糸状菌による高分子加水分解細胞外酵素生産のための固体発酵系の設計

このプロトコルは、回転式固体発酵システムで小麦ふすまを利用して、酵素生産を強化します。基質にはキチンなどの誘導剤が添加されており、制御された条件下で真菌の増殖をサポートします。結果は、水中発酵と比較して酵素収量が4〜6倍高いことを示しており、多様なバイオテクノロジーアプリケーションに対するこの方法の適応性と有効性を示しています。

固体発酵(SSF)は、水性媒体に溶解しない固体基質を利用する生体変換プロセスです。微生物は基質の表面で増殖し、その固体マトリックスに浸透して、その発生に必要な栄養素を抽出します。SSFは、自由水が最小限に抑えられ、基質の水分含有量が70%以上に維持されていることを特徴とし、気体、液体、固体の3つの相互接続された相を含みます。このプロトコルは、回転システムでの酵素生産のための基本基質として、農工業副産物である小麦ふすまの使用を説明しています。基質には、キチン、キトサン、デンプン、セルロースなどの誘導剤が添加され、加水分解タンパク質の合成が促進されます。このシステムは適応性が高く、菌糸体、胞子、ペレットなど、さまざまな真菌形態を使用することができます。記載されている方法では、インデューサーと基質を1:100(w/w)の比率で混合し、オートクレーブ滅菌 により 滅菌し、滅菌水で所望の水分レベルに調整します。次に、真菌接種物を添加し、回転システムを10rpmで作動させて、適切な混合と酸素化を確保します。このシステムは、中温性または好熱性/耐熱性真菌の最適な増殖条件下で6〜8日間インキュベートされ、その汎用性が向上します。インキュベーション後、酵素の種類に応じて、適切な低温緩衝液(酢酸、クエン酸塩、リン酸など)を使用して酵素を容易に抽出できます。抽出物は、遠心分離とろ過によって清澄化され、無細胞上清が得られます。その後、酵素は必要に応じてさらに濃縮または精製することができます。その結果、サブマージ発酵(SmF)と比較して酵素活性が4〜6倍増加したことが示され、システムの有効性が強調されました。さまざまな基質、誘導物質、および真菌種への適応性により、さまざまなバイオテクノロジーアプリケーションにとって貴重なツールになります。

固体発酵(SSF)は、高価値酵素、生理活性化合物、および二次代謝産物を生産するための有望で持続可能なバイオコンバージョン技術として浮上しています。この手法では、最小限の自由水で固体基質上で微生物を増殖させ、微生物の自然環境をシミュレートし、効率的な代謝活動を可能にします¹。このプロトコルの主な目標は、基質の利用率、酸素拡散、およびプロセスのスケーラビリティを向上させる回転式SSFシステムを通じて酵素産生を最適化することです。農産業副産物として豊富に存在する小麦ふすまをベース基質とすることで、農業残渣の価値化に貢献し、循環型バイオエコノミーの実践を促進します²。

SSFは、エネルギーと水の消費量が少ない、製品濃度が高い、小麦ふすま、籾殻、サトウキビバガス³などの安価な農業残渣との幅広い適合性など、サブマージ発酵(SmF)に比べて大きな利点があります。大量の水と高価な栄養培地を必要とするSmFとは異なり、SSFシステムは、微生物の増殖表面として機能するだけでなく、微生物の活動に不可欠な栄養素を提供する固体マトリックスを活用します。さらに、SSFに含まれる自由水が限られているため、汚染リスクが最小限に抑えられ、工業環境での酵素生産のためのより堅牢なオプションになります⁴。SSFは、その運用上の利点に加えて、サブマージ発酵(SmF)と比較して、環境的および経済的に大きなメリットをもたらします。研究によると、SSFは水の消費量を50%〜70%削減し、絶え間ない攪拌と曝気を必要とする大量の水がないため、エネルギーコストを30%以上削減することが報告されています。さらに、農工業残渣を基質として使用することで、原材料コストを最小限に抑え、農業副産物を再利用することで循環型経済の実践を促進します^2,4。

