μ L (S3).</li>
	<li>真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 1 h).</li>
</ol> 6。オリゴ糖 Derivitization <ol><li>H 2 O で 0.2 M アリ (8-Aminonaphthalene-1,3,6-トリスルホン酸) の貯蔵液の準備: 酢酸 17:3。60 ° C を完全に固体を溶解する温かみのある在庫があります。-20 ° c、2-3 か月の光から保護されたストア</li>。
	<li>は、DMSO 中 2-ピコリン ボラン (2 PB) の 0.2 M ストック溶液を調製します。吸湿性がきわめて高い、だからすぐに DMSO で受信時にすべての粉体を再懸濁します。因数と 1-2 年の-20 ° C でストア。必要 (2 週間とし、破棄のための 4 ° C でストア) として因数を解凍</li>。
	<li>H 2 O の誘導体化バッファーを準備: 酢酸酸: DMSO 17:3:20 します</li>。
	それぞれのサンプル、アリ、誘導体化バッファーの 2 PB、10 μ L の 5 μ L の 5 μ L を追加するには、<li>。チューブの底に収集するために簡単にスピン渦徹底的にして再度簡潔に回転し。反応の説明の 図 1 を参照してください</li>。
	<li>37 ° C、光から保護で一晩加温サンプル</li>。
	<li>真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 2 h).</li>
	再懸濁します <li>サンプルと 100 μ L の 3 M の尿素の標準。-20 ° c、必要になるまでの光から保護されたストア</li>。
</ol> 7。ペースの作製ゲル 注: ゲル鋳造装置のアセンブリはブランドによって異なります。ここでは、私たち use 垂直電気泳動システム スペーサー 18 × 24 cm ガラス板と 1.5 mm 装備 (材料の表 を参照してください).
<ol><li>、メーカーごとのゲル鋳造装置を組み立てる &#39; s 指示します</li>。
	次のように <li>を 10 倍ペース バッファー (1 M トリス-ホウ酸、pH 8.2): H 2 O と解散するミックスの ~ 400 mL にトリス ベースの 121.14 g を追加。固体ホウ素酸 (約 60 g) の添加により 8.2 に pH を調整し、最大 1 ボリューム ・ l ・</li>
	<li>H 2 o. 因数で 10% (w/v) アンモニウムの過硫酸 (APS) 株式を作ると-20 ° C 雪解け因数で一度保存、4 ° C で保存し、2 週間後破棄します</li>。
	<li>を作るし、解決のゲルを注ぎなさい。上記の機器を 50 mL 1 ゲルを同一視します。50 mL の遠心管 H 2 O (20.2 mL) 5 mL 10 倍ペース バッファー 24.6 mL 40% アクリルアミド/ビス-アクリルアミド (29:1 acrylamide:Bis) をミックスします。(注意: 有毒).
	<ol><li>は APS の 200 μ L と N, N, N, N´-テトラメチル-エチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L を追加。(気泡を導入することを避けるため) にミックスを軽く反転します。血清学的を使用してゲルまたは他大量ピペット、〜 4 cm ガラス板の上端を注ぐ。気泡ゲルの中に閉じ込め取得の可能性に注意を払います。かどうか彼らは、注いで、停止、チルト/タップそれらを解放するゲル</li>。
	</ol></li> <li>イソプロパノール (注意 : 可燃性) や、慎重に、H 2 O を許可する (20-30 分) を重合し、最上位のレイヤーを離れて注ぎゲル ゲルをオーバーレイします。あぶらとり紙を使用して余分な液体洗浄 H 2 o ・ ドライで 2 倍、イソプロパノールを使用した場合です</li>。
	<li>を作るし、スタッキングのゲルを注ぎなさい。ミックス 6.8 mL H 2 O、1 mL 10 倍ペース バッファー、2.8 mL アクリルアミド/ビス-アクリルアミド (注意: 毒性)、80 μ L の AP と 15 mL 遠心管中の TEMED 8 μ L。ミックスする反転し、重合解決のゲルの上にオーバーレイします。櫛歯の下でトラップ空気の泡を避け、櫛をそっと挿入します</li>。
	(20-30 分) を重合する <li>許可するゲルは湿った組織で、プラスチック製のラップをラップし、必要になるまで 4 ° C で保存します。場所に櫛を使用してストア 。
	注: ゲル ペースに対して格納できる最大 2 週間 (1 週間以内が理想的です) が、湿った、保管される場合</li>。
</ol> 8。ペースを実行しているゲル <ol><li>永久的なマーカーを使用して、読み込み順序を追跡するのに役立つ、ガラスによく位置にラベルを付けるし、識別するのに井戸が櫛を取り外したら</li>。
	<li>は、櫛を削除します。1 x ペース バッファーで井戸を埋める</li>。
	<li>では、10 μ L, マイクロシリンジを使用して井戸に 2 μ L の標準およびサンプルを読み込みます。一番外側のレーンは、不十分なサンプルを実行する傾向があるを使用しないでください</li>。
	<li>ゲル実行装置の上部チャンバーを組み立てるし、冷却 (~ 10 ° C) 実行中戦車 (10 ° C) でジェル 1 x ペース バッファーを含みます。1 x ペース バッファーと上部チャンバーします</li>。
	<li>および有効に電源と 200 V でゲルの実行 (定数 V) 30 分、その後、増加電圧 1000 V を 1 時間 40 分。(例えば、 黒いゴミ袋のタンクをラップすること) の光からゲルを保護します 。
	注: 電圧をオンとし、別の 5 分後に 1000 V に電圧を増加した後ゲル 〜 5 分を確認します。場合は、パワーパックはバッファー リークがある可能性が高い電圧を維持することができます。タンクからゲルを削除します。慎重にすべてのガスケットの配置をチェック上部の部屋を再度連結します。ガラス板の上部の端に大規模なチップは、ガスケットに良好なシールを形成する板を防ぐことができます。これ通常一時的に解決できる上部チャンバーを追加する前に、ガラスの欠けの部分に 5% (w/v) 溶融 agarose のドロップを追加しています</li>。
</ol> 9。ペース ゲルを視覚化する 注: 長波長紫外線電球、transilluminator、蛍光体、ここ 530 nm に適しているカメラの発光フィルターを搭載したシステムをイメージング ゲルを使用します。また、レーザー スキャナーも使用できます、Goubet 2 で説明した。
<ol><li>イメージング システム ゲル湿った糸くず組織とそれを拭くことによってフリー塵であるを確認します</li>。
	<li>ペース タンクからゲルを削除し、ながらゲルはまだガラス板を簡単に表示 (&#60; 80 ms) 染料フロントがゲルでまだ判断する</li>。
	<li>ウェッジ ツールを使用してゲルを開きながら、ゲルがまだ 1 つのガラス プレート上にスタッキングのゲルの両方を削除するピザ カッターを使用し、ゲル、ゲルの底上色素の前面にある場合</li>。
	<li>は、transilluminator の表面に 〜 5 mL H 2 O を入れ、transilluminator に直接ゲルを転送します。UV 605 にフィルターを設定し、長波長 UV transilluminator をオンに (材料の表 を参照してください) ソフトウェアを使用しています 。
	注: ここで使用されるアリ fluorophore は 353/520 の励起・発光 nm</li>。
	<li>は様々 な露光時間でいくつかの画像を取る (例えば、 100 ms を 10 s)。紫外線は蛍光性の低下を避けるため (オフに) する UV ライト] ボタンをクリックして画像のオフになってことを確認します。画像の少なくとも 2 には飽和のバンド (ゲルのイメージング ソフトウェアはこれを示している) がないようにします</li>。
	<li>高 resolution.tif 画像としてファイルを保存します 。
