JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את בדיקת Ago2-miRNA-co-IP שנועדה לכמת מאגר פעיל של miRNAs ספציפיים המושרים על ידי TGF-β1 בתאי אפיתל CFBE41o- של הסימפונות האנושיים. בדיקה זו מספקת מידע פונקציונלי על גיוס miRNA לקומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA, שכומת על ידי qRT-PCR באמצעות פריימרים miRNA ספציפיים ובדיקות הידרוליזה של TaqMan.

Abstract

מיקרו (mi) RNA הם RNA קצרים שאינם מקודדים המתווכים את הפרעות ה-RNA (RNAi) על ידי מנגנונים פוסט-שעתוק. miRNAs ספציפיים מגויסים לקומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA ציטופלזמי (RISC). Argonaute2 (Ago2), מרכיב חיוני ב-RISC, מקל על קשירת miRNA לאתר המטרה ב-mRNA, ואחריו פיצול הדופלקס miRNA-mRNA עם פעילות האנדונוקלאז שלו. RNAi מתווך על ידי מאגר ספציפי של miRNAs שגויסו ל-RISC, ולכן מכונה המאגר הפונקציונלי. הרמות התאיות של miRNAs רבים מושפעות מגורם הגדילה המשנה ציטוקין-β1 (TGF-β1). עם זאת, מעט ידוע על האם ה-TGF-β1 משפיע על המאגרים הפונקציונליים של ה-miRNAs האלה. בדיקת Ago2-miRNA-co-IP, הנדונה בכתב יד זה, נועדה לבחון את ההשפעות של TGF-β1 על גיוס miRNAs ל-RISC והיא עוזרת לקבוע אם שינויים ברמות ה-miRNA התאיים קשורים לשינויים במאגרים הפונקציונליים הקשורים ל-RISC. העקרונות הכלליים של הבדיקה הם כדלקמן. תאים מתורבתים שטופלו ב-TGF-β1 או בבקרת רכב עוברים ליזה וה-Ago2 האנדוגני עובר זריזות חיסונית עם נוגדן אנטי-Ago2 משותק, וה-miRNAs הפעילים המורכבים עם Ago2 מבודדים עם ערכת בדיקת RISC immunoprecipitation (RIP). ה-miRNAs מזוהים עם תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qRT-PCR) באמצעות פריימרים עם לולאת גזע ספציפיים ל-miRNA במהלך שעתוק הפוך, ואחריהם PCR באמצעות פריימרים קדימה ואחורה ספציפיים ל-miRNA, ובדיקות הידרוליזה של TaqMan.

Introduction

Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) הוא ציטוקין רב תכליתי שיכול לשנות את הביטוי של מיקרו-(mi) RNA רבים 1,2,3. הרמה התאית הכוללת של miRNA מסוים אינה מתואמת עם הפוטנציאל המעכב שלו מכיוון שרק חלק ספציפי של ה-miRNA משולב בקומפלקס השתקה המושרה על ידי RNA (RISC) לביצוע הפרעות RNA (RNAi)3. רק עד 10% מכל miRNA קשור ל-RISC ומשתתף ב-RNAi 4,5. לאחר מכן, תהליך ה-RNAi כולל קשירה של ה-miRNA הקשור ל-RISC לרצפי זיהוי ה-mRNA המטרה6. האסוציאציה של RISC מושפעת מהזמינות של ה-mRNA המטרה ומהשלמת ה-miRNA לאתר הקשירה, הקיים בדרך כלל באזור לא מתורגם (UTR) של ה-mRNA4. בדיקת Argonaute2-miRNA-co-immunoprecipitation (Ago2-miRNA-co-IP), המתוארת בכתב יד זה, נועדה לבחון את ההשפעה של TGF-β1 על גיוס miRNAs ספציפיים ל-RISC על ידי זיהוי הבדלים ב-miRNAs הקשורים ל-RISC לאחר טיפול ב-TGF-β1, בהשוואה לביקורת הרכב. בחינת המאגר התפקודי הקשור ל-RISC של miRNA ספציפי היא הרבה יותר אינפורמטיבית לגבי השפעות ה-miRNA מאשר בחינת הרמה התאית הכוללת של ה-miRNA. RISC מורכב מחלבונים הסורקים את אתר הקישור ב-mRNA המטרה ומבקעים את הדופלקס miRNA-mRNA. Argonaute2 (Ago2) הוא המרכיב העיקרי של RISC. מתוך חמשת האיזופורמים של Ago (Ago1-Ago5), Ago2 הוא היחיד שיש לו פעילות אנדונוקלאז ומשתתף ב-RNAi בתאים אנושיים 7,8,9,10. קומפלקס Ago2-miRNA-RISC הוא היחידה הפונקציונלית לדיכוי mRNA לאחר שעתוק בתיווך miRNA11. ה-miRNA הקשור ל-Ago2 מייצג את המצב המקורי של miRNA בתגובה לאיתות תוך-תאי או חוץ-תאי. לפיכך, משקעים חיסוניים של Ago2 האנדוגני מספקים הזדמנות מצוינת לזהות את החלק הפעיל הקשור ל-RISC של miRNA ספציפי כמו גם את ההערכה התפקודית של מטרותיו. בדיקה זו עדיפה על משיכה כלפי מטה של mRNA מטרה אנדוגני עם חיקוי miRNA ביוטיניל בגלל היעילות הבלתי צפויה של הספיגה התאית של מולקולות חומצות גרעין ביוטיניליות והשפעותיהן מחוץ למטרה.

