El ensayo Ago2-miRNA-co-IP para estudiar el reclutamiento de miARN mediado por TGF-β1 para el RISC en células CFBE

En este artículo, describimos el ensayo Ago2-miRNA-co-IP diseñado para cuantificar un grupo activo de miRNAs específicos inducidos por TGF-β1 en células epiteliales bronquiales humanas CFBE41o-. Este ensayo proporciona información funcional sobre el reclutamiento de miRNA al complejo de silenciamiento inducido por ARN, cuantificada por qRT-PCR utilizando cebadores específicos de miRNA y sondas de hidrólisis TaqMan.

Los micro(mi)RNAs son ARN cortos, no codificantes, que median la interferencia del ARN (ARNi) mediante mecanismos postranscripcionales. Se reclutan miRNAs específicos para el complejo de silenciamiento inducido por ARN citoplasmático (RISC). Argonaute2 (Ago2), un componente esencial de RISC, facilita la unión del miARN al sitio diana en el ARNm, seguido de la escisión del dúplex miARN-ARNm con su actividad endonucleasa. El ARNi está mediado por un grupo específico de miARN reclutados por RISC y, por lo tanto, se denomina grupo funcional. Los niveles celulares de muchos miRNAs se ven afectados por la citocina Factor de Crecimiento Transformante-β1 (TGF-β1). Sin embargo, se sabe poco sobre si el TGF-β1 afecta a los grupos funcionales de estos miARN. El ensayo Ago2-miRNA-co-IP, discutido en este manuscrito, está diseñado para examinar los efectos de TGF-β1 en el reclutamiento de miRNAs a RISC y ayuda a determinar si los cambios en los niveles celulares de miRNA se correlacionan con los cambios en los grupos funcionales asociados a RISC. Los principios generales del ensayo son los siguientes. Las células cultivadas tratadas con TGF-β1 o control de vehículo se lisan y el endógeno Ago2 se inmunoprecipita con un anticuerpo anti-Ago2 inmovilizado, y los miRNAs activos complejados con Ago2 se aíslan con un kit de ensayo de inmunoprecipitación (RIP) RISC. Los miRNAs se identifican con la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) utilizando cebadores en bucle de tallo específicos de miARN durante la transcripción inversa, seguida de PCR con cebadores directos e inversos específicos de miRNA, y sondas de hidrólisis TaqMan.

El factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) es una citocina multifuncional que puede cambiar la expresión de muchos micro(mi)RNAs ^1,2,3. El nivel celular total de un miARN en particular no se correlaciona con su potencial inhibitorio porque solo una fracción específica del miARN se incorpora al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) para realizar la interferencia de ARN (^ARNi)3. Solo hasta el 10% de cada miRNA está asociado a RISC y participa en el ARNi ^4,5. A continuación, el proceso de ARNi implica la unión del miARN asociado a RISC a la(s) secuencia(s) de reconocimiento de ^{ARNm diana6.} La asociación RISC está influenciada por la disponibilidad del ARNm diana y la complementariedad del miARN con el sitio de unión, generalmente presente en la región no traducida 3' (UTR) del ARNm⁴. El ensayo de inmunoprecipitación Argonaute2-miRNA-co-IP, descrito en este manuscrito, está diseñado para examinar el efecto de TGF-β1 en el reclutamiento de miRNAs específicos para RISC mediante la detección de diferencias en los miRNAs asociados a RISC después del tratamiento con TGF-β1, en comparación con el control del vehículo. El examen del grupo funcional asociado a RISC de un miARN específico es mucho más informativo sobre los efectos del miARN que el examen del nivel celular total del miARN. RISC consiste en proteínas que escanean el sitio de unión en el ARNm objetivo y escinden el dúplex miARN-ARNm. Argonaute2 (Ago2) es el componente principal de RISC. De las cinco isoformas de Ago (Ago1-Ago5), Ago2 es la única que tiene actividad endonucleasa y participa en el ARNi en células humanas 7,8,9,10. El complejo Ago2-miRNA-RISC es la unidad funcional para la represión postranscripcional de ARNm mediada por miRNA¹¹. El miRNA asociado a Ago2 representa el estado nativo del miRNA en respuesta a la señalización intracelular o extracelular. Por lo tanto, la inmunoprecipitación del endógeno Ago2 proporciona una excelente oportunidad para detectar la fracción activa asociada a RISC de un miARN específico, así como la evaluación funcional de sus objetivos. Este ensayo es superior a la reducción del ARNm endógeno diana con imitadores de miARN biotinilado debido a la eficiencia impredecible de la absorción celular de moléculas de ácido nucleico biotinilado y sus efectos fuera del objetivo.

