TGF-β1を介したCFBE細胞のRISCへのmiRNAの動員を研究するためのAgo2-miRNA-co-IPアッセイ

ここでは、ヒト気管支上皮CFBE41o-細胞のTGF-β1によって誘導される特異的miRNAの活性プールを定量するために設計されたAgo2-miRNA-co-IPアッセイについて説明します。このアッセイは、特定の miRNA プライマーと TaqMan 加水分解プローブを使用した qRT-PCR によって定量された、RNA 誘導サイレンシング複合体への miRNA の動員に関する機能情報を提供します。

マイクロ(mi)RNAは、転写後メカニズムによってRNA干渉(RNAi)を媒介する短いノンコーディングRNAです。特定のmiRNAは、細胞質RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)にリクルートされます。RISCの必須成分であるArgonaute2(Ago2)は、mRNAの標的部位へのmiRNAの結合を促進し、続いてmiRNA-mRNA二本鎖を切断し、そのエンドヌクレアーゼ活性を促進します。RNAiは、RISCにリクルートされたmiRNAの特定のプールによって媒介されるため、機能プールと呼ばれます。多くのmiRNAの細胞レベルは、サイトカインTransforming Growth Factor-β1(TGF-β1)の影響を受けます。しかし、TGF-β1がこれらのmiRNAの機能プールに影響を与えるかどうかについては、ほとんどわかっていません。本稿で取り上げるAgo2-miRNA-co-IPアッセイは、TGF-β1がRISCへのmiRNAの動員に及ぼす影響を調べるように設計されており、細胞のmiRNAレベルの変化がRISC関連の機能プールの変化と相関しているかどうかを判断するのに役立ちます。アッセイの一般原理は次のとおりです。TGF-β1またはビヒクルコントロールで処理した培養細胞を溶解し、内因性Ago2を固定化抗Ago2抗体で免疫沈降させ、Ago2と複合体を形成した活性miRNAをRISC免疫沈降(RIP)アッセイキットで単離します。miRNA は、逆転写中に miRNA 特異的ステムループプライマーを使用した定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) で同定され、続いて miRNA 特異的なフォワードプライマーとリバースプライマー、および TaqMan 加水分解プローブを使用した PCR で同定されます。

Transforming Growth Factor-β1(TGF-β1)は、多くのmicro(mi)RNAの発現を変化させることができる多機能サイトカインです^1,2,3。特定のmiRNAの特定の部分のみがRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれてRNA干渉(RNAi^)を行うため、特定のmiRNAの全細胞レベルはその阻害電位と相関しません3。各miRNAの最大10%のみがRISCに結合し、RNAi^{に関与しています4,5}。次に、RNAiプロセスでは、RISC関連miRNAが標的mRNA認識配列に結合します⁶。RISCの会合は、標的mRNAの利用可能性と、通常は^mRNA4の3'非翻訳領域(UTR)に存在する結合部位に対するmiRNAの相補性によって影響を受けます。本稿に記載されているArgonaute2-miRNA-co-免疫沈降(Ago2-miRNA-co-IP)アッセイは、TGF-β1処理後のRISC関連miRNAの違いを検出することにより、特定のmiRNAのRISCへの動員に対するTGF-β1の影響を調べるように設計されています。特定のmiRNAのRISC関連機能プールを調べることは、miRNAの全細胞レベルを調べるよりも、miRNAの影響についてはるかに有益です。RISCは、標的mRNA上の結合部位をスキャンし、miRNA-mRNA二本鎖を切断するタンパク質で構成されています。Argonaute2(Ago2)はRISCの主要コンポーネントです。5つのAgoアイソフォーム(Ago1-Ago5)のうち、Ago2はエンドヌクレアーゼ活性を持ち、ヒト細胞7,8,9,10のRNAiに関与する唯一のものです。Ago2-miRNA-RISC複合体は、miRNAを介した転写後mRNA抑制の機能単位である¹¹。Ago2 関連 miRNA は、細胞内または細胞外のシグナル伝達に応答した miRNA の天然状態を表します。したがって、内因性Ago2の免疫沈降は、特定のmiRNAの活性RISC関連画分を検出し、その標的の機能評価を行う絶好の機会を提供します。このアッセイは、ビオチン化核酸分子の細胞内取り込みの予測不可能な効率とそのオフターゲット効果により、ビオチン化miRNA模倣体を用いた内在性標的mRNAのプルダウンよりも優れています。

