アテローム性動脈硬化症マウスモデルにおける大動脈弓および大動脈基部病変の単離と解析

このプロトコルは、アテローム性動脈硬化症のプラークの定量分析のための包括的な方法論を提供し、アテローム性動脈硬化症のメカニズムと進行に関するより詳細な研究を促進します。

心血管疾患の主な原因であるアテローム性動脈硬化症は、病変の発生と進行の詳細な検査を必要とします。この研究では、広く使用されているアテローム性動脈硬化症マウスモデルである低密度リポタンパク質受容体ノックアウト(Ldlr^-/-)マウスにおける大動脈弓および根病変の分離および組織学的分析のための包括的なプロトコルを紹介します。大動脈弓と大動脈根はアテローム性動脈硬化症の病変の重要な部位であり、その検査はアテローム性動脈硬化症の発症、進行、または退行の評価、心血管イベントリスクの予測、および潜在的な治療標的の特定に重要です。このプロトコルでは、組織分離、固定、オイルレッドO染色、大動脈根切片化、ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色、Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色、画像解析など、大動脈弓および大動脈弓根のアテローム性動脈硬化負荷を定量化する方法を概説しています。Oil Red O染色は、大動脈弓のプラーク領域を測定し、アテローム性動脈硬化症の重症度を評価し、大動脈根のHE染色は、脂質コアや線維キャップなどのプラーク成分を明らかにし、プラークの安定性と破裂リスクの評価を容易にします。VVG染色は、組織内のコラーゲン繊維を染色することができ、プラークの組成と関連情報についてさらなる洞察を提供します。この徹底的な分析は、病変発生のメカニズムに関する貴重な洞察を提供し、アテローム性動脈硬化症を予防および治療するための新しい治療戦略の作成を導く可能性があります。

心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症は、世界中で重大な健康負担および主要な死因として浮上しています^1,2。アテローム性動脈硬化症は、脂質が徐々に蓄積し、動脈壁にプラークが形成されることを特徴とする慢性進行性炎症性疾患であり、最終的には動脈内腔の狭窄につながり、プラークの破裂を引き起こし、心筋梗塞や脳卒中などの急性心血管イベントを引き起こします^1,2,3.アテローム性動脈硬化症が人間の健康に与える影響が大きいため、アテローム性動脈硬化症の根底にあるメカニズムを理解し、効果的な治療戦略を開発することが急務となっています。

近年、動物モデルは、アテローム性動脈硬化症の理解を深める上で重要な役割を果たしています。さまざまな種の中で、マウスは、その迅速な繁殖、低い維持コスト、および高度な遺伝子操作技術の利用可能性により、好ましいモデルとして浮上しています^4,5。特に、LDL受容体ノックアウト(Ldlr^-/-)マウスおよびApoE^-/-マウスは、ヒトアテローム性動脈硬化症を模倣するために広く使用されており、それらは同様の病態生理学的特性を示す4,5,6,7,8,9。

マウスのアテローム性動脈硬化性病変は大動脈のさまざまな場所に発生する可能性がありますが、大動脈根基、大動脈弓、腕頭幹など、血行動態に密接に関連する領域で特に発症する傾向があり、下行する大動脈は比較的影響を受けにくい¹⁰。マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化症病変の負荷を正確に評価し、プラークの存在、サイズ、および病期を評価し、それによってアテローム性動脈硬化症の発症、進行、および退行に対するさまざまな薬物または因子の影響を調査するためには、組織学的染色技術と画像解析の組み合わせが不可欠である¹¹。オイルレッドO染色は、確立された方法であり、中性脂質およびリポタンパク質¹²を特異的に染色し、大動脈弓¹³におけるプラーク形成を直接可視化する。一方、大動脈基部のヘマトキシリン-エオシン(HE)染色は、プラーク領域を描写するだけでなく、線維性キャップや脂質壊死コアなどの詳細な構造的特徴も提供します。これらの詳細は、プラークの安定性を評価し、プラーク破裂のリスクを予測するために重要です¹¹。これらの技術を組み合わせることで、アテローム性動脈硬化症病変の重症度と進行の包括的な評価が容易になります。