מבחן Ago2-miRNA-co-IP, שנדון בכתב יד זה, עבר אופטימיזציה כדי לקבוע את ההשפעות של TGF-β1 על גיוס RISC של miRNAs בתאי CFBE41o- אפיתל סימפונות אנושיים אימורטליים3. רכיבים של ערכת בדיקת RIP שימשו לביצוע בדיקת Ago2-miRNA-co-IP עם שינויים בפרוטוקול שסופק על ידי היצרן. נעשה שימוש בשיטת הפרדה לבידוד RNA קטן וגדול, שבה נעשה שימוש ב-RNA קטן כדי לכמת miRNA בעזרת תגובת שרשרת פולימראז הפוכה כמותית (qRT-PCR) באמצעות פריימרים עם לולאת גזע ספציפיים ל-miRNA במהלך שעתוק הפוך, ואחריו PCR באמצעות פריימרים קדימה ואחורה, ובדיקות הידרוליזה של TaqMan.

Protocol

1. הכנה לפני הניסוי

  1. זריעת תאים
    1. הכינו תמיסת קולגן I של 10% במדיום חיוני מינימלי (MEM) והוסיפו 500 מיקרוליטר לכל מסנן תרבית תאים בגודל 24 מ"מ בצלחת של 6 בארות. מחלקים כדי לכסות את כל שטח המסנן על ידי סיבוב עדין ביד. דגירה של מסננים מתחת לאור ה-UV במכסה הזרימה הלמינרי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (דקות), ולאחר מכן דגירה בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    2. הכן מדיום תרבית תאים (MEM בגז עם CO2 למשך 20 דקות, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 50 U/mL פניצילין, 50 U/mL סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין).
    3. הוציאו את המסננים המצופים קולגן (שלב 1.1.1) מהחממה ושאבו את עודפי הקולגן. הוסף 1.5 מ"ל ממדיום תרבית התאים (שלב 1.1.2) לצד הבסיסי ו-0.5 מ"ל לצד האפיקלי (על המסנן) בצלחת 6 הבארות.
    4. זרע 1 x 106 של תאי CFBE41o-12 תלויים ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית התאים. סובב את הצלחת בעדינות ביד כדי לפזר את התאים באופן שווה על המסננים ולדגור בחממת תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    5. הסר את המדיום מהצד האפיקלי יום לאחר זריעת התאים והמשך בתרבית תאים בממשק אוויר-נוזל (אין מדיום בצד האפיקלי). החלף את המדיום הבסיסי מדי יום ובצע את הניסויביום השמיני.
  2. טיפול בתאים עם TGF-β1 או בקרת רכב
    1. הכן מדיום תרבית תאים נטול FBS (מדיום נטול FBS): גז MEM עם 5% CO2 למשך 20 דקות, הוסף 50 U/mL פניצילין, 50 U/mL סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין ומסנן לעקר את המדיום.
    2. הכן בקרת רכב: הוסף 20 מיקרוליטר של 1 M HCl ו-5 מ"ג BSA ל-5 מ"ל מים מזוקקים כפולים (4 מ"מ HCl עם 1 מ"ג/מ"ל BSA) כדי לקבל תמיסת מלאי של 1 ננוגרם/מיקרוליטר. מסננים מעקרים את התערובת לפני השימוש.
    3. הכן תמיסת TGF-β1: הרכיב מחדש 1 מיקרוגרם של TGF-β1 ליופיליזציה ב-1 מ"ל של רכב מסונן סטרילי (4 מ"מ HCl ו-1 מ"ג/מ"ל BSA) כדי לקבל תמיסת מלאי של 1 ננוגרם/מיקרוליטר. יש לאחסן בכמויות קטנות ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    4. הכן את ריכוז העבודה של TGF-β1 או בקרת רכב ב-15 ננוגרם/מ"ל של מדיום נטול FBS (הוסף 15 מיקרוליטר של TGF-β1 או תמיסת מלאי בקרת רכב לכל מ"ל של מדיום נטול FBS). שאבו את מדיום תרבית התאים מהצד הבסיסי והוסיפו את ה-TGF-β1 או בקרת הרכב המכילה מדיום 24 שעות לפני הניסוי.
  3. הכנת חוצצים לליזה תאית ומשקעים חיסוניים
    1. הכן מאגר mi-Lysis (+) לליזה של תאים. הוסף טבליה אחת של מעכב פרוטאז מיני ו-15 מיקרוליטר של 1 M DTT לכל 10 מ"ל נפח לתוך מאגר ה-mi-Lysis המסופק בערכת RIP-Assay.
    2. הכן מאגר mi-Wash (+) לשטיפת חרוזי אגרוז חלבון G. הוסף 52.5 מיקרוליטר של 1 M DTT לכל 35 מ"ל נפח למאגר mi-Wash המסופק בערכת RIP-Assay.
  4. צימוד של נוגדן Anti-Ago2 עם חרוזי אגרוז חלבון G
    1. יש לשטוף בנפרד שתי מנות של 30 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי אגרוז של חלבון G (50%) על ידי חזרה על ההליך הבא שלוש פעמים: להוסיף 100 מיקרוליטר PBS קר כקרח, לערבב בעדינות, צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת, ולשאוב את הסופרנטנט עם פיפטה של 200 מיקרוליטר.
    2. שוטפים את החרוזים פעם אחת עם 100 מיקרוליטר של mi-Wash Buffer קר כקרח (+), שואבים את הסופרנטנט עם פיפטה של 200 מיקרוליטר ומוסיפים לחרוזים 500 מיקרוליטר של mi-Wash Buffer (+) ומערבבים בעדינות. שמור את הצינורות על קרח.
    3. הוסף 7.5 מיקרוגרם של נוגדן EIF2C2 (Ago2) חד-שבטי של עכבר (IgG2), אנטי אנושי (Ago2) או IgG2 לא ספציפי של עכבר (בקרה שלילית) לתמיסת חרוזי חרוזי החלבון G במאגר mi-Wash (+).
    4. דגרו את הצינורות למשך הלילה, תוך סיבוב במהירות של 8 סיבובים לדקה (סל"ד) בחדר קר.