本稿で取り上げたAgo2-miRNA-co-IPアッセイは、不死化ヒト気管支上皮CFBE41o-細胞^におけるmiRNAのRISC動員に対するTGF-β1の効果を決定するために最適化されました3。RIPアッセイキットのコンポーネントを使用して、メーカーから提供されたプロトコルに変更を加えたAgo2-miRNA-co-IPアッセイを実施しました。分離法を使用してsmall RNAとlarge RNAを単離し、逆転写中にmiRNA特異的なステムループプライマーを使用した定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)の助けを借りて、small RNAを使用してmiRNAを定量し、続いてmiRNA特異的なフォワードプライマーとリバースプライマー、およびTaqMan加水分解プローブを使用してPCRを行いました。

1. 実験前の準備

1. 細胞の播種
   1. Minimal Essential Medium(MEM)で10%コラーゲンI溶液を調製し、6ウェルプレートの各24 mm細胞培養フィルターに500 μLを加えます。手で軽く回転させてフィルターの全面を覆うように分散させます。層流フード内のUV光の下で室温で30分間(分)インキュベートした後、細胞培養インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートします。
   2. 細胞培養培地(CO₂ で20分間ガス化したMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)、50 U/mLペニシリン、50 U/mLストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、0.5 μg/mLピューロマイシン)を調製します。
   3. コラーゲンコーティングされたフィルター(ステップ1.1.1)をインキュベーターから取り出し、余分なコラーゲンを吸引します。6ウェルプレートで、1.5 mLの細胞培養培地(ステップ1.1.2)を基底側に、0.5 mLをアピカル側(フィルター上)に加えます。
   4. CFBE41o-細胞¹²のシード1 x 10⁶を細胞培養培地500μLに懸濁した。プレートを手で静かに回転させて、細胞をフィルター上に均等に分散させ、細胞培養インキュベーターで37°C、5%_CO2でインキュベートします。
   5. 細胞を播種した1日後に頂端側から培地を取り出し、空気-液体界面(頂端側に培地がない)で細胞の培養を続けます。基底外側培地を毎日交換し、8^日目 に実験を行います。
2. TGF-β1またはビヒクルコントロールによる細胞の処理
   1. FBSフリー細胞培養培地(FBSフリー培地)を調製する:5% CO₂ を含むガスMEMを20分間、50 U/mLペニシリン、50 U/mLストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを加え、培地をろ過滅菌します。
   2. ビヒクルコントロールの準備:20 μL の 1 M HCl と 5 mg の BSA を 5 mL の二重蒸留水 (4 mM HCl と 1 mg/mL BSA) に加えて、1 ng/μL のストック溶液を得ます。使用前に混合物をろ過滅菌してください。
   3. TGF-β1溶液を調製する:凍結乾燥TGF-β11 μgを滅菌ろ過ビヒクル(4 mM HClおよび1 mg / mL BSA)1 mLに再構成して、1 ng /μLストック溶液を取得します。少量で分注し、-20°Cで保存します。
   4. 15 ng/mL の FBS フリー培地で TGF-β1 またはビヒクルコントロールの使用濃度を調製します (1 mL の FBS フリー培地につき 15 μL の TGF-β1 またはビヒクルコントロールストック溶液を添加します)。細胞培養培地を基底外側側から吸引し、実験の24時間前にTGF-β1またはビヒクルコントロール含有培地を添加します。
3. 細胞溶解および免疫沈降のためのバッファーの調製
   1. 細胞溶解用のmi-Lysisバッファー(+)を調製します。1 mL の容量あたり 1 錠のプロテアーゼ阻害剤 mini と 15 μL の 1 M DTT を RIP-Assay Kit に付属の mi-Lysis バッファーに加えます。
   2. プロテインGアガロースビーズを洗浄するためのmi-Washバッファー(+)を調製します。容量35 mLあたり52.5 μLの1 M DTTを、RIP-Assay Kitに付属のmi-Washバッファーに添加します。
4. 抗Ago2抗体とプロテインGアガロースビーズのコンジュゲーション
   1. プロテインGアガロースビーズスラリー(50%)の30μLアリコート2個を別々に洗浄します:氷冷PBS100μLを加え、穏やかに混合し、2,000 x g で1分間遠心分離し、200μLピペットで上清を吸引します。
   2. 氷冷したmi-Wash Buffer(+)100μLでビーズを一度洗浄し、200μLのピペットで上清を吸引し、500μLのmi-Wash Buffer(+)をビーズに加え、穏やかに混合します。チューブを氷の上に保ちます。
   3. 7.5 μgのマウスモノクローナル(IgG2)抗ヒトEIF2C2(Ago2)抗体( 材料表を参照)または非特異的マウスIgG2(ネガティブコントロール)をmi-Wash Buffer(+)中のプロテインGビーズスラリーに添加します。
   4. チューブを一晩インキュベートし、冷蔵室で毎分8回転(rpm)で回転させます。