	注: 画像は、イメージング システム、ゲルまたは ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) など、自由に利用できる画像分析ソフトウェアを使用して、付属のソフトウェアを使用して分析できます。定量の議論の 結果 を参照してください</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+A+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Mortimer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Cell+Wall+Polysaccharides+Using+PACE.">Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE.</a> Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).</li><li>Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+glycosyl+hydrolases+and+biofuels:+a+natural+marriage.">Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage.</a> Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).</li><li>Mortimer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+xylan+in+Arabidopsis+primary+cell+walls+is+synthesised+by+GUX3,+IRX9L,+IRX10L+and+IRX14.">An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14.</a> Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).</li><li>Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+relative+quantitation+using+isotope+tagging+and+normal-phase+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).</li><li>Busse-Wicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Xylan+Substitution+Patterns+in+Gymnosperms+and+Angiosperms:+Implications+for+Xylan+Interaction+with+Cellulose.">Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose.</a> Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).</li><li>Mortimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+branches+from+xylan+in+Arabidopsis+gux+mutants+reveals+potential+for+simplification+of+lignocellulosic+biomass.">Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).</li><li>Anders, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyl+transferases+in+family+61+mediate+arabinofuranosyl+transfer+onto+xylan+in+grasses.">Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).</li><li>Goubet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+glucomannan+in+Arabidopsis+is+synthesised+by+CSLA+glycosyltransferases,+and+influences+the+progression+of+embryogenesis.">Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis.</a> Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+That+GH115+alpha-Glucuronidase+Activity,+Which+Is+Required+to+Degrade+Plant+Biomass,+Is+Dependent+on+Conformational+Flexibility.">Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility.</a> J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+complexity+dictates+microbial+resource+allocation+in+the+large+intestine.">Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine.</a> Nat Commun. 6, 7481 (2015).</li><li>Handford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localisation+and+characterisation+of+cell+wall+mannan+polysaccharides+in+Arabidopsis+thaliana.">Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana.</a> Planta. 218 (1), 27-36 (2003).</li><li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+stage-based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis:+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants.">Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants.</a> Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Carbohydrate Active Enzyme Database. , (2017).</li><li>Hogg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+architecture+of+Cellvibrio+japonicus+mannanases+in+glycoside+hydrolase+families+5+and+26+points+to+differences+in+their+role+in+mannan+degradation.">The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation.</a> Biochem J. 371, 1027-1043 (2003).</li><li>Brennan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+microbial+xylanases+from+insect+guts.">Unusual microbial xylanases from insect guts.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+high+throughput+carbohydrate+profiling+technique+for+analyzing+plant+cell+wall+polysaccharides+and+carbohydrate+active+enzymes.">Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 6, (2013).</li></ol>