2. משקעים חיסוניים של Ago2

  1. ליזה של תאים
    1. הביאו את הצלחת המכילה תאים שגודלו על מסננים של 24 מ"מ מאינקובטור תרבית התאים והעבירו במהירות את המסננים לצלחת על קרח מלא ב-PBS קר כקרח. אפשר ל-PBS לגלוש לתוך הצד האפיקלי של המסננים כדי לכסות תאים.
    2. צד אחד בכל פעם, שאבו את PBS ושטפו את הצד האפיקלי והבסיסי עם PBS קר כקרח פעמיים.
    3. שאב את כל ה-PBS, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר mi-Lysis קר כקרח (+) לתאים, גרד את התאים והעביר לצינור 1.5 מ"ל המסומן למצב הטיפול המתאים (TGF-β1 או בקרת רכב).
    4. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר mi-Lysis (+) לכל צינור ומערבולת ביסודיות.
    5. דגרו את הצינורות על קרח למשך 15 דקות.
    6. צנטריפוגה של הצינור ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, אספו את הסופרנטנט בזמן שהתא ליזאט, והמשיכו להדביק קרח.
  2. ניקוי מוקדם של ליזאט תאים עם חרוזי אגרוז G חלבון לא מצומד
    1. שטפו 30 מיקרוליטר של חלבון טרי G תמיסת חרוזי אגרוז (50%) בשפופרת של 1.5 מ"ל 3 פעמים עם 100 מיקרוליטר PBS (שלב 1.4.1) והסירו עודפי PBS.
    2. שטפו חרוזים עם 500 מיקרוליטר של מאגר mi-Wash (+) פעם אחת, ופעם אחת עם 500 מיקרוליטר של מאגר mi-Lysis (+). הסר את המאגר העודף.
    3. הוסף ליזאט תאים משלב 2.1.6 לצינורות המכילים חרוזי חלבון G לא מצומדים.
    4. סובב (8 סל"ד) את הצינורות למשך שעה אחת בחדר הקירור כדי לנקות מראש את הליזטים של התא.
    5. לאחר הניקוי המקדים, צנטריפוגה את הצינורות ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. אסוף את הליזאט הנקי מראש כסופרנטנט בצינורות טריים והשאר על קרח.
    6. הכן ליזאט תאים שלמים (WCL) לפני משקעים חיסוניים לזיהוי חלבון Ago2 על ידי כתמים מערביים. קח 10 מיקרוליטר של ליזטים שנוקו מראש והוסף 10 מיקרוליטר של מאגר דגימה (עם 10% DTT), חמם ב-85 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, התקרר על הספסל ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
  3. משקעים חיסוניים של קומפלקסים של Ago2 עם נוגדן אנטי-Ago2 משותק על חרוזי אגרוז חלבון G
    1. צנטריפוגה הנוגדן נגד Ago2 המצומד לחרוזי חלבון G שהוכנו בשלב 1.4.4 ב-2,000 x g למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט והשליך. שטפו חרוזים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של מאגר mi-Lysis (+), צנטריפוגה כמו קודם, והשליכו שוב את הסופרנטנט.
    2. מערבבים 500 מיקרוליטר של ליזאט התא המנוקה מראש משלב 2.2.6 עם נוגדן אנטי-Ago2 מצומד עם חרוזי חלבון G ודוגרים למשך 3 שעות סיבוב (8 סל"ד) בחדר הקירור.
    3. הביאו צינורות מחדר קירור על קרח למשטח הספסל והצנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר והשליך את הסופרנטנט.
    4. שטפו את חרוזי אגרוז החלבון G עם קומפלקסים משותקים של נוגדנים נגד Ago2-Ago2 המכילים את ה-miRNAs המשקעים עם 1 מ"ל של מאגר mi-Wash (+), צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט. חזור על תהליך זה פעמיים.
    5. השעו מחדש את החרוזים עם 1 מ"ל של mi-Wash Buffer (+) וקחו 100 מיקרוליטר של התרחיץ לצינור חדש לדגימות החלבון שלאחר משקעים חיסוניים לכתמים מערביים.
    6. צנטריפוגה של הצינורות ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    7. מוסיפים 20 מיקרוליטר של מאגר דגימה (10% DTT), מחממים למשך 5 דקות ב-85 מעלות צלזיוס, מערבבים וצנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    8. צנטריפוגה של הצינורות עם 900 מיקרוליטר הנותרים של קומפלקסים של נוגדנים נגד Ago2-Ago2 משותקים משלב 2.3.5 ב-2,000 x g למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס, שואבים ומשליכים את הסופרנטנט. שמור את הדגימות על קרח.