このプロトコルでは、C57BL6/J Ldlr^-/- マウスを例に、Chow食餌と西洋食餌を与えられたマウスを取り上げ、大動脈弓のOil Red O染色とパラフィン包埋大動脈根切片のHE染色を使用してマウスのアテローム性動脈硬化病変の負担を評価するための詳細なステップバイステップガイドを提供することを目的としています。このプロトコルは、大動脈の単離と固定、パラフィンの包埋と切片化、染色手順、画像解析のすべての側面をカバーしながら、主要なステップの操作詳細と考慮事項を組み込んで、結果の再現性と信頼性を確保します。このプロトコルに従うことで、研究者は治療介入の有効性を正確かつ効率的に評価し、アテローム性動脈硬化症の根底にあるメカニズムについての洞察を得ることができます。

この研究で使用されたすべての動物プロトコルは、上海体育大学の動物実験のための倫理審査委員会によって承認されました。

1. 試薬・解剖ツールの準備

1. 細いハサミ、ストレート鉗子、湾曲した鉗子、スプリングハサミ、ピンなどの解剖器具は、事前にオートクレーブで滅菌してください。
2. 75%エタノール:75mLの無水エタノールと25mLの_ddH2Oを混合します。
3. 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS):0.01 M PBS粉末を2 LのddH₂Oに溶解します。
4. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液:1x PBS800 mLをドラフト内のマグネチックスターラーで約60°Cに加熱します。パラホルムアルデヒド粉末40gをゆっくりと加え、連続的に攪拌します。完全に溶解するまで1N NaOHで滴定します。室温まで冷却し、1x PBSで容量を1 Lに調整し、ろ過し、pHを7.2〜7.4に調整します。
   注意: PFAは危険な化学物質であり、慎重な取り扱いと安全プロトコルの厳格な遵守が必要です。
5. オイルレッドOのストッキング液:100%イソプロパノール500mLにオイルレッドO粉末2.5gを溶解し、茶色のボトルに密封し、4°Cの冷蔵庫で長期保存してください。
   注意:イソプロパノールは有毒で有害な化学物質です。したがって、健康と安全を確保するためには、手袋を含む必要な個人用保護具(PPE)を着用することが不可欠です。
6. オイルレッドOの作業溶液:ストッキング溶液と滅菌ddH₂Oを3:2の比率で混合します。使用するたびに新鮮なものを準備し、0.22 μmの滅菌シリンジフィルターまたは大きな濾紙で溶液をろ過します。
7. Victoria Blue'B染色液:0.5 gのVictoria Blue'Bを100 mLの70%エタノールに溶解します。