El ensayo Ago2-miRNA-co-IP, discutido en este manuscrito, se optimizó para determinar los efectos de TGF-β1 en el reclutamiento de miRNAs de RISC en células CFBE41o- epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas³. Los componentes del kit de ensayo RIP se utilizaron para realizar el ensayo Ago2-miRNA-co-IP con modificaciones en el protocolo proporcionado por el fabricante. Se utilizó un método de separación para aislar ARN pequeño y grande, en el que se utilizó ARN pequeño para cuantificar el ARN con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) utilizando cebadores de bucle de tallo específicos de miARN durante la transcripción inversa, seguida de PCR utilizando cebadores directos e inversos específicos de miARN, y sondas de hidrólisis TaqMan.

1. Preparación antes del experimento

1. Células de siembra
   1. Prepare la solución de colágeno I al 10% en un medio esencial mínimo (MEM) y agregue 500 μL a cada filtro de cultivo celular de 24 mm en una placa de 6 pocillos. Distribuya para cubrir toda la superficie del filtro girando suavemente con la mano. Incubar los filtros bajo la luz ultravioleta en la campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 30 minutos (min), seguido de la incubación en la incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 1 h.
   2. Prepare el medio de cultivo celular (MEM gaseado con CO₂ durante 20 min, 10% de suero fetal bovino (FBS), 50 U/mL de penicilina, 50 U/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 0,5 μg/mL de puromicina).
   3. Saca los filtros recubiertos de colágeno (paso 1.1.1) de la incubadora y succiona el exceso de colágeno. Añada 1,5 mL del medio de cultivo celular (paso 1.1.2) en el lado basolateral y 0,5 mL en el lado apical (en el filtro) en la placa de 6 pocillos.
   4. Semilla 1 x 10⁶ de células CFBE41o-¹² suspendidas en 500 μL del medio de cultivo celular. Gire la placa suavemente con la mano para distribuir las células de manera uniforme en los filtros e incubar en la incubadora de cultivos celulares a 37 °C con 5% de CO₂.
   5. Retire el medio del lado apical un día después de sembrar las células y continúe cultivando las células en la interfaz aire-líquido (sin medio en el lado apical). Cambie el medio basolateral diariamente y realice el experimento el^8º día.
2. Tratamiento de Células con TGF-β1 o Control de Vehículos
   1. Prepare un medio de cultivo celular libre de FBS (medio libre de FBS): Gas MEM con 5% de CO₂ durante 20 min, agregue 50 U/mL de penicilina, 50 U/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina y filtre el medio.
   2. Prepare el control del vehículo: Agregue 20 μL de 1 M de HCl y 5 mg de BSA a 5 mL de agua bidestilada (4 mM de HCl con 1 mg/mL de BSA) para obtener 1 ng/μL de solución madre. Filtre: esterilice la mezcla antes de usarla.
   3. Preparación de la solución de TGF-β1: Reconstituya 1 μg de TGF-β1 liofilizado en 1 mL de vehículo filtrado estéril (4 mM de HCl y 1 mg/mL de BSA) para obtener 1 ng/μL de solución madre. Alícuota en pequeños volúmenes y almacenar a -20 °C.
   4. Prepare la concentración de trabajo de TGF-β1 o de control de vehículos a 15 ng/mL de medio libre de FBS (agregue 15 μL de TGF-β1 o solución de stock de control de vehículos por mL de medio libre de FBS). Aspirar el medio de cultivo celular desde el lado basolateral y añadir el TGF-β1 o el medio que contiene el vehículo 24 h antes del experimento.
3. Preparación de tampones para lisis celular e inmunoprecipitación
   1. Prepare el tampón mi-Lysis (+) para la lisis celular. Añadir 1 comprimido de inhibidor de la proteasa mini y 15 μL de DTT 1 M por cada 10 mL de volumen en el tampón mi-Lysis suministrado en el kit de ensayo RIP.
   2. Prepare el tampón mi-Wash (+) para lavar las perlas de proteína G agarosa. Agregue 52,5 μL de DTT de 1 M por cada 35 mL de volumen en el tampón mi-Wash provisto en el kit de ensayo RIP.
4. Conjugación del anticuerpo Anti-Ago2 con perlas de proteína G agarosa
   1. Lavar por separado dos alícuotas de 30 μL de proteína G de perlas de agarosa (50%) repitiendo tres veces el siguiente procedimiento: añadir 100 μL de PBS helado, mezclar suavemente, centrifugar a 2.000 x g durante 1 min y aspirar el sobrenadante con una pipeta de 200 μL.
   2. Lave las perlas una vez con 100 μL de tampón mi-Wash helado (+), aspire el sobrenadante con una pipeta de 200 μL y añada 500 μL de tampón mi-Wash (+) a las perlas y mezcle suavemente. Mantenga los tubos en hielo.
   3. Añadir 7,5 μg de anticuerpo monoclonal (IgG2) de ratón anti-humano EIF2C2 (Ago2) (ver Tabla de Materiales) o IgG2 de ratón inespecífica (control negativo) a la suspensión de perlas de proteína G en el tampón mi-Wash (+).
   4. Incube los tubos durante la noche, girando a 8 rotaciones por minuto (rpm) en una habitación fría.