3. בידוד RNA

  1. סמן שני צינורות של 1.5 מ"ל לדגימה לבידוד של RNA קטן ו-RNA גדול בשלבים הבאים והוסף 2 מיקרוליטר של mi-solution IV לכל צינור, לשימוש בשלב 3.5 ו-3.8.
  2. הכן את תמיסת תערובת המאסטר על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של mi-solution I ו-240 μL של mi-solution II מערכת בדיקת RIP, לכל דגימה, לצינור של 1.5 מ"ל ושמור את הצינור בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף 250 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל שפופרת המכילה קומפלקסים משותקים של נוגדנים נגד Ago2-Ago2 (שהוכנו בשלב 2.3.8), מערבולת וצנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. מוסיפים 150 מיקרוליטר של mi-solution III באותו צינור ומערבבים היטב. ואז צנטריפוגה ב -2,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הסופרנטנט בשלב זה מכיל RNA גדול בנוסף ל-RNA קטן (כלומר, RNA כולל).
  5. העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור המכיל 2 מיקרוליטר של mi-solution IV, שהוכן בשלב 3.1. הימנע מזיהום ה-supernatant בחרוזים כדי להפריע ל-qRT-PCR.
  6. הוסף 300 מיקרוליטר של 2-פופנול קר כקרח לכל צינור המכיל RNA כולל, מערבולת, סיבוב למטה ודגירה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים למשקעים אופטימליים של RNA גדול.
  7. לאחר הדגירה ב-20 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה את הדגימות ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להפריד בין ה-RNA הקטן והגדול, הכלולים בסופרנטנט ובגלולה, בהתאמה. שמור את הכדורים על הקרח עד שלב 3.11.
  8. העבירו את הסופרנטנט עם רנ"א קטן לצינור שהוכן בשלב 3.1 (המכיל 2 מיקרוליטר של mi-solution IV) והוסיפו 500 מיקרוליטר של 2-פרופנול קר כקרח, מערבולת וסיבוב כלפי מטה.
  9. דגרו את הסופרנטנטים למשך הלילה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשקעים אופטימליים של RNA קטנים.
  10. למחרת, הוציאו את הצינורות המכילים RNA קטנים ממקפיא וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט, מבלי להפריע לגלולה, ושטפו את הכדור המכיל את רוב ה-RNA הקטן לאחר שלב 3.11.
  11. שטפו את הגלולה המכילה RNA גדול (שלב 3.7) ו-RNA קטן (שלב 3.10) עם 500 מיקרוליטר אתנול 70% קר כקרח, כל אחד. מערבבים לאט את הגלולה עם אתנול 70% קר כקרח ולאחר מכן צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנטנט, מבלי להפריע לכדור. חזור על תהליך הכביסה שוב.
  12. שאפו את האתנול הנותר עם פיפטה בנפחים קטנים יותר (10 מיקרוליטר או 20 מיקרוליטר) והניחו לייבוש באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בסביבה נטולת RNase.
  13. הרכיבו מחדש את ה-RNA הקטן וכדורי ה-RNA הגדולים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז וחימום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן אחסן את ה-RNA ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף לאחר בדיקת האיכות והריכוז של RNA על ידי ננו-טיפה.

4. כימות miRNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז הפוכה כמותית (qRT-PCR)