SSFは、その効率性とスケーラビリティについて広く検証されています。例えば、SSFを使用した酵素活性はSmFと比較して4〜6倍に増加したと研究で報告されており、この手法の経済的および環境的利点が強調されています^2,5。さらに、酵素抽出は通常、必要な水と精製ステップが少なくて済むため、下流のプロセスが簡素化されます。そのため、SSFは、運用コストと環境への影響の低減を目指す業界にとって特に魅力的です⁶。

このプロトコルで説明されているロータリーSSFシステムは、従来の静的SSF方法に比べていくつかの改善点を提供します。静的システムは、不均一な基質のコロニー形成や酸素制限などの課題に直面することがよくありますが、回転構成により、完全な混合と曝気が保証され、均一な微生物増殖が促進されます^7,8,9。例えば、このシステムは、アスペルギルス属やトリコデルマ²形などの真菌種を用いて、キチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼなどの加水分解酵素を作製するために成功裏に採用されています。

このSSFシステムの大きな特徴は、その適応性です。小麦ふすまをベース基質として使用することは、費用対効果の高いバイオコンバージョンのための農工業残渣の可能性を示しています³。さらに、キチン、キトサン、デンプンなどの誘導物質を基質に補給すると、特定の代謝経路を刺激することにより、酵素合成がさらに促進されます^2,10。また、このシステムは、胞子、菌糸体、ペレットなど、さまざまな真菌形態にも対応しているため、ユーザーは特定の要件に合わせてプロセスを調整できます²。

SSFは、食品バイオテクノロジー、バイオ燃料生産、環境修復などのさまざまな分野での応用に幅広い可能性を秘めています¹¹。コスト効率の高い基質、優れた酵素収率、および高いプロセスの柔軟性の統合により、SSFは工業規模のバイオテクノロジーイノベーションに不可欠なアプローチとしての地位を確立しています。

この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 基板調製

注:基質特性の大幅な変動を最小限に抑えるために、市販の小麦ふすまを使用してください。小麦ふすまの各バッチは複数の要因によって異なるため、標準化が困難な不均一な材料であり、その構成含有量の変動につながります。標準化された材料が必要な場合は、代替マトリックスを選択するか、小麦ふすまの各バッチの近接化学分析を実行して、必要に応じて調整します。

1. 小麦ふすまを滅菌蒸留水で3回洗って、有機物の残留物、破片、ほこりを取り除きます。これにより、発酵を妨げる可能性のある単糖も除去されます。
2. 洗ったふすまをアルミ製のトレーに広げ、60°Cのオーブンで24時間乾燥させます。
3. 乾燥したら、小麦ふすまを滅菌済みの50mLコニカルチューブに入れます。

2.接種材料の調製

注:このプロトコルでは、接種液の3つの方法、すなわち胞子懸濁液、菌糸体円板の直接接種、および細胞懸濁液について説明しています。初期接種濃度を確立し、タンパク質レベルを定量化して、正確な収量計算を行います。

1. 胞子懸濁液の調製
   1. 菌糸体で飽和させた直径5mmの寒天ディスクを新鮮なジャガイモデキストロース寒天プレートに移します。プレートを28°Cで5〜7日間、または菌糸体が培地に飽和するまでインキュベートします。一部の菌類は、より長いインキュベーション時間を必要とする場合があります。
   2. 5 mLの滅菌蒸留水をプレートに加え、滅菌ループを使用して胞子を機械的に剥離します。
   3. 胞子懸濁液を1:100に希釈して調製します。ノイバウアーチャンバーの中央に10 μLを置き、顕微鏡で胞子をカウントします。チャンバーの係数と希釈に基づいて胞子濃度(胞子/ mL)を計算します。
2. 液体培地での菌糸体の培養
   1. 菌糸体で飽和させた5 mmの寒天ディスクを新鮮なジャガイモ-デキストロース-寒天プレートに移し、飽和するまで28°Cでインキュベートします。
   2. 25 mLのジャガイモ-デキストロースブロスを滅菌125 mLフラスコとオートクレーブで調製します。.
   3. 飽和プレートから5mmの菌糸体ディスクを滅菌ブロスに移します。
   4. フラスコをシェーカーで125rpmで24〜48時間インキュベートします(真菌株にもよりますが)。成長の遅い菌類のインキュベーション時間を延長します。
   5. 接種用に2 mL、乾燥重量測定用に2 mLを収集します。
3. 菌糸体円板の直接接種
   1. 菌糸体で飽和させた5 mmの寒天ディスクを新鮮なジャガイモ-デキストロース-寒天プレートに置きます。飽和するまで28°Cでインキュベートします。
   2. 1つの菌糸体ディスクを接種材料として使用し、もう1つの真菌ディスクを使用して乾燥重量を決定します。