2. Ago2の免疫沈降

1. 細胞の溶解
   1. 24 mmフィルターで培養した細胞を入ったプレートを細胞培養インキュベーターから取り出し、氷冷PBSで満たされた氷上のプレートにフィルターを迅速に移します。PBSがフィルターの頂端側にオーバーフローして細胞を覆うようにします。
   2. 片面ずつPBSを吸引し、頂端側と基底外側を氷冷したPBSで2回洗います。
   3. すべてのPBSを吸引し、300 μLの氷冷mi-Lysisバッファー(+)を細胞に加え、細胞をこすり落とし、それぞれの治療条件(TGF-β1またはビヒクル制御)用にマークされた1.5 mLチューブに移します。
   4. 200 μLのmi-Lysisバッファー(+)を各チューブに加え、十分にボルテックスします。
   5. チューブを氷上で15分間インキュベートします。
   6. チューブを14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を細胞溶解物として回収し、氷上に保ちます。
2. 非標識プロテインGアガロースビーズによる細胞ライセートのプレクリア
   1. 1.5 mLチューブに30 μLの新鮮プロテインGアガロースビーズスラリー(50%)を100 μLのPBSと3回洗浄し(ステップ1.4.1)、余分なPBSを取り除きます。
   2. ビーズを500 μLのmi-Wash Buffer(+)で1回、500 μLのmi-Lysis Buffer(+)で1回洗浄します。余分なバッファーを削除します。
   3. ステップ2.1.6の細胞ライセートを、非標識タンパク質Gビーズを含むチューブに添加します。
   4. コールドルームでチューブを1時間回転(8rpm)して、細胞溶解物を事前に透明にします。
   5. プレクリア後、チューブを2,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。 事前にクリアしたライセートを上清として新しいチューブに集め、氷上に保ちます。
   6. ウェスタンブロッティングによるAgo2タンパク質の検出のために、免疫沈降前全細胞ライセート(WCL)を調製します。10 μLのプレクリアライセートを取り、10 μLのサンプルバッファー(10% DTTを含む)を加え、85°Cで4分間加熱し、ベンチで冷却し、-20°Cで保存します。
3. プロテインGアガロースビーズに固定化された抗Ago2抗体を有するAgo2複合体の免疫沈降
   1. ステップ1.4.4で調製したプロテインGビーズに結合した抗Ago2抗体を2,000 x g で4°Cで1分間遠心分離し、上清を除去して廃棄します。ビーズを500 μLのmi-Lysis Buffer(+)で一度洗浄し、前回と同様に遠心分離し、上清を再度廃棄します。
   2. ステップ2.2.6で調製した500 μLの細胞ライセートを、プロテインGビーズで標識した抗Ago2抗体と混合し、冷蔵室で3時間回転(8 rpm)インキュベートします。
   3. 氷上の冷蔵室からチューブをベンチトップに運び、2,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。 次に、上清を取り除いて捨てます。
   4. プロテインGアガロースビーズを、共免疫沈降したmiRNAを含む固定化抗Ago2抗体-Ago2複合体で1 mLのmi-Washバッファー(+)で洗浄し、2,000 x g で4°Cで1分間遠心分離し、上清を捨てます。このプロセスを 2 回繰り返します。
   5. ビーズを1 mLのmi-Wash Buffer (+)で再懸濁し、100 μLのスラリーを新しいチューブに含んで、免疫沈降後のタンパク質サンプルをウェスタンブロッティング用に調製します。
   6. チューブを2,000 x g で4°Cで1分間遠心分離し、上清を捨てます。
   7. サンプルバッファー20μL(10% DTT)を加え、85°Cで5分間加熱し、混合し、室温で2,000 x g で1分間遠心分離します。サンプルは-20°Cで保存してください。
   8. ステップ 2.3.5 の残りの 900 μL の固定化抗 Ago2 抗体-Ago2 複合体を 2,000 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離し、吸引して上清を捨てます。サンプルを氷の上に保ちます。