  1. הכנת cDNA באמצעות שעתוק הפוך של miRNA עם פריימרים ספציפיים לולאת גזע miRNA
    הערה: זיהוי RNA על ידי qRT-PCR סטנדרטי דורש תבנית של לפחות פי שניים מאורך הפריימר קדימה או אחורה, כל אחד באורך של כ-20 נוקלאוטידים. לפיכך, האורך המינימלי הוא לפחות 40 נוקלאוטידים, מה שהופך RNA קטנים לקצרים מדי לזיהוי. הפרוטוקול מתאר פריימרים RT ספציפיים ל-miRNA (טבלת חומרים) המכילים מבנה לולאת גזע יציב ביותר המאריך את ה-cDNA המטרה. פריימר ה-PCR הקדמי מוסיף אורך נוסף עם נוקלאוטידים המייעל את טמפרטורת ההיתוך שלו ומשפר את ספציפיות הבדיקה. הפריימר ההפוך משבש את לולאת הגבעול13. הפרוטוקול הבא מתאר RT של RNA ל-cDNA עבור miR-145-5p, miR-143-5p ו-miR-154-5p באמצעות ערכת שעתוק הפוך של miRNA (טבלת חומרים).
    1. הכן תערובת מאסטר עבור כל miRNA על ידי הוספת 100 מ"מ dNTPs (0.3 מיקרוליטר), טרנסקריפטאז הפוך (2 מיקרוליטר), מאגר RT 10x (3 מיקרוליטר), מעכב RNase (0.38 מיקרוליטר), פריימר לולאה ספציפי ל-miRNA (6 מיקרוליטר) ומים נטולי נוקלאז (8.32 מיקרוליטר). הנפח המשולב של תערובת מאסטר הוא 20 מיקרוליטר.
    2. הוסף 10 מיקרוליטר של RNA קטן משלב 3.13 (50-100 ננוגרם) לשלושה צינורות נפרדים של 200 מיקרוליטר עבור כל cDNA של miR-145-5p, miR-143-5p ו-miR-154-5p.
    3. מוסיפים את תערובת המאסטר ל-RNA קטן, מערבבים בעדינות ומסובבים לתחתית הצינורות. שמור את הצינורות על קרח עד לטעינה לתוך המחזור התרמי.
    4. הגדר את התוכנית במחזור תרמי למחזור בודד כהחזקה ב-16 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, החזק ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, החזק ב-85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחזק ב-4 מעלות צלזיוס. הגדר את נפח התגובה ל-30.0 מיקרוליטר. ראה שלב 4.1.6.1.
    5. טען את צינורות התגובה לתוך המחזור התרמי. התחל את ריצת ה-RT. ראה שלב 4.1.6.2.
    6. הפעל את המחזור התרמי והנח את הצינורות לתוך המגש. זה יראה ש"המערכת מאתחלת, אנא המתן". לחץ על עיון/שיטות חדשות. שמור את השיטה והשתמש בה בניסוי אחר על ידי דפדוף בתפריט. בחר מתוך רשימת השיטות שנשמרו בעבר והתחל לרוץ או צור שיטה "חדשה". יופיע מסך שיטת "עריכת הפעלה" או שיטה "חדשה".
      1. ערוך טמפרטורה ומחזורים כאמור בשלב 4.1.4. הוסף או הסר שלבים ושלבים על ידי לחיצה על שלב או שלב מסוים ולאחר מכן לחיצה על כפתור הוספה או מחיקה. לחץ על שמור או הפעל ישירות את התוכנית. בשיטת Save Run, תן שם לשיטת "הפעלה", הגדר את נפח התגובה (30 μL), הגדר את טמפרטורת הכיסוי ל-105 מעלות צלזיוס, שמור וצא.
      2. כאשר מופיע המסך "עיין בשיטת הפעלה", בחר את השיטה השמורה מהרשימה "שיטת הפעלה". לחץ על התחל הפעלה ואשר שוב את נפח התגובה וטמפרטורת המכסה. לחץ על התחל הפעל עכשיו. המסך יציג את טמפרטורת הדגימה, טמפרטורת הכיסוי והזמן שנותר. רשום את זמן ההתחלה והעצירה לאחר השלמתו והסר את הצינורות מהמחזור התרמי.
        הערה: ניתן לאחסן את הצינורות המכילים cDNA ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף ב-qPCR של miRNA.
  2. qPCR עם פריימרים קדימה/אחורה ספציפיים ל-miRNA ובדיקות הידרוליזה