2. Inmunoprecipitación de Ago2

1. Lisis de las células
   1. Traiga la placa que contiene las células cultivadas en filtros de 24 mm de la incubadora de cultivos celulares y transfiera rápidamente los filtros a una placa con hielo llena de PBS helado. Permita que el PBS se desborde en el lado apical de los filtros para cubrir las células.
   2. Un lado a la vez, succionar el PBS y lavar el lado apical y basolateral con PBS helado dos veces.
   3. Aspirar todo el PBS, añadir 300 μL de tampón mi-Lysis helado (+) a las células, raspar las células y transferir a un tubo de 1,5 mL marcado para la condición de tratamiento respectiva (TGF-β1 o control del vehículo).
   4. Añada 200 μL de tampón mi-Lysis (+) a cada tubo y vórtice a fondo.
   5. Incuba los tubos en hielo durante 15 min.
   6. Centrifugar el tubo a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C, recoger el sobrenadante como lisado celular y mantener en hielo.
2. Aclarado previo del lisado celular con perlas de proteína G agarosa no conjugadas
   1. Lavar 30 μL de proteína fresca G de gránulo de agarosa (50%) en un tubo de 1,5 mL 3 veces con 100 μL de PBS (paso 1.4.1) y eliminar el exceso de PBS.
   2. Lave las perlas con 500 μL de mi-Wash Buffer (+) una vez, y una vez con 500 μL de mi-Lysis Buffer (+). Retire el exceso de tampón.
   3. Agregue lisado celular del paso 2.1.6 a los tubos que contienen perlas de proteína G no conjugadas.
   4. Gire (8 rpm) los tubos durante 1 h en la cámara frigorífica para prelimpiar los lisados celulares.
   5. Después del aclarado previo, centrifugar los tubos a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C. Recoja el lisado previamente aclarado como sobrenadante en tubos nuevos y manténgalo en hielo.
   6. Preparar el lisado de células enteras (WCL) previo a la inmunoprecipitación para la detección de la proteína Ago2 mediante Western blot. Tome 10 μL de lisados previamente aclarados y agregue 10 μL de tampón de muestra (con 10% de DTT), caliente a 85 °C durante 4 min, enfríe en el banco y almacene a -20 °C.
3. Inmunoprecipitación de complejos Ago2 con anticuerpo anti-Ago2 inmovilizado en perlas de proteína G agarosa
   1. Centrifugar el anticuerpo anti-Ago2 conjugado con perlas de proteína G preparadas en el paso 1.4.4 a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y desechar. Lave las perlas una vez con 500 μL de tampón mi-Lysis (+), centrifugue como antes y deseche nuevamente el sobrenadante.
   2. Mezclar 500 μL de los lisados celulares previamente aclarados del paso 2.2.6 con el anticuerpo anti-Ago2 conjugado con perlas de proteína G e incubar durante 3 h de rotación (8 rpm) en la cámara frigorífica.
   3. Lleve los tubos de la cámara frigorífica con hielo a la mesa de trabajo y centrifuga a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C. A continuación, retire y deseche el sobrenadante.
   4. Lavar las perlas de proteína G agarosa con complejos inmovilizados de anticuerpos anti-Ago2-Ago2 que contienen los miRNAs coinmunoprecipitados con 1 mL de tampón mi-Wash (+), centrifugar a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Repite este proceso dos veces.
   5. Vuelva a suspender las perlas con 1 mL de tampón mi-Wash (+) y lleve 100 μL de la suspensión a un nuevo tubo para las muestras de proteínas posteriores a la inmunoprecipitación para Western blot.
   6. Centrifugar los tubos a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   7. Añadir 20 μL de tampón de muestra (10% DTT), calentar durante 5 min a 85 °C, mezclar y centrifugar a 2.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Almacene las muestras a -20 °C.
   8. Centrifugar los tubos con los 900 μL restantes de complejos inmovilizados de anticuerpos anti-Ago2 y Ago2 del paso 2.3.5 a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C, aspirar y desechar el sobrenadante. Mantenga las muestras en hielo.

3. Aislamiento de ARN

1. Etiquete dos tubos de 1,5 mL por muestra para el aislamiento de ARN pequeño y ARN grande en los próximos pasos y agregue 2 μL de mi-solution IV a cada tubo, para usar en los pasos 3.5 y 3.8.
2. Prepare la solución de mezcla maestra añadiendo 10 μL de mi-solución I y 240 μL de mi-solution II del kit de ensayo RIP, por muestra, a un tubo de 1,5 mL y mantenga el tubo a temperatura ambiente.
3. Añadir 250 μL de la mezcla maestra a cada tubo que contenga complejos inmovilizados de anticuerpos anti-Ago2-Ago2 (preparados en el paso 2.3.8), vórtice y centrifugar a 2.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
4. Añadir 150 μL de mi-solution III en el mismo tubo y mezclar bien. A continuación, centrifugar a 2.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. El sobrenadante en este paso contiene ARN grande además de ARN pequeño (es decir, ARN total).
5. Transfiera con cuidado el sobrenadante al tubo que contiene 2 μL de mi-solución IV, preparado en el paso 3.1. Evite contaminar el sobrenadante con perlas para interferir con la qRT-PCR.
6. Agregue 300 μL de 2-popanol helado a cada tubo que contenga ARN total, vórtice, espín e incube a -20 °C durante 2 h para una precipitación óptima de ARN grande.
7. Después de la incubación a -20 °C, centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C para separar los ARN pequeños y grandes, contenidos en el sobrenadante y el pellet, respectivamente. Mantenga los gránulos en hielo hasta el paso 3.11.
8. Transfiera el sobrenadante con ARN pequeños al tubo preparado en el paso 3.1 (que contiene 2 μL de mi-solución IV) y agregue 500 μL de 2-propanol helado, vórtice y centrifuga.
9. Incubar los sobrenadantes durante la noche a -20 °C para una precipitación óptima de ARN pequeños.
10. Al día siguiente, saque los tubos que contienen ARN pequeños del congelador a -20 °C y centrifugue a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante, sin alterar el pellet, y lave el pellet que contiene la mayor parte del ARN pequeño siguiendo el paso 3.11.
11. Enjuague el gránulo que contiene ARN grande (paso 3.7) y ARN pequeño (paso 3.10) con 500 μL de etanol al 70% frío como hielo, cada uno. Mezcle lentamente el pellet con etanol al 70% helado y luego centrifugue a 12.000 x g durante 3 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante, sin alterar el pellet. Repite el proceso de lavado una vez más.
12. Aspire el etanol restante con una pipeta de volúmenes más pequeños (10 μL o 20 μL) y deje secar al aire durante 30 min a temperatura ambiente en un ambiente libre de RNasa.
13. Reconstituya los gránulos de ARN pequeño y ARN grande agregando 50 μL de agua libre de nucleasa y calentando a 65 °C durante 5 min. A continuación, almacene el ARN a -80 °C hasta su uso posterior después de comprobar la calidad y la concentración del ARN mediante nanogotas.

4. Cuantificación de miRNA por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR)

1. Preparación de ADNc a través de la transcripción inversa de miRNA con cebadores de bucle de tallo específicos de miARN
   NOTA: La detección de ARN por qRT-PCR estándar requiere una plantilla de al menos dos veces la longitud del cebador directo o inverso, cada uno de aproximadamente 20 nucleótidos de largo. Por lo tanto, la longitud mínima es de al menos 40 nucleótidos, lo que hace que los ARN pequeños sean demasiado cortos para la detección. El protocolo describe los cebadores RT (Tabla de Materiales) específicos de miARN que contienen una estructura de bucle de tallo altamente estable que alarga el ADNc objetivo. El cebador de PCR directa agrega longitud adicional con nucleótidos que optimiza su temperatura de fusión y mejora la especificidad del ensayo. El cebador inverso interrumpe el bucle del vástago¹³. El siguiente protocolo describe el RT de ARN a ADNc para miR-145-5p, miR-143-5p y miR-154-5p utilizando el kit de transcripción inversa de miARN (Tabla de materiales).
   1. Prepare una mezcla maestra para cada miARN añadiendo 100 mM de dNTP (0,3 μL), transcriptasa inversa (2 μL), tampón RT 10x (3 μL), inhibidor de ARNasa (0,38 μL), cebador en bucle específico de miARN (6 μL) y agua libre de nucleasa (8,32 μL). El volumen combinado de la mezcla maestra es de 20 μL.
   2. Agregue 10 μL de ARN pequeño del paso 3.13 (50-100 ng) a tres tubos separados de 200 μL para cada ADNc de miR-145-5p, miR-143-5p y miR-154-5p.
   3. Agregue la mezcla maestra al ARN pequeño, mezcle suavemente y gire hasta el fondo de los tubos. Mantenga los tubos en hielo hasta que se carguen en el termociclador.
   4. Ajuste el programa en el termociclador para ciclo único a 16 °C durante 30 minutos, a 42 °C durante 30 minutos, a 85 °C durante 5 minutos y a 4 °C. Ajuste el volumen de reacción a 30,0 μL. Consulte el paso 4.1.6.1.
   5. Cargue los tubos de reacción en el termociclador. Inicie la ejecución RT. Consulte el paso 4.1.6.2.
   6. Encienda el termociclador y coloque los tubos en la bandeja. Mostrará que "El sistema se está iniciando, espere". Haga clic en Examinar/Nuevos métodos. Guarde el método y utilícelo en otro experimento navegando por el menú. Seleccione de la lista de métodos guardados antes e inicie la ejecución o cree un método "nuevo". Aparecerá la pantalla del método "editar ejecución" o del método "nuevo".
      1. Edite la temperatura y los ciclos como se indica en el paso 4.1.4. Agregue o elimine etapas y pasos haciendo clic en una etapa o paso en particular y luego haciendo clic en el botón Agregar o eliminar. Haga clic en Guardar o ejecute directamente el programa. En Guardar método de ejecución, asigne un nombre al método "ejecución", establezca el volumen de reacción (30 μL), establezca la temperatura de la cubierta en 105 °C, guarde y salga.
      2. Cuando aparezca la pantalla "examinar método de ejecución", seleccione el método guardado de la lista "método de ejecución". Haga clic en Iniciar ejecución y vuelva a confirmar el volumen de reacción y la temperatura de la cubierta. Haga clic en Iniciar ejecución ahora. La pantalla mostrará la temperatura de la muestra, la temperatura de la cubierta y el tiempo restante. Registre la hora de inicio y parada después de la finalización y retire los tubos del termociclador.
         NOTA: Los tubos que contienen ADNc pueden almacenarse a -20 °C hasta su uso posterior para qPCR de miARN.
2. qPCR con los cebadores directos/inversos específicos de miARN y las sondas de hidrólisis
   NOTA: El siguiente protocolo es para qPCR de miR-145-5p, miR-143-5p y miR-154-5p utilizando ADNc específicos de miRNA preparados en el paso 4.1. El ensayo de miARN de un solo tubo (20x) contiene cebadores directos/inversos específicos de miARN y sonda de hidrólisis (Tabla de materiales). El cebador directo añade nucleótido para aumentar la longitud y optimizar la temperatura de fusión, mientras que el cebador inverso interrumpe el bucle del tallo del ADNc¹³. La mezcla maestra de PCR universal (tabla de materiales) proporciona componentes adicionales necesarios para qPCR. La reacción (20 μL) se realiza por triplicado para cada miARN.
   1. Prepare una mezcla maestra separada para miR-145-5p, miR-143-5p y miR-154-5p por triplicados utilizando el ensayo de miARN respectivo (20x) (1 μL), 2x Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; 10 μL) y agua libre de nucleasa (7,5 μL). El volumen total de una reacción es de 18,5 μL.
   2. Añada ADNc específico de miARN (1,5 μL) preparado en 4.1 a cada pocillo de la placa de PCR por triplicado.
   3. Añada la mezcla maestra específica de miARN (18,5 μL) preparada en el paso 4.2.1 a los pocillos de la placa de PCR que contiene el ADNc respectivo (1,5 μL).
   4. Selle la placa con el sellador adecuado y ejecute qPCR durante 45 ciclos en un termociclador qPCR (Tabla de materiales). Ajuste la temperatura del ciclo a 95 °C durante 10 min, seguido de 45 repeticiones de 95 °C durante 15 segundos (s) y 60 °C durante 60 s. Consulte el paso 4.2.6.
   5. Establezca las líneas de base de la curva de qPCR manualmente por placa y umbrales estandarizados para todas las ejecuciones de qPCR en un punto en el que la amplificación se vuelva logarítmica para todas las muestras.
   6. Encienda el termociclador y coloque la placa PCR en la bandeja. La máquina termocicladora funciona con el software instalado en el ordenador adjunto. Haga clic en el icono del software del sistema.
      1. Haga clic en Crear nuevo documento o Abrir documento existente (si hay un documento guardado anteriormente). Aparecerá el asistente de nuevo documento. El ensayo será de "curva estándar (cuantificación absoluta)". Haga clic en Siguiente.
      2. Agregue un nuevo detector. Asigne un nombre al detector como miR-143, miR-145 y miR-154 uno por uno haciendo clic en Crear otro. Seleccione tinte reportero como "FAM" para todos y haga clic en Aceptar. A continuación, busque el nombre como miR-143, miR-145 y miR-154 y añádalos al documento del detector haciendo clic en Añadir. A continuación, haga clic en Siguiente.
      3. Aparecerá "Configurar placa de muestra". Seleccione los pozos para un detector y luego haga clic en Usar para seleccionar el detector correspondiente. A continuación, haga clic en Finalizar. Aparecerá la inicialización del sistema.
      4. Vaya al instrumento y configure la etapa, la temperatura y el tiempo como se mencionó en el paso 4.2.4. Ajuste el volumen de la muestra a 20 μL. A continuación, inicie la ejecución haciendo clic en Iniciar. A continuación, guarde la placa con un nombre en el lugar que desee. El tiempo estimado se mostrará en la pantalla cerca del botón de inicio. Anota la hora.
      5. Una vez finalizado, vaya a Archivo | Exportación | Resultados y guarde los resultados como valores CT en la ubicación deseada. Los valores de CT estarán en .csv archivos. Ábrelo y copia los valores en un archivo de hoja de cálculo.
   7. Reste el promedio del ciclo de umbral por triplicado (Ct) de las muestras tratadas con control de vehículos del Ct promedio de las muestras tratadas con TGF-β1 para calcular ΔCt. Por último, calcule el cambio de pliegue (FC) de los niveles de miARN utilizando la fórmula ^2-ΔCt. La transformación log2 del valor FC se puede utilizar para la representación gráfica.

Hemos demostrado previamente que el TGF-β1 aumentó los niveles celulares totales de miRNAs miR-145-5p, miR-143-5p y miR-154-5p en células CFBE41o-³. A continuación, empleamos el ensayo Ago2-miRNA-co-IP para dilucidar los efectos funcionales del TGF-β1 en estos miRNA. Se estudió el reclutamiento RISC de miR-145-5p, miR-143-5p y miR-154-5p en células CFBE41o- que expresan de manera estable el regulador de conductancia transmembrana (CFTR) de fibrosis quístic...

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Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia y que no tienen nada que revelar.

Agradecemos a John Wakefield de Tranzyme, Inc. (Birmingham, AL) que generó las células CFBE41o-, y a J.P. Clancy del CFFT que proporcionó las células. Esta investigación fue financiada por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01HL144539 y R56HL127202 (a A.S.-U.) y la SWIATE18G0 de subvenciones de la Fundación de Fibrosis Quística.