3. RNAの単離

1. 次のステップでsmall RNAおよびlarge RNAを単離するために、サンプルあたり2本の1.5 mLチューブを標識し、ステップ3.5および3.8で使用するmi溶液IVを各チューブに2 μL追加します。
2. サンプルごとに、RIPアッセイキットから10 μLのmi-solution Iと240 μLのmi-solution IIを1.5 mLチューブに加えて、マスターミックス溶液を調製し、チューブを室温に保ちます。
3. 固定化抗Ago2抗体-Ago2複合体(ステップ2.3.8で調製)を含む各チューブに250 μLのマスターミックスを加え、ボルテックスで2,000 x g で室温で1分間遠心分離します。
4. 同じチューブに150 μLのmi-solution IIIを加え、よく混合します。その後、2,000 x g で室温で2分間遠心分離します。このステップの上清には、低分子RNA(すなわち、全RNA)に加えて、高分子RNAが含まれています。
5. ステップ3.1で調製した2μLのmi溶液IVを含むチューブに上清を慎重に移します。上清をビーズで汚染してqRT-PCRに干渉しないようにしてください。
6. 全RNAを含む各チューブに氷冷した2-ポパノール300 μLを加え、ボルテックス、スピンダウンし、-20°Cで2時間インキュベートして、大きなRNAを最適に沈殿させます。
7. -20°Cでのインキュベーション後、サンプルを12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清とペレットに含まれる小さなRNAと大きなRNAをそれぞれ分離します。ステップ3.11までペレットを氷の上に保ちます。
8. ステップ3.1で調製したチューブ(2 μLのmi-solution IVを含む)に低分子RNAを含む上清を移し、500 μLの氷冷した2-プロパノールを加え、ボルテックスしてスピンダウンします。
9. 上清を-20°Cで一晩インキュベートし、低分子RNAを最適に沈殿させます。
10. 翌日、-20°Cの冷凍庫から低分子RNAを含むチューブを取り出し、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 ペレットを乱さずに上清を吸引し、ステップ3.11に従って、ほとんどのsmall RNAを含むペレットを洗浄します。
11. 大きなRNAを含むペレット(ステップ3.7)と小さなRNA(ステップ3.10)をそれぞれ500μLの氷冷した70%エタノールですすいでください。ペレットを氷冷した70%エタノールとゆっくりと混合し、次いで12,000 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 ペレットを乱さずに、上清を慎重に吸引します。もう一度洗濯のプロセスを繰り返します。
12. 少量(10μLまたは20μL)のピペットで残りのエタノールを吸引し、RNaseフリー環境で室温で30分間風乾させます。
13. small RNAおよびlarge RNAペレットを再構成するには、50 μLのヌクレアーゼフリー水を加え、65°Cで5分間加熱します。その後、ナノドロップでRNAの品質と濃度を確認した後、さらに使用するまでRNAを-80°Cで保存します。