2.大動脈と心臓の分離

1. すべてのマウスをケージあたり3〜5匹で、12時間の明暗サイクルで、温度制御された環境で飼育し、0.2%のコレステロールと21.2%の脂肪を含む標準的なチャウダイエット(chow)またはウエスタンタイプのダイエット(WTD)のいずれかを与えます。C57BL6/J LDLr-/-生後12週齢で体重が25〜30gの雄マウスを選択します。CO₂ チャンバーでマウスを生け贄にします。
2. 解剖する前に、マウスを仰臥位(腹側を上にして)に、吸収紙を1〜2層重ねた発泡スチロールボードの上に置き、四肢をピンで固定します。
3. マウスの腹部に75%エタノールをスプレーして、毛皮をきれいにし、湿らせます。
4. 鉗子を使用してマウスの腹側の皮膚をつかみ、細かいハサミを使用して腹部の付け根から首の上部までの皮膚を切断します。
5. 腹壁を開き、鉗子を使用して胸骨を持ち上げ、横隔膜と肋骨の両方を切開して胸腔を露出させます。
6. 食道と気管を切除すると、頸動脈の清掃が容易になります。腹膜の後ろにある腎臓と脊椎の横にある腹部大動脈を温存しながら、肝臓、肺、脾臓、胃腸管、膵臓などの臓器を切除します。腸間膜動脈を解剖するときは、腹部大動脈の損傷を避けるために、腸を持ち上げて大動脈から離して切開してください。
7. 明確な観察フィールドを提供するために、マウスを実体顕微鏡の下に置き、冷光源を解剖領域に合わせます。
8. PBSを充填した10mLシリンジに0.45 x 15(II)RWLB針をゆっくりと注入し、大動脈の拡張を観察します。
9. 解剖部の血液と体液をティッシュペーパーでやさしく拭き取り、視野を完全に露出させます。
10. 胸部大動脈は露出しやすいです。胸部大動脈の先端に付着している横隔膜の部分を鉗子でつかみ、大動脈と胸部筋壁の間の結合組織をスプリングハサミで切り裂くことで、突破口として使用します。
11. 鉗子で心臓をそっと引っ張り、大動脈弓の枝を観察しながら胸部大動脈を持ち上げ、大動脈弓の周りの外膜脂肪と結合組織とその枝を胸部大動脈に沿って上向きに解剖します。
    注:注意して、大動脈を無傷に保ち、大動脈を引き裂いたり傷つけたりしないようにし、周囲の脂肪と結合組織を完全に取り除いてください。このステップでは、熟練した操作を実現するために繰り返し練習する必要があります。
12. 腹部大動脈と総腸骨動脈を胸部大動脈に沿って下向きに解剖します。
13. 総腸骨動脈を分岐部から1〜2 mm下に切断し、脊椎に沿って大動脈の小さな枝をトリミングして解放し、腎臓の近くの腎動脈を切り離し、首の3つの枝血管を遠位端から切断し、最後に心臓の近くの上行大動脈を切断します。
14. 大動脈弓を解剖する前に、その下の血管とコントラストの高い小さな暗い色のガスケットを配置し、大動脈弓領域を撮影します。
15. 心臓組織をトリミングし、心房に平行な平面に沿って心臓の下半分を切断します。トリミングされたハートを固定します(図1A)。

3. 大動脈弓の固定と前処理

1. あらかじめ1.5 mLの遠心チューブに4% PFA溶液1 mLを調製します。
2. 大動脈をチューブに入れ、室温で少なくとも24時間固定します。
   注:大動脈は、オイルレッドO染色の品質に影響を与えることなく、4%PFAで最大1ヶ月間保存できます。通常の形状を維持するためには、固定前に組織をゴムの上に置くことが適切な選択肢となります。
3. 大動脈をPBS入りのシャーレに移し、乾燥を防ぎます。実体顕微鏡下で、鉗子とスプリングハサミを使用して、大動脈内のプラークの定量化への干渉を減らすために、解剖中に完全に剥がれなかった残りの外膜脂肪を慎重に除去します。
4. スプリングハサミを使用して、大動脈を内側の縦軸に沿って慎重に切り開き、次に大動脈弓の外側に沿って大動脈弓の3つの枝を大動脈弓の湾曲のレベルまで順次切り開き、大動脈弓が完全に広がるようにします(図1C)。
5. この段階では、オイルレッドO染色に使用するか、4%PFAで保存してください。

4. 大動脈弓のオイルレッドO染色

1. カットオープンした大動脈を12ウェルプレートに入れます。滅菌ddH₂Oを各ウェルに1 mL加え、シェーカーで5分間洗浄し、2回繰り返します。
2. 取り除いた溶液を入れた12ウェルプレートをドラフトに置き、ウォーターマークが見えなくなるまで20分間風乾します。
3. 調製したばかりのオイルレッドOワーキング溶液1mLを各ウェルに加え、シェーカーで20分間振とうした後、オイルレッドOワーキング溶液を取り出します。
4. 滅菌済みddH₂Oを2 mLずつ各ウェルに加え、5分間洗浄し、この手順を3回繰り返します。その後、大動脈をddH₂Oに保ちます。
5. 大動脈をスライドに置き、実体顕微鏡で広げます。コントラストを高めるには、スライドの下に黒いゴムパッドを置きます。
6. コントラストをさらに高めるために白い紙の上にスライドを置き、その横に定規を置き、カメラで写真を撮ります。大動脈を湿らせておくために、処理した大動脈を1mLのPBSが入った1.5mLの遠心チューブに保管します。.