    הערה: הפרוטוקול הבא מיועד ל-qPCR של miR-145-5p, miR-143-5p ו-miR-154-5p באמצעות cDNA ספציפי ל-miRNA שהוכנו בשלב 4.1. מבחן ה-miRNA של הצינור היחיד (20x) מכיל פריימרים ספציפיים ל-miRNA קדימה/אחורה ובדיקת הידרוליזה (טבלת חומרים). הפריימר הקדמי מוסיף נוקלאוטיד כדי להגדיל את האורך ולייעל את טמפרטורת ההיתוך, בעוד שהפריימר ההפוך משבש את לולאת הגזע של cDNA13. ה-Universal PCR Master Mix (טבלת החומרים) מספק רכיבים נוספים הנדרשים ל-qPCR. התגובה (20 מיקרוליטר) נעשית בשלושה עותקים עבור כל miRNA.
    1. הכן תערובת מאסטר נפרדת עבור miR-145-5p, miR-143-5p ו-miR-154-5p בשלוש פעמים באמצעות בדיקת miRNA מתאימה (20x) (1 μL), 2x Universal PCR Master Mix (ללא AmpErase UNG; 10 μL) ומים נטולי נוקלאז (7.5 μL). הנפח הכולל לתגובה אחת הוא 18.5 מיקרוליטר.
    2. הוסף cDNA ספציפי ל-miRNA (1.5 מיקרוליטר) שהוכן ב-4.1 לכל באר של לוחית ה-PCR בשלוש עותקים.
    3. הוסף את תערובת המאסטר הספציפית ל-miRNA (18.5 μL) שהוכנה בשלב 4.2.1 לבארות של צלחת PCR המכילה cDNA בהתאמה (1.5 μL).
    4. אטום את הצלחת עם סילר מתאים והפעל qPCR למשך 45 מחזורים על תרמו-ציקלר qPCR (טבלת חומרים). הגדר את טמפרטורת המחזור כהחזקה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריה 45 חזרות של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות. ראה שלב 4.2.6.
    5. הגדר את קווי הבסיס של עקומת qPCR באופן ידני לכל צלחת וסף סטנדרטי עבור כל ריצות ה-qPCR בנקודה שבה ההגברה הופכת לוגריתמית עבור כל הדגימות.
    6. הפעל את המחזורי התרמי והנח את לוחית ה-PCR לתוך המגש. מכונת המחזור התרמית פועלת עם התוכנה המותקנת במחשב הנלווה. לחץ על הסמל של תוכנת המערכת.
      1. לחץ על צור מסמך חדש או פתח מסמך קיים (אם יש מסמך שנשמר בעבר). אשף מסמכים חדשים יופיע. הבדיקה תהיה "עקומה סטנדרטית (כימות מוחלט)". לחץ על הבא.
      2. הוסף גלאי חדש. תן שם לגלאי כ-miR-143, miR-145 ו-miR-154 בזה אחר זה על ידי לחיצה על צור אחר. בחר צבע כתב כ-"FAM" עבור כולם, ולחץ על אישור. לאחר מכן מצא את השם כ-miR-143, miR-145 ו-miR-154 והוסף אותם למסמך הגלאי על ידי לחיצה על הוסף. לאחר מכן לחץ על הבא.
      3. "הגדר לוחית לדוגמה" יופיע. בחר את הבארות לגלאי ולאחר מכן לחץ על השתמש כדי לבחור את הגלאי המתאים. לאחר מכן לחץ על סיום. אתחול המערכת יופיע.
      4. עבור אל המכשיר והגדר שלב, טמפרטורה וזמן כאמור בשלב 4.2.4. הגדר את עוצמת הקול לדוגמה ל-20 μL. לאחר מכן התחל את הריצה על ידי לחיצה על התחל. ואז שמור את הצלחת עם שם במיקום הרצוי. השעה המשוערת תופיע על המסך ליד כפתור ההתחלה. רשום את השעה.
      5. לאחר השלמתו, עבור אל קובץ | ייצוא | תוצאות ושמירת תוצאות כערכי CT במיקום הרצוי. ערכי ה-CT יהיו בקבצי .csv. פתח אותו והעתק את הערכים לקובץ גיליון אלקטרוני.
    7. הפחיתו את הממוצע של מחזור הסף המשולש (Ct) של הדגימות שטופלו בבקרת הרכב מ-Ct ממוצע של דגימות שטופלו ב-TGF-β1 כדי לחשב ΔCt. לבסוף, חשב שינוי קיפול (FC) של רמות miRNA באמצעות נוסחה 2-ΔCt. ניתן להשתמש בטרנספורמציה log2 של ערך FC לייצוג גרפי.