3. SSFシステムの準備

注:インデューサーは、天然のものでも商業的なものでもかまいません。精製された市販の誘導剤は、発酵効率を変化させる可能性のある不純物を最小限に抑えるために好まれます。相対湿度を少なくとも90%に維持するように、水の追加を調整します。

1. 滅菌済みの50mLコニカルチューブに次のコンポーネントを組み合わせます:乾燥小麦ふすま5g;0.2gのインデューサー(例えば、市販のキチン);5.5 mLの水(インデューサーの吸水能力に基づいて調整します)。16 g/L 一塩基性リン酸カリウム、4 g/L 硫酸ナトリウム、2 g/L 塩化カリウム、1 g/L 塩化カルシウム、400 mg/L 塩化亜鉛、60 mg/L ホウ酸、40 mg/L モリブデン酸ナトリウム、150 mg/L 塩化マグネシウム、100 mg/L 塩化第二鉄、400 mg/L 硫酸銅を含む 5 mL の滅菌塩溶液。
2. 電極ベースの湿度計を使用して相対湿度を測定し、最低90%の湿度を確保します。電極プローブをさまざまな深さで反応器に直接挿入して、水分分布の代表的な測定値を取得します。
   1. 手順に従って、湿度が90%未満の場合は湿度を調整します。
      1. 滅菌蒸留水を基質10gあたり1mL刻みで徐々に加えます。添加するたびに、水分が均一に分布するように十分に混合します。
      2. 基板を10〜15分間平衡化させます。湿度レベルを再測定します。
      3. 目標湿度の90%に達するまで、上記の手順を繰り返します。プロセス全体で基材を過度に濡らさないようにしてください。
   2. 湿度が90%を超える場合は、手順に従って湿度を調整します。
      1. 無菌環境で基質を薄く広げます。(1)基板を層流にさらすか、(2)30°Cの乾燥チャンバーに10〜15分間置くことにより、余分な水分を取り除きます。
      2. あるいは、基材を穏やかに混合して、水分の再分布を均一に促進します。処理後、湿度レベルを再評価します。
      3. 湿度が90%に達するまで、必要に応じて乾燥または混合ステップを繰り返します。目標湿度に達した場合にのみ発酵を進めてください。
3. チューブを15psiで15分間オートクレーブします。
4. 冷却後、1 mLの胞子懸濁液(1 x 10^6-1 x 10⁷ 胞子/ mL)、2 mLの細胞懸濁液、または1つの5 mm菌糸体円盤のいずれかを基質に接種します。

4. 固相発酵(SSF)の手順

注:異なる時間での動力学研究またはパラメータ評価の場合は、代表性を確保するために、各時点に別々のチューブを準備してください。

1. 1分サイクルで5分間チューブを最高速度でボルテックスすることにより、基板の凝集を回避します。
2. チューブを水平軸のロータリーミキサーに入れます。基板がチューブ内を自由に動くことを確認します。ミキサーを10rpmで動作するように設定します。
3. ミキサーをインキュベーター内で、微生物の最適な増殖温度でインキュベートします。熱感受性インデューサーを使用する際には、最適な酵素活性を得るために報告された温度を維持してください。

5. 酵素の抽出

注:抽出の基本は、細胞外酵素の溶解度とpH-最大活性に基づいています。SSFは水媒体を避けるため、細胞外酵素は固体マトリックスの周囲の水に関与しており、これは濃度がSmFよりも高いことを意味します。この文脈では、最適な抽出バッファーの選択は、目的のアクティビティの知識に依存します。抽出の最適化は、最終的な酵素濃度と使用する抽出バッファーの種類によって異なります。