4. 定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)によるmiRNAの定量

1. miRNA Specific Stem-looped Primers による miRNA の逆転写による cDNA 調製
   注:標準的なqRT-PCRによるRNA検出には、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの長さの少なくとも2倍の長さのテンプレートが必要であり、それぞれ約20ヌクレオチドの長さが必要です。したがって、最小長は少なくとも40ヌクレオチドであり、低分子RNAは検出するには短すぎます。このプロトコールでは、標的cDNAを長くする安定性の高いステムループ構造を含むmiRNA特異的RTプライマー(Table of Materials)について説明しています。フォワードPCRプライマーは、ヌクレオチドで長さを追加し、融解温度を最適化し、アッセイの特異性を高めます。リバースプライマーはステムループ¹³を破壊する。次のプロトコルでは、miRNA 逆転写キット (Table of Materials) を使用して、miR-145-5p、miR-143-5p、および miR-154-5p の RNA から cDNA への RT について説明します。
   1. 100 mM dNTP(0.3 μL)、逆転写酵素(2 μL)、10x RT バッファー(3 μL)、RNase 阻害剤(0.38 μL)、miRNA 特異的ループプライマー(6 μL)、およびヌクレアーゼフリー水(8.32 μL)を添加して、各 miRNA のマスターミックスを調製します。マスターミックスの合計容量は20μLです。
   2. ステップ 3.13 の 10 μL の small RNA (50-100 ng) を、miR-145-5p、miR-143-5p、および miR-154-5p の各 cDNA について、3 本の別々の 200 μL チューブに加えます。
   3. マスターミックスをsmall RNAに加え、穏やかに混合し、チューブの底まで回転させます。サーマルサイクラーにロードされるまで、チューブを氷の上に保ちます。
   4. シングルサイクルのサーマルサイクラーでプログラムを16°Cで30分間保持し、42°Cで30分間保持し、85°Cで5分間保持し、4°Cで保持するように設定します。 反応量を30.0μLに設定します。ステップ 4.1.6.1 を参照してください。
   5. 反応チューブをサーマルサイクラーにロードします。RT 実行を開始します。ステップ 4.1.6.2 を参照してください。
   6. サーマルサイクラー のスイッチを入れ 、チューブをトレイに入れます。「システムが起動しています。お待ちください」と表示されます。 [Browse/New Methods] をクリックします。メソッドを保存し、メニューを参照して別の実験で使用します。以前に保存したメソッドのリストから選択して実行を開始するか、「新しい」メソッドを作成します。「編集実行」方式または「新規」方式の画面が表示されます。
      1. ステップ4.1.4で説明したように、温度とサイクルを編集します。ステージとステップを追加または削除するには、特定のステージまたはステップをクリックし、[追加]または[削除]ボタンをクリックします。 [保存 ]をクリックするか、プログラムを直接実行します。 Save Run Methodでは、runメソッドを「run」と命名し、反応量(30 μL)を設定し、カバー温度を105°Cに設定して保存し、終了します。
      2. 「実行方法の参照」画面が表示されたら、「実行方法」の一覧から保存した方法を選択します。 「実行開始 」をクリックし、反応量とカバー温度を再度確認します。[ 今すぐ実行を開始]をクリックします。画面には、サンプル温度、カバー温度、残り時間が表示されます。完了後の開始時間と停止時間を記録し、サーマルサイクラーからチューブを取り外します。
         注:cDNAを含むチューブは、miRNAのqPCRにさらに使用するまで、-20°Cで保存できます。
2. miRNA 特異的フォワード/リバースプライマーおよび加水分解プローブによる qPCR
   注:次のプロトコルは、ステップ4.1で調製したmiRNA特異的cDNAを使用したmiR-145-5p、miR-143-5p、およびmiR-154-5pのqPCR用です。シングルチューブmiRNAアッセイ(20x)には、miRNA特異的なフォワード/リバースプライマーと加水分解プローブが含まれています(材料表)。フォワードプライマーはヌクレオチドを添加して長さを伸ばし、融解温度を最適化し、リバースプライマーはcDNA¹³のステムループを破壊します。Universal PCR Master Mix(材料表)は、qPCRに必要な追加成分を提供します。反応(20 μL)は、各miRNAに対してトリプリケートで行われます。
   1. miR-145-5p、miR-143-5p、miR-154-5p のトリプリケート用のマスターミックスを、それぞれの miRNA アッセイ (20x) (1 μL)、2x Universal PCR Master Mix (AmpErase UNG; 10 μL)、およびヌクレアーゼフリーウォーター (7.5 μL) を使用して、別々のマスターミックスを調製します。1回の反応の総容量は18.5μLです。
   2. 4.1で調製したmiRNA特異的cDNA(1.5 μL)をPCRプレートの各ウェルに3回ずつ加えます。
   3. ステップ 4.2.1 で調製した miRNA 特異的マスターミックス (18.5 μL) を、それぞれの cDNA を含む PCR プレート (1.5 μL) のウェルに加えます。
   4. プレートを適切なシーラーでシールし、qPCRサーモサイクラーでqPCRを45サイクル実行します(材料表)。サイクル温度を95°Cで10分間保持し、その後95°Cで15秒間(s)、60°Cで60秒間を45回繰り返すように設定します。ステップ 4.2.6 を参照してください。
   5. プレートごとにqPCR曲線のベースラインを手動で設定し、すべてのサンプルの増幅が対数になるポイントで、すべてのqPCRランの標準化されたしきい値を設定します。
   6. サーマルサイクラー のスイッチを入れ 、PCRプレートをトレイに入れます。サーマルサイクラーマシンは、付属のコンピューターにインストールされたソフトウェアで動作します。システムソフトウェアのアイコンをクリックします。
      1. [新しいドキュメントを作成]または[既存のドキュメントを開く]をクリックします(以前に保存したドキュメントがある場合)。新しいドキュメントウィザードが表示されます。アッセイは「標準曲線(絶対定量)」となります。[次へ]をクリックします。
      2. 新しい検出機能を追加します。[ Create Another] をクリックして、ディテクタに miR-143、miR-145、miR-154 という名前を 1 つずつ付けます。レポーター色素として「FAM」を全て選択し、「 OK」をクリックします。次に、miR-143、miR-145、miR-154 という名前を見つけ、[ 追加] をクリックして検出器のドキュメントに追加します。次に、「 次へ」をクリックします。
      3. 「サンプルプレートのセットアップ」が表示されます。検出器のウェルを選択し、[ 使用 ]をクリックして対応する検出器を選択します。次に、[ 完了]をクリックします。システムが初期化中であることを示します。
      4. 機器に移動し、ステージを設定しますtage、温度、および手順4.2.4で説明した時間。サンプル容量を20μLに設定します。次に、[開始] をクリックして実行を開始します。次に、プレートを名前を付けて目的の場所に保存します。推定時間は、スタートボタンの近くの画面に表示されます。時間を書き留めます。
      5. 完了したら、[ ファイル ] | エクスポート | 結果、および結果をCT値として目的の場所に保存します。CT値は.csvファイルになります。それを開き、値をスプレッドシートファイルにコピーします。
   7. TGF-β1処理サンプルの平均Ctから、ビヒクル制御処理サンプルの三重閾値サイクル(Ct)の平均を差し引き、ΔCtを算出します。最後に、式 ^2-ΔCt を使用して miRNA レベルの倍率変化(FC)を計算します。FC 値の log2 変換は、グラフィカルな表現に使用できます。