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ペースは、多糖類の構造を特徴付けるための簡単な方法です。それは適用することができます任意の多糖類を特徴づけられる活動の GHs と既知が、文献1,6,9,11の多数の例を参照してください。Tt は、新規 GHs12,13,18と糖転移酵素の9、特性評価に適用されている定義された多糖基質と受容体の使用することによって。
再現性、解釈の結果は、3 つの主要手順に依存しています。最初に、使用される GHs は活動を汚染から無料する必要があります。これはベストのみ発現クローンを使用して達成、アフィニ ティー精製酵素。第二に、ほとんどの実験では、基質の酵素加水分解が完了であることが重要です。これは、同じバイオマス同じ GH と加水分解では、すべての実験の同じ指紋が保証されます。最後に、誘導体化反応における蛍光体の過剰があるはずです。これにより、利用可能な還元終了は 100% 近くでラベルが。これは、結果としては定量的データの高再現性になります。
ゲルと試薬の品質、再現性のあるデータを確保するために重要です。質の悪いバッファー、特に不適切な pH のゲルで気泡があり塩の過剰でサンプルできるオリゴ糖のすべてに影響を与える解像度と保持要因。ただし、プロトコルおよび結果のセクションで説明した推奨のコントロールを含めることがトラブルシューティングを有効にします。
ペースは、オリゴ糖を識別する能力によって制限されます。いくつかの実験のため単純な指紋は必要なことです。ただし、本当に空気のサンプルのグルコマンナンの量を量的、たとえば、リリースされたすべてのオリゴ糖のアイデンティティが必要、時間のかかるプロセスであります。これは複雑な多糖類キシラン3など以下のより簡単です。市販オリゴ糖に少数の標準がある、のでそれが常にできないやすべてのバンドを識別することが望ましい。この場合、ペースは、質量分析法 (すなわち、 MALDI CID9または ESI MS7、及び NMR6) に非常に無料のデータを提供できます。これらのメソッドでは、大規模な準備を行う、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離し、MS や NMR の前に両方のペースで各分画を分析する便利です。バンドの摘出や MALDI CID によって識別されることができることが報告されている、しながら実際に我々 を発見した (おそらく原因で紫外線にさらされたとき、アクリルアミドゲル標識オリゴ糖の相互作用) の成功率が低い、これがあります。
ペースの他の主要な制限は、スループットです。良質を適切なコントロールと解釈ゲル ゲルのみ 〜 10 実験サンプルを持つし、一日 〜 4 ペースのゲルを実行する研究者が期待できます。最近では、キャピラリー電気泳動 (CE) を使用してペースのバージョンは、開発19、96 ウェル プレートで試料の調製を可能にするをされています。それが実証されて酵素酵素活性と多糖類の構造6,19を特徴付けるため購入・維持する高価なことができる CE マシンへのアクセスが必要ですが。