1. 所望の発酵期間の後、基質を20mLの予冷緩衝液に再懸濁します。例えば、0.1 Mアセテート緩衝液、pH 5.6、キチナーゼ抽出用。0.02 M リン酸緩衝液、pH 6.9、アミラーゼ抽出用。
2. チューブをサイクルでボルテックスします:最高速度で1分、続いて氷上で1分。10回繰り返します。
3. ペーパーフィルターを使用して懸濁液をろ過し、プレスして上澄みを機械的に抽出します。
4. 上清を3000 x g で4°Cで15分間遠心分離して清澄化します。
5. 粗抽出物を直接使用するか、カラムクロマトグラフィーまたは遠心フィルター を介して 酵素をさらに精製します。ミカエリス定数(Km)および酵素形質転換の最大速度(Vmax)を決定するために、速度論的研究も推奨される¹²。

6. 最適化プロセス

注:インデューサーの品質と濃度、および接種物の種類と濃度を評価および調整することにより、このプロトコルを最適化します。

1. 理想的な発酵時間を決定し、抽出ステップを改良して効率を向上させます。
2. 温度、pH、曝気などの環境条件を制御し、微調整します。
3. さまざまなバッファーと抽出条件をテストして、酵素の収量と安定性を向上させます。
4. 応答曲面法などの統計解析を実行して、最も影響力のある変数を特定し、最適な酵素産生を実現します。

図1A は、このシステムで使用されるロータリーミキサーの概略図を示しており、50mLの円錐形チューブ6本の容量があります。 図2B は、固体発酵プロセスに入る前のコンディショニング中に小麦ふすまに発生する変化を示しています。見ての通り、大きな構造変化は観察されませんでした。

図2は、市販のキチンを誘導剤として使用した このシステムでのTrichoderma harzianaum 菌によるキチナーゼ産生のための6日間の固体発酵後の小麦ふすまの飽和度を示しています。 図2A は、発酵プロセス前の元の材料を示しています。顕微鏡写真は、基質が真菌によって利用されていることを確認し、それはそれが受ける修飾にも反映され、真菌との相互作用によりフラクタル様構造を失います。

図3の結果は、固状態発酵(SSF)と水中発酵(SmF)システムを比較すると、T. harzianaumおよびAspergillus lentulusからそれぞれ得られたキチナーゼ活性(図3A)およびアミラーゼ活性(図3B)の有意な増加を示しています。データは、SigmaPlotソフトウェアを使用して、p < 0.05の一元配置ANOVAおよびTukey検定によって検証されました。これに関連して、このシステムはさまざまな酵素活性および真菌に適用可能であることが観察されます。A. lentulusは、40°Cでインキュベートされた耐熱性真菌として特徴付けられ、そのアミラーゼ活性の有意な増加を示しました。T. harzianumの液体発酵と固体発酵の両方におけるキチナーゼ活性の結果は、以前に私たちの研究グループ^によって別々に報告されており^2,5、この研究では、アミラーゼ活性と同様に、SmFと比較してSSFの有意な増加を確認し、比較しました。私たちのグループは、中温性および好熱性条件下でのプロテアーゼとアミラーゼの生産のために50以上の真菌株に取り組んでおり、結果は一貫しています。

この結果は、酵素活性の大幅な増加を示し、固体発酵は水中発酵と比較してより高い出力をもたらすことにより、プロトコールの成功を裏付けています。これは、キチナーゼとアミラーゼの両方の産生を促進するためのSSFの有効性を示しています。以前に公開された数値は、適切な転載許可を得て再利用しています。