5. 大動脈弓の画像解析

1. 撮影した大動脈画像をImage Jソフトウェアを搭載したパソコンで開きます。
2. 大動脈全体を含む 450 ピクセル x 900 ピクセルなどの長方形のボックスの領域を選択し、新しい.tiff画像として保存します。
3. 新しく保存した.tiff画像を画像Jで開き、[ 編集]>[反転]をクリックし、[画像]を選択して[ RGBスタック>タイプ]をクリックします。
4. [画像]に移動し、[ スタック]>[スタックから画像]をクリックして、コントラストが最も高い緑色のものを選択します。
5. [画像]に移動し、[ 明るさ/コントラスト>調整]をクリックします。最小値を約 200 に変更し、各画像の背景をほぼ同じに保ちながら背景を最小化し、[ 適用] をクリックします。
6. 「分析」に移動し、「 測定を設定」を選択します。 「Area」、「Area Fraction」、「Limit to Threshold 」、「 Display Label」を選択し、「 OK」をクリックします。
7. 「分析」に移動し、「 測定 」を選択して、結果をスプレッドシートにコピーします。
8. 「Analyze」に移動し、「 Tool > ROI Manager」をクリックしてから、長方形のボックスが付いた大動脈のアーチ部分を選択します。ROI マネージャーに移動し、[ 追加 [t] ] を選択し、次に [測定] を選択します。測定結果をスプレッドシートにコピーします。
9. マウスのグループで測定された面積を正規性検定に基づいて解析します。p < 0.05 は、差が統計的に有意であることを示します。
   注:実験のデザインに応じて適切な統計的方法を選択してください。

6.心臓のパラフィン埋め込み

1. 心臓の頂点を取り外し、切開部がまっすぐで、弁の根元の方向と整列していることを確認します(図1B)。
2. 各心臓サンプルをパラフィン包埋ボックスに個別に入れ、鉛筆でボックスに印を付けます。
3. ヒュームフードに、パラフィン包埋カセットとティッシュを空の容器に入れ、包埋ボックスを流水で3分間すすぎます。
4. 次のように濃度勾配を増やしながらエタノールを使用して組織脱水を行います:50%エタノールで2時間、75%エタノールで30分間、85%エタノールで30分間、95%エタノールで30分間、および100%エタノールで10分間。各ステップでエタノールを交換して手順を繰り返します。
5. キシレンとエタノールの1:1混合物を20分間、キシレンを15分間、キシレンを15分間、キシレンを変えてこの1xを繰り返します。
6. パラフィンワックスを60°Cのオーブンで事前に溶かしてください。キシレンとパラフィンの混合物でサンプルを30分間処理し、続いてパラフィンソフトワックスを2時間、次にパラフィンハードワックスを1時間処理します。
   注意:エタノールは可燃性で揮発性の有機溶剤です。キシレンは中程度の毒性があり、使用する場合は保護が必要です。
7. パラフィン埋め込み
   1. 適切なサイズの金型を選択して電源を入れ、事前に埋め込み機を温めてください。
   2. 溶融パラフィンワックスを鋳型に加えた後、包埋カセットから組織を取り出し、あらかじめ加熱しておいた鉗子を用いて、切断面を下に向けて型の中央底部に位置決めします。
   3. 型が冷凍テーブルで冷え、中のパラフィンが固まったら、示された埋め込みカセット蓋を型の上に置き、必要な量のパラフィンを充填します。
   4. パラフィンワックスが冷えて固まったら、ブロックを型から取り出し、4°Cの冷蔵庫に保管します(図1D)。