ゲル電気泳動 (ペース) による多糖類の分析は、多糖類1,2,3の詳細な特性評価のための方法です。植物細胞壁多糖は、分析が困難であり、高価な機器、熟練オペレーターと大量浄化された材料のほとんどのメソッドが必要があります。ここで、簡単な説明を得るためのメソッドの詳細な多糖類の構造については、構造異性体の解像度を含みます。
理解植物細胞壁多糖の構造は、植物の細胞壁の生合成や植物発生における植物細胞壁の役割を調べる研究者に必要です。しかし、植物細胞壁組成近年注目されているバイオ燃料と生化学4を生産する原料として植物バイオマス (本質的に細胞壁) を使用してに焦点を当てるのための研究者のより広いグループに興味深い。例として、この材料の効率的な糖化が必要です多糖構造の詳細な理解できるように最適化された酵素カクテル選択した5。
ペースには、複雑な糖鎖構造の迅速な解析に最適にする代替の方法をいくつかの利点があります。まず、問題の解決策の状態の核磁気共鳴 (NMR)6必要な多糖類の精製は必要ありません。第二に、ペースは、質量分析法とは異なり、構造異性体を解決できます (MS、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) とエレクトロ スプレー イオン化 (ESI))、これも液体クロマトグラフィー (LC)による実行が難しくなります7. 第三に、ペースは非常に敏感で、薄層クロマトグラフィー (TLC) やペーパークロマトグラフィーとは異なり、低ピコモル レベルの解像度を持つ。最後に、LC、NMR、MS という場合に、高価な機器や専門知識を必要ありません。
ペース ・ メソッドは、多糖類の混合物中の特定のグルコースポリマーを対象とする糖加水分解酵素 (GH) 酵素の特異性に依存します。GH 酵素多糖鎖の機能を果たす、ことができますする化学的誘導体、この場合蛍光ラベルとする還元末端が明らかに。サンプルの unhydrolyzed の部分は、したがってこのメソッドによって検出不可能なレンダリングされます。ラベル付きのオリゴ糖は、電気泳動による大判アクリルアミドゲル中で区切られます。これは非常によく似た分子の優れた解像度を与える、たとえば、Glc の男と Glc-男-Glc 三糖類は、異なる Rfが。
ペースは、シロイヌナズナ6,9,10,11 の新規糖転移酵素を識別する植物種の8日間で異なるキシランの構造を特徴付けるため広く使用されています酵素試金9を実行する、および新規 GH 活動12,13を特徴付けます。我々 はまた、最近酵母細胞壁マンナン (Mahboubi と準備でモーティマー) を特徴付けるためそれを使いました。ここで以前レポート11,14に基づいて、植物細胞壁グルコマンナン構造の特性評価法について述べる。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Oligosaccaharide Standards&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other specialty chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picoline borane</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialty Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel casting kit</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td></tr><tr><td>Cooling recirculating water bath&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td></tr><tr><td>High Voltage Power Pack</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Glycosyl hydrolases&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lab supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging software ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