図1:回転式固体発酵(SSF)システムと小麦ふすま前処理工程の概要(A)回転式SSFシステムの概略図。(B)小麦ふすま前処理工程の変更:(I)初期原料、(II)洗浄工程後の湿った小麦ふすま、(III)乾燥小麦ふすま。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2: Trichoderma harzianumによる基質飽和。 (A)SSF前の基板。(B,C)基質は、異なる倍率で真菌菌糸体で飽和しています。スケールバー:(A)、50μm;(B)、200μm;(C)、100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: T. harzianum および A. lentulusによるSSFおよび水中発酵(SmF)における酵素活性。 (A)SSFおよびSmFで Trichoderma harzianum によって産生される酵素によるキトサンの加水分解によるグルコサミン形成、および(B)SSFおよびSmFで得られた Aspergillus lentulus のアミラーゼ活性の比較。アスタリスク(*)は、データ間の統計的に有意な差を示します。なお、統計的な変動は各酵素の種類に特異的であり、(A)と(B)の比較には適用されないことに留意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この研究では、糸状菌専用に設計された固体発酵(SSF)システムによる酵素産生を最適化するための関連プロトコルを概説しています。以下では、方法論の重要な側面について、その重要性、制限、および潜在的なアプリケーションとともに説明します。

プロトコールの成功は、基質や接種の調製などの主要なステップに大きく依存します。小麦ふすまの適切な洗浄と乾燥は、真菌の増殖や酵素産生を妨げる可能性のある不純物を排除するために不可欠です。さらに、相対湿度を90%以上に維持するために基質の水分を慎重に調整することで、最適な真菌のコロニー形成と活性が保証されます¹³。10rpmでのロータリーシステムの動作は、均一な混合と酸素化を促進し、基質の凝集を防ぎ、均一な真菌の成長を確保するため、別の重要なパラメータです¹⁴。

このプロトコルの適応性は、多様な真菌種および誘導物質との適合性にあります。例えば、この研究では市販のキチンとデンプンを誘導剤として使用しましたが、標的酵素によっては、リグニン、セルロース、キトサンなどの他の基質を置換することができます。不均一な基質コロニー形成などの一般的な課題のトラブルシューティングには、混合パラメータの改良や接種濃度^{の調整が含まれます2}。さらに、基質調製および接種中の無菌性を確保することは、特に工業規模のアプリケーションにおいて、汚染を防ぐために重要です¹⁵。

SSFはサブマージ発酵(SmF)に比べていくつかの利点がありますが、制限がないわけではありません¹⁶。大きな課題の1つは、SSF^17,18で共通の問題である基板の混合、酸素拡散、または正確なバイオマス測定を損なうことなく、回転式SSFシステムをスケールアップすることです。さらに、このプロトコルが小麦ふすまなどの農工業残渣に依存しているため、バッチ間で基質組成が異なるため、結果にばらつきが生じる可能性があります。これらの制限は、大規模生産に移行する際のさらなる最適化の必要性を浮き彫りにしている^19,20。

記載されているロータリーSSFシステムは、従来の静的SSFおよびSmF法に比べて大きな利点を示しています。静的SSFと比較して、回転システムはより均一な微生物の増殖を保証し、酸素制限に関連する問題を軽減します。さらに、このシステムの適応性により、さまざまな真菌形態や酵素タイプへの適用が可能になり、非常に汎用性の高い¹⁸。SSFシステムは、代謝物の生産性を向上させるためにさまざまな構成を持つことができます。各タイプのシステムには長所と短所があり、最適な構成を決定するために詳細に分析する必要があります。ロータリーSSFシステムは、従来の静的SSFおよびSmFに比べていくつかの利点があります。ただし、トレイや充填床バイオリアクターなどの他のSSFシステムと比較すると、課題に直面します。大規模なSSFに一般的に使用されるトレイバイオリアクターは、簡便でエネルギー消費量が少ない一方で、酸素移動や水分分布の制限に関連する課題に直面しており、微生物の増殖が不均一になり、酵素収量が減少します。一方、パックベッドバイオリアクターは、強制的な気流によって曝気を改善しますが、特に高い柱では、圧力降下や不均一な温度分布の問題に直面する可能性があります。対照的に、回転式SSFシステムは、連続的な混合と均質な条件を促進し、嫌気性ゾーンを減らし、酵素の生産性を向上させます。それにもかかわらず、連続回転によるエネルギー消費と機械的摩耗は、運用コストを増加させる可能性があります²¹。

トレイバイオリアクターなどの静的固体発酵システムは、限られた熱と物質移動によって制約を受け、しばしば内部温度勾配が30°Cを超え、微生物の性能が最適ではありません。これらのシステムは通常、少量(0.15-0.25 m³)で動作し、不均一な微生物のコロニー形成に悩まされており、研究によると、基質細孔の約34%しか効果的に利用されていないことが示されています。対照的に、回転式バイオリアクターは、酸素分布と基質の均質性を高める機械的攪拌を提供しながら、最大13m³のより大きな操作容積と40%(w/v)に達する基質負荷をサポートします。注目すべき例は、 Thermoascus aurantiacusによるセルラーゼ産生を含み、49°Cに維持され、5 L / min·kgで換気された回転SSF反応器は、14,098 IU / gの酵素活性をもたらしました-静的条件下で得られた4,212 IU / gの3倍以上です²²。

固体発酵のスケールアップには、微生物の動態を維持することと、徐々に大きくなるシステムでの効果的な質量と熱伝達を確保することとの間の微妙なバランスが必要です。従来の段階的アプローチには、実験室(5〜20 kg)、パイロット(50〜5,000 kg)、および工業用(25〜1,000トン)のステージが含まれます。スケールアップ中の主な課題の1つは、代謝熱の放散であり、これは最大3,200 kcal/kgの乾燥材料に達する可能性があり、静的または換気の悪いシステムでは特に問題になります。これに対処するために、スケールアップ戦略では、多くの場合、無次元設計パラメータの制御と、質量およびエネルギーバランス方程式などの数学的モデリングアプローチの適用に依存して、さまざまなスケール間で酸素の利用可能性や基板の水分保持などの主要な変数を維持します。パイロットスケールシステム(150 Lや6 m³など)は、ウォータージャケット、湾曲した攪拌ブレード、制御された湿度などのエンジニアリング機能をうまく組み込んで、プロセスの再現性を向上させ、一貫した製品歩留まりを確保しています18,21,22。

このプロトコルは、小規模な実験室規模での酵素産生に対する有効性を実証しました。しかし、産業用途向けのプロセスのスケールアップには、主に大量の効率的な混合と曝気の維持に関連する大きな課題があります。これらの制限に対処するための有望なアプローチの1つは、連続スクリュー反応器の使用であり、これは、固体基板全体での連続混合と酸素化の改善を促進することにより、垂直ミキサーの機能を模倣しています。この設計は、嫌気性ゾーンの形成を減らし、工業規模での固体発酵の成功のための重要な要素である物質移動を強化します^2,15。それにもかかわらず、潜在的な課題には、固体マトリックスの構造的完全性の維持や、反応器に沿った温度勾配の形成の防止が含まれます。さらなる研究では、プロセスの実現可能性と効率を確保するために、運用パラメータの最適化とスケールアップ条件下での酵素収量の検証に焦点を当てる必要があります。

このプロトコルの潜在的な適用は、食品バイオテクノロジー、バイオエネルギー、環境修復など、複数の分野に広がっています。例えば、キチナーゼやアミラーゼなどの加水分解酵素の産生が促進されることで、農業や工業におけるバイオコンバージョンプロセスをサポートすることができます。さらに、小麦ふすまなどの農産業副産物の使用は、持続可能な慣行と一致しており、廃棄物の価値化を促進し、循環型バイオエコノミーに貢献しています²⁰。

著者は、利益相反がないことを宣言します。

この作業は、Instituto Politécnico Nacional(SIP-IPN)のSecretaría de Investigación y Posgradoによって、GGSに授与された助成金/プロジェクト番号20220487、20230676、20240793、および20251269、およびDROHに授与された20220492、20230427、20240335、および20251139を通じて支援されました。筆者らは、ENCB-IPN、Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación de México(Secihti)、旧称Consejo Nacional de Ciencia、Humanidades y Tecnología (CONAHCyT)、BEIFI-program、Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologías、Instituto Politécnico Nacionalの貴重なご支援に感謝の意を表します。López-Garcíaは、マスターズフェローシップのSecihti(以前のCONAHCyT)とSIP-BEIFIフェローシップのIPNを認めています。Legorreta-Castañedaは、以前はCONAHCyTとして知られていたSecihtiの「Estancias Posdoctorales por México」プログラムからポスドクフェローシップの受賞者です。