7. 大動脈基部のパラフィン切片

1. 埋め込みカセット蓋の周りの余分なパラフィンを洗い流し、パラフィンスライサーのヘッドにあるクランプシートにパラフィンブロックをしっかりと貼り付けます。スライスがカットされる位置からわずかにずれた位置にブロックを調整し、パラフィンブロック内の組織切片がブレードの刃先と平行になるようにします。最初の切片化では、組織の位置を明らかにするために、スライスの厚さを10μmに設定します。
2. 顕微鏡で最初の切開部が見つかったら、スライスの厚さを6μmに調整し、連続切片化を行います。スライサーで切片を切断、スライス、ピックし、顕微鏡で3つの無傷の大動脈弁が見えるまで、切片化の準備が始まります。各マウスにつき1つのスライスを6μm間隔で残し、セクション1-11-21-31など、異なるガラスキャリアに異なるスライス位置を配置して、適切な概要を取得します。
3. 37°Cの温水が入ったスプレッダーに切片を浮かせて組織を平らに広げ、スライドで組織をピックアップします。水が乾くのを待った後、スライスを42°Cに設定したトースターに一晩置きます。
4. これらの8つのセクションの平均プラーク面積は、各マウスの大動脈根プラーク面積の値を表しています。これらの切片を染色した後、平均プラーク面積とプラーク面積を測定します。

8. ヘマトキシリンエオシン染色

1. スライスを60°Cの乾燥機に30分間置きます。ドラフト内で、染色ラックを使用して、切片をキシレンに10分間(この手順を1回繰り返し、キシレンを交換します)、100%エタノールを5分間(この手順を繰り返し、エタノールを交換します)、95%エタノールを5分間、85%エタノールを5分間、75%エタノールを5分間連続して配置します。
2. 流水で5分間すすいでください。切片をヘマトキシリン染色液に8分間浸し、流水ですすいでください。
3. 1%塩酸アルコールで切片を数秒間区別し、流水ですすぎ、顕微鏡下で切片が青紫色に変わるのを観察します。
4. 切片をエオシン染色溶液に5分間浸漬します。切片を95%エタノールに7回浸し、次に100%エタノールに30秒間入れます。
5. キシレンで少なくとも30秒間透明にします。中性ガムを使用してスライドを密封し、顕微鏡で写真を撮り、高解像度の画像をできれば.tiff形式で保存します。

9. Verhoeff-Van Gieson (VVG) 染色

1. パラフィン切片で定期的な脱ろうと水分補給を行います。これは、セクション8.1および8.2で概説されているのと同じ手順に従います。
2. 70%エタノールで短時間すすいだ後、切片をVictoria Blue'B染色溶液に15分間浸漬します。
3. 95%エタノールで数秒間、切片を区別します。切片を蒸留水で2回洗います。
4. 切片をPonceau染色溶液で5分間液滴塗布して染色します。100%エタノールを使用して切片を分化し、脱水します。
   注:ポンソー染色後は、水との接触を避けてください。
5. キシレンで少なくとも30秒間透明にします。スライドを中性ガムでマウントし、顕微鏡で撮影します。

10. 大動脈根プラークの画像解析

1. Image Jソフトウェアを搭載したコンピューターで画像を開きます。任意のボックスツールを選択して、プラークをボックス化します。
2. [画像]に移動し、[ オーバーレイ]>[選択項目の追加]をクリックし、[ 測定 ]をクリックしてプラークの面積を測定します。測定結果をスプレッドシートにコピーします。
3. 正規性検定に基づいてマウスのグループで測定された面積を分析します。p < 0.05 は、差が統計的に有意であることを示します。

代表的な結果は、アテローム性動脈硬化症マウスモデルにおける大動脈弓および大動脈根病変に対する分離および分析技術の適用を示しています。これらの結果は、アテローム性動脈硬化症の病変を特定し、特徴付ける技術の能力の明確な証拠を提供します。例えば、特定の染色を有する組織学的画像(オイルレッドOなど)は脂質の蓄積を強調し、ヘマトキシリンおよ...

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何も宣言する必要はありません。

この研究は、上海フロンティア運動代謝健康科学研究基地、上海体育大学の運動と公衆衛生の研究プログラム(0831)、上海高等教育青年教師養成資金プログラム(A2-0213-22-0058-5)、上海市科学技術委員会上海の優れた学術指導者計画(21XD1403200)の支援を受けました。