植物細胞壁多糖は、分析が困難であり、高価な機器、熟練オペレーターと大量浄化された材料のほとんどのメソッドが必要があります。ここで、簡単な説明を得るためのメソッドの詳細な多糖類の構造については、構造異性体の解像度を含みます。ゲル電気泳動 (ペース) による多糖類の分析の糖加水分解酵素 (例えばマンナンのマンナナーゼ) の関心の多糖類に固有の植物の細胞壁の材料を加水分解します。大判ポリアクリルアミドのゲルは、蛍光標識されているリリースされたオリゴ糖を分離する使用されます。イメージング システム変更されたゲルのゲルを視覚化できる (材料の表を参照してください)。結果として得られるオリゴ糖指紋か比較できます質的または、レプリケーションでは、定量的。リンケージや分岐情報を追加糖加水分解酵素 (例えば、 mannosidases およびガラクトシダーゼ) を使用して確立できます。このプロトコルでは、グルコマンナン構造解析法について説明します、間、特徴付けられる糖加水分解酵素が存在する任意の多糖類に適用できます。また、定義された多糖類基板を用いた新規糖加水分解酵素の特性評価に使用することができます。

ここでは、データの解釈およびトラブルシューティングを支援するための説明と共に、プロトコルごとを実行例ペース ゲルを紹介し、ゲル解釈13,16ペース成功への一般的なガイドが続きます。代表的なゲル標準ペースの細胞壁マンナン コンテンツの試金は図 2に示すし、は記述されている車線に車線。
基準 レーン 1、2 と 3 は、商業的に購入したオリゴ糖 (男1-6) 5 (S1)、10 (S2)、50 (S3) pmol 濃度でのはしごを表示します。市販のオリゴ糖の新しいロットを受信するとき、ゲルの純度を確認する重要です。多くのオリゴ糖、特に tetrasacccharides 男6のとおり、長く他 (DPs)、重合度のオリゴ糖との重大な汚染を持つことができます (付いている *)。ゲルを量的に表わす、標準曲線を計算するために必要なのだから、基準の少なくとも 3 の濃度を持っていることが重要です。標準曲線の計算は、完了時誘導体化反応が本質的にあることを確認のために有用することができます。既知濃度の標準ゲル間の比較を許可と分離品質と品質の誘導体化の便利なコントロールです。
肯定的な制御 レーン 4 こんにゃくグルコマンナンの mannanase 消化を示しています。こんにゃくグルコマンナンが、商業利用と間と同じ構造を持っていないことなど、シロイヌナズナは、それ 2 つの目的します。まず、酵素の消化力のための重要なコントロールです。研究者は、選択の彼らの GHs と消化される商業基板のとき消化完了 (すなわちGH の広大な過剰反応に追加) するように見えるものを確立しなければなりません。将来的に実験、パターンを変更する場合いずれかの活動の損失や GH 株式の汚染を可能性します。第二に、それは酵素とバッファーの塩の存在下で誘導体化反応のコントロールとして機能します。基準はよく見る肯定的な制御が悪い場合は、加水分解反応のコンポーネントが、誘導体化に抑制的であるこれを示している可能性があります。
野生型 (WT) シロイヌナズナ幹空気 + mannanase カクテル (GH5 + GH26) レーン 5 WT シロイヌナズナ幹 (参照11,14との比較) のペース指紋を示しています。
csla9シロイヌナズナの茎の航空券 + mannanase カクテル (GH5 + GH26) ショー、シロイヌナズナ由来のペースの指紋は、欠けている主要な植物茎マンナン シンターゼ11レーン 6 を示しています。WT 及び陰性対照と比較して指紋。マンナンの大半が欠席しながらこれを追加マンナン合成酵素 (CSLA2, 3) による総合すべて mannanase 由来オリゴ糖の減らされたバンド強度によって証明されるよう、少量のまま当工場では11。
否定的な制御 - 酵素のみ レーン 8 はゲルのバンドを示しています特定のカクテル、mannanase 中の汚染物質から派生し、解析から除外する必要があります (付いている *)。
否定的な制御 - WT 空気のみ レーン 9 固有ではない、分析から除外するゲルのバンドを示しています (付いている *)。
否定的な制御-csla9空気のみ 車線 10 固有ではない、分析から除外するゲルのバンドを示しています (付いている *)。
松の木の空気 + mannanase カクテル (GH5 + GH26) 車線 7 galactoglucomannan を含む松の木材のペース指紋を示しています。これは明らかに構造が異なるため、シロイヌナズナにリリースされたオリゴ糖の別のパターンがあります。
否定的な制御 - 松空気のみ レーン 11 固有ではない、分析から除外するゲルのバンドを示しています (付いている *)。
ペース ゲルの解釈は比較的簡単ですが、以下の点の意識が必要です。堅牢なデータ、遂行する少なくとも 3 独立して成長して生物学的にペースをレプリケートして、各生物の複製で少なくとも 2 技術的なレプリケートを実行するお勧めをお勧めします。説明されているコントロールは、無指定バンドは除外する必要があると解釈のため重要です。また、transilluminator による不均一な照明に起因する効果を除外する複製のゲルの別の順序のサンプルの読み込みをお勧めします。正確な解釈には、飽和していないバンドの分析が必要です。いくつかのオリゴ糖の指紋が両方非常に高、低の豊富な多糖類を含む可能性がありますので、同じゲルの複数のエクスポー ジャーの分析をお勧めします。基準を使用して、異なる画像間を正規化できます。
