La nostra ricerca fornisce un'utile guida per studiare l'interazione biochimica tra il microbacterium tuberculosis e i sensori microbici che esprimono i microfagi umani e sarà rilevante per le molecole più rigide che svolgono un ruolo nell'ingresso del microbacterium tuberculosis nei fibrociti. L'interazione recettoriale è stata studiata nel corso degli anni utilizzando approcci che solitamente impiegano l'uso di macchine reporter, molecole ermetiche, proteine ricombinanti livellate, knockout, knockdown, modelli a bassa espressione. Queste tecniche possono essere impegnative, richiedere molto tempo e talvolta essere costose.
Utilizzando il protocollo pubblicato, dimostriamo, per la prima volta, che nei macrofagi, il recettore SLMF1 interagisce con il mycobacterium tuberculosis, promuovendo l'assorbimento batterico e portando alla maturazione endolisosomiale. Abbiamo superato le difficoltà associate agli esperimenti di espressione genica e abbiamo descritto un nuovo bersaglio per nuove strategie terapeutiche. Il nostro protocollo offre due alternative per rilevare l'interazione biochimica tra il microbatterio tubercolosi e il sensore microbico SLMF1 utilizzando la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza, due tecniche solitamente disponibili e utilizzate in modo fruttuoso.
Questa metodologia ha molti usi potenziali e può essere facilmente adattata in altri contesti di ricerca. Forniamo un semplice protocollo che valuta l'interazione del recettore del mycobacterium tuberculosis utilizzando batteri inattivati e sonicati a cellule intere, che può essere eseguito in condizione BSL2, ma facilmente adattabile ad altri recettori e ceppi vivi. Se necessario, questi saggi potrebbero essere eseguiti anche in condizioni BSL3 con diversi agenti patogeni vivi.
Per iniziare, trasferire con cura il sangue raccolto da donatori sani in provette da 50 millilitri e diluirlo a metà del suo volume con soluzione fisiologica. Preparare un mezzo a gradiente di densità e centrifugare il campione per separare le cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC. Raccogliere le PBMC dall'alone biancastro.
Dopo aver contato le cellule in una camera di conteggio cellulare, eseguire la selezione magnetica con perle CD14 per raccogliere i monociti CD14 positivi. Quindi risospendere le celle isolate nel terreno RPMI 1640. Seminare 500 microlitri di monociti CD14 positivi a una concentrazione di una volta 10 alla potenza di sei cellule per millilitro in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti in assenza di siero per promuovere l'aderenza.
Dopo due ore, lavare i pozzetti con terreno RPMI 1640 preriscaldato per rimuovere le cellule non aderenti. Differenziare i monociti in macrofagi utilizzando un millilitro di terreno RPMI 1640 completo per 16-18 ore. Il giorno successivo, lavare i pozzetti con un millilitro di PBS e aggiungere un millilitro di terreno RPMI 1640 completo a ciascun pozzetto.
Stimolare i macrofagi con 10 microlitri di antigeni sonicati del mycobacterium tuberculosis per 24 ore. Il giorno seguente, utilizzando una pipetta P-1000, scartare l'intero mezzo RPMI dai pozzetti della piastra. Aggiungere il PBS freddo e pipettare su e giù per raccogliere i macrofagi.
Trasferire le celle in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un tampone di saggio di radioimmunoprecipitazione integrato.
Incubare la sospensione su ghiaccio per un'ora, vorticando ogni 10 minuti. Centrifugare la sospensione a 14.000 G per 15 minuti e raccogliere il surnatante. Incubare una volta 10 alla potenza di sei cellule intere inattivate di mycobacterium tuberculosis con 50 microlitri di estratto proteico da una volta a 10 alla potenza di sei macrofagi durante la notte a quattro gradi Celsius in un supporto per microprovette rotante.
Il giorno successivo, per colorare il complesso proteico batterico, aggiungere l'anticorpo anti-SLAMF1 umano al microtubo, agitare la miscela e incubare per una notte per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo aver lavato i complessi proteici batterici con FACS, risospenderli nel tampone FACS e acquisire il campione su un citometro a flusso. Utilizzando una pinzetta chirurgica a muso rotondo, posizionare dei vetrini di copertura rotondi da 12 millimetri nei pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti.
Incubare il vetrino coprioggetto con gli antigeni della rodamina del mycobacterium tuberculosis per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri di estratto proteico diluito in 300 microlitri di PBS e incubare per due ore a temperatura ambiente agitando. Avvolgere il coperchio della piastra di coltura con una pellicola di paraffina.
Aggiungere una goccia da 60 microlitri di anticorpo primario anti SLAMF1 precedentemente titolato sul coperchio coperto di film di paraffina. Rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto dalla piastra utilizzando pinzette chirurgiche e aghi a punta fine curva. Dopo l'incubazione con la soluzione di anticorpi primari e secondari, rimuovere il liquido in eccesso e montare il vetrino coprioggetto su una goccia di liquido di montaggio posta su un vetrino.
Posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza e osservare le cellule utilizzando filtri appropriati. I monociti sono stati isolati con successo da PBMC con una purezza del 95% o superiore e i macrofagi derivati dai monociti sono stati generati dopo l'adesione e la coltura notturna. L'espressione di superficie di SLAMF1 è stata indotta nei macrofagi stimolati con antigeni del Mycobacterium tuberculosis e i suoi livelli sono stati confermati mediante citometria a flusso.
L'interazione tra SLAMF1 e le cellule intere del mycobacterium tuberculosis è stata dimostrata utilizzando un saggio di cross-linking seguito da citometria a flusso. L'interazione tra gli antigeni SLAMF1 e Mycobacterium tuberculosis è stata visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza con la co-localizzazione confermata da immagini unite.