תוצאות

הראינו בעבר ש-TGF-β1 העלה את הרמות התאיות הכוללות של miR-145-5p, miR-143-5p ו-miR-154-5p miRNAs בתאי CFBE41o-3. לאחר מכן, השתמשנו במבחן Ago2-miRNA-co-IP כדי להבהיר את ההשפעות הפונקציונליות של TGF-β1 על miRNAs אלה. גיוס ה-RISC של miR-145-5p, miR-143-5p ו-miR-154-5p נחקר בתאי CFBE41o- המבטאים ביציבות את מווסת המוליכות הט...

Discussion

בדיקת Ago2-miRNA-co-IP נועדה לחקור את המאגר הפעיל של miRNAs בתגובה לטיפול ב-TGF-β1. ה-miRNAs הפעילים או הקשורים ל-RISC חשובים להבנת הפוטנציאל המעכב שלהם עבור ה-mRNA4 המטרה. Panshin et al. הראו לאחרונה כי יעילות המשקעים החיסוניים של Ago2 ו-miRNAs עשויה להיות תלויה בפרוטוקול16. יש?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה ואין להם מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לג'ון ווייקפילד מ-Tranzyme, Inc. (ברמינגהם, אלבמה) שיצר את תאי CFBE41o, ולג'יי.פי קלנסי מ-CFFT שסיפק את התאים. מחקר זה מומן על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01HL144539 ו-R56HL127202 (ל-A.S.-U.), ומענקי קרן סיסטיק פיברוזיס SWIATE18G0.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mM dNTPs (with dTTPs)Applied Biosystems4366596
10x Reverse Transcription Buffer (RT Buffer)Applied Biosystems4366596
2-propanolFisher BioReagentsBP2618-1
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737
7300 Real Time PCR SystemApplied Biosystems4345240
Anti-Ago2 antibody (anti-EIF2C2), mouse monoclonal against human Ago2Medical & Biological Laboratories Co. LtdRN003M
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)Thermo Scientific15260037
Collagen I (Purecol-Type I Bovie collagen solution)Advanced Biometrix50005-100mL
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma646563-.5ML
DTTSigma-Aldrich646563
EthanolDeacon Laboratories64175
Fetal Bovine SerumATLANTA BiologicalsS10350
Goat Anti-Mouse IgGBio-Rad1706516
L-glutamine (200 mM Solution; 29.20 mg/mL)Corning25-005-Cl
Mini cell scrapers United BiosystemsThermo FisherMCS-200
Minimal Essential MediumThermo Fisher Scientific11095-080
miRNA specific stem looped RT primersApplied Biosystems4427975
Mouse IgG2 controlDako, Glostrup, DenmarkA0424
MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U/µLApplied Biosystems4366596
Nano Drop ND-1000 SpectrophotometerNanoDrop Technologies, Inc.E112352
Nuclease-free waterAmbionAM9937
Opti-MEM (1x) Reduced Serum MediumGibco by Life Technologies11058-021
PBSGibco14190250
Penicillin-streptomycin, SterileSigma-AldrichP0781
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein G agarose beads (Pierce Protein G Plus Agarose)Thermo Scientific22851
PuromycinInvivoGenant-pr-1
RiboCluster Profiler RIP-Assay Kit for microRNAMedical & Biological Laboratories Co. LtdRN1005
RNase Inhibitor, 20 U/µLApplied Biosystems4366596
TaqMan 2x Universal PCR master mix without AmpErase UNGApplied Biosystems4427975
TaqMan miRNA single tube Assay (20x) containing miRNA specific forward/reverse primers and probeApplied Biosystems4427975 (assay ID #002278, #002146, and #000477)