実験の種類によっては、空気の準備における多糖の量を定量化することが望ましい場合があります。ながらペースのゲルから定量化することは、GHs が発表した各オリゴ糖の分子の正確な id の知識が必要ですし、ペースのゲルのどこにあります。これ現在ない完全に知られているマンナンが他多糖類などキシランの3と判断されました。基準は、定量が実行されていない場合でも、任意の定性・半定量分析に役立ちますので、ジェルとの間の正規化の方法を提供を行います。
個々 のオリゴ糖の構造の識別はカクテルを使用して達成することができます GHs シーケンシャルの GHs さらに添加できる連携およびリリースされたオリゴ糖 (例えば、添加 β - 1, 4 - の置換の詳細についてを明らかにします。。グルコシダーゼ非還元末端に作用を明らかにするどのオリゴ糖混合物中にその機能が含まれている)。利用可能な酵素は、ガラクトシダーゼ、glucuronidases、グルコシダーゼ (詳細については CAZy データベース16参照)。ホッグ、D.らを参照してください。例として17 。
不明な GHs の活動の特性を上記のプロトコルを使用できます。この場合、不明な GHs13を画面に定義されたバイオマスは、シロイヌナズナの茎やこんにゃくのグルコマンナンなど使わなければなりません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
図 1: これはアリとオリゴ糖の蛍光誘導体化法を示しています。Goubet2から変更します。<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"ターゲット ="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
図 2:シロイヌナズナ、松、シロイヌナズナ変異体からマンナン指紋を示す代表的なペースのゲル (csla9) マンナン生合成障害者いる。AlR はカクテル、mannanase、加水分解し、リリースされたオリゴ糖が、蛍光の誘導体します。オリゴ糖は、サイズ、形状、および電荷に基づいてゲルの電気泳動によって分離しました。満濃糖 (Man1-6) の梯子はリリースされたオリゴ糖の相対移動度を識別するを支援するためその精製マンナン (こんにゃく由来) の加水分解はポジティブ コントロールとして表示されます。* = 無指定バンド。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

ゲル電気泳動 (ペース)、たとえば、マンナンを使用して多糖類の構造解析のプロトコルを説明します。

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K ビュー.  Joint BioEnergy Institute. ゲル電気泳動 (ペース)、たとえば、マンナンを使用して多糖類の構造解析のプロトコルを説明します。

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Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

生化学

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

化学

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

生物学

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

発生生物学

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

マイクロアレイポリマープロファイリングによる糖鎖の構造と出現性の解明

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

著者スポットライト: MAPP Protocol – Advancing Glycan Analysis 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

ハイスループット糖鎖分析のためのマイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

マンナンペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

要約

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ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化

ハイスループット糖鎖分析のためのマイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

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ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

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結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化

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