我々は以前に、TGF-β1がCFBE41o-細胞におけるmiR-145-5p、miR-143-5p、およびmiR-154-5p miRNAの総細胞レベルを増加させることを示しました³。次に、Ago2-miRNA-co-IPアッセイを用いて、TGF-β1がこれらのmiRNAに及ぼす機能的影響を解明しました。miR-145-5p、miR-143-5p、およびmiR-154-5pのRISCリクルートは、野生型(WT)-嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)?...

Ago2-miRNA-co-IPアッセイは、TGF-β1治療に応答したmiRNAの活性プールを調査するために設計されています。活性またはRISC関連miRNAは、標的mRNAに対する阻害能を理解するために重要です⁴。Panshinらは最近、Ago2およびmiRNAの免疫沈降効率がプロトコールに依存する可能性があることを示しました¹⁶。ここでのプロトコルと上記の公開データと...

著者は、競合する金銭的利害関係はなく、開示するものは何もないと宣言しています。

CFBE41o-細胞を生成したTranzyme, Inc.(アラバマ州バーミンガム)のJohn Wakefield氏と、細胞を提供したCFFTのJ.P. Clancy氏に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金R01HL144539およびR56HL127202(A.S.-U.)、および嚢胞性線維症財団の助成金SWIATE18G0によって資金提供されました。