TGF-beta1SigmaT1654
Transwell filters (24 mm)Corning Life Sciences Plastic3412
Veriti 96 Well Thermal Cycler (Model:9902)Applied Biosystems4375786

References

  1. Boguslawska, J., Kryst, P., Poletajew, S., Piekielko-Witkowska, A. TGF-beta and microRNA Interplay in Genitourinary Cancers. Cells. 8 (12), (2019).
  2. Oglesby, I. K., Chotirmall, S. H., McElvaney, N. G., Greene, C. M. Regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by microRNA-145, -223, and -494 is altered in DeltaF508 cystic fibrosis airway epithelium. Journal of Immunology. 190 (7), 3354-3362 (2013).
  3. Mitash, N., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Selectively Recruits microRNAs to the RNA-Induced Silencing Complex and Degrades CFTR mRNA under Permissive Conditions in Human Bronchial Epithelial Cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  4. Flores, O., Kennedy, E. M., Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Differential RISC association of endogenous human microRNAs predicts their inhibitory potential. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4629-4639 (2014).
  5. Janas, M. M., et al. Alternative RISC assembly: binding and repression of microRNA-mRNA duplexes by human Ago proteins. RNA. 18 (11), 2041-2055 (2012).
  6. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell Death & Differentiation. 22 (1), 22-33 (2015).
  7. Peters, L., Meister, G. Argonaute proteins: mediators of RNA silencing. Molecular Cell. 26 (5), 611-623 (2007).
  8. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Slicer and the argonautes. Nature Chemical Biology. 3 (1), 36-43 (2007).
  9. Liu, J., et al. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science. 305 (5689), 1437-1441 (2004).
  10. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 15 (2), 185-197 (2004).
  11. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. Journal of Physiology. 569, 601-615 (2005).
  13. Kramer, M. F. Stem-loop RT-qPCR for miRNAs. Current Protocols in Molecular Biology. , (2011).
  14. Swiatecka-Urban, A., et al. The short apical membrane half-life of rescued {Delta}F508-cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) results from accelerated endocytosis of {Delta}F508-CFTR in polarized human airway epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (44), 36762-36772 (2005).
  15. Hentchel-Franks, K., et al. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (2), 140-146 (2004).
  16. Panshin, D. D., Kondratov, K. A. The Efficiency of Immunoprecipitation of microRNA/Ago2 Complexes from Human Blood Plasma Is Protocol Dependent. Molekuliarnaia Biologiia. 54 (2), 244-251 (2020).
  17. Akerström, B., Brodin, T., Reis, K., Björck, L. Protein G: a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of Immunology. 135 (4), 2589-2592 (1985).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ago2 miRNA co IPTGF 1RISCMiRNARNA2PCRMiRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved