Наше исследование является полезным руководством для изучения биохимического взаимодействия между микробактериями туберкулеза и микробными сенсорами, экспрессирующими микрофаги человека, и будет актуально для более жестких молекул, которые играют роль в проникновении микробактерий туберкулеза в фиброциты. Взаимодействие рецепторов изучалось на протяжении многих лет с использованием подходов, которые обычно используют репортерные машины, герметичные молекулы, выровненные рекомбинантные белки, нокаут, нокдаун, модели с более низкой экспрессией. Эти методы могут быть сложными, трудоемкими, а иногда и дорогостоящими.
Используя опубликованный протокол, мы впервые показываем, что в макрофагах рецептор SLMF1 взаимодействует с микобактерией туберкулеза, способствуя поглощению бактериями и приводя к эндолизосомному созреванию. Мы преодолели трудности, связанные с экспериментами по экспрессии генов, и описали новую мишень для новых терапевтических стратегий. Наш протокол предлагает две альтернативы для обнаружения биохимического взаимодействия между микробактерией туберкулеза и микробным сенсором SLMF1 с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии, двух обычно доступных и плодотворно используемых методов.
Эта методология имеет множество потенциальных применений и может быть легко адаптирована в других исследовательских контекстах. Мы предоставляем простой протокол, который оценивает взаимодействие рецепторов микобактерий туберкулеза с использованием инактивированных и обработанных ультразвуком цельных клеток, что может быть выполнено в условиях BSL2, но легко адаптировано к другим рецепторам и живым штаммам. При необходимости эти анализы также могут быть выполнены в условиях BSL3 с различными живыми патогенами.
Для начала осторожно переложите кровь, собранную у здоровых доноров, в 50 миллилитровые пробирки и разведите ее до половины объема физиологическим раствором. Приготовьте среду с градиентом плотности и центрифугируйте образец для отделения мононуклеарных клеток периферической крови, ПМЦ. Соберите ПМК из белесого ореола.
После подсчета клеток в камере для подсчета клеток выполните магнитный отбор с помощью гранул CD14 для сбора CD14-положительных моноцитов. Затем изолированные клетки ресуспендируются в среде RPMI 1640. Засейте 500 микролитров CD14-положительных моноцитов в концентрации один умно-10 в степени шести клеток на миллилитр в каждую лунку 24-луночного клеточного культурального планшета в отсутствие сыворотки крови для повышения адгезии.
Через два часа промойте лунки предварительно подогретой средой RPMI 1640 для удаления неприлипших клеток. Дифференцируйте моноциты в макрофаги, используя один миллилитр полной среды RPMI 1640 в течение 16–18 часов. На следующий день промойте лунки одним миллилитром PBS и добавьте по одному миллилитру полного фильтрующего материала RPMI 1640 в каждую лунку.
Стимулируйте макрофаги 10 микролитрами ультразвукированных антигенов микобактерий туберкулеза в течение 24 часов. На следующий день с помощью пипетки P-1000 отбросьте всю среду RPMI из лунок планшета. Добавьте холодный PBS и пипетку вверх и вниз, чтобы собрать макрофаги.
Переложите ячейки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в буфере для радиоиммуноципитуального анализа.
Инкубируйте суспензию на льду в течение одного часа, совершая вихревой массаж каждые 10 минут. Центрифугируйте суспензию при 14 000G в течение 15 минут и соберите надосадочную жидкость. Инкубируйте один раз по 10 в степени шести целых инактивированных клеток микобактерий туберкулеза с 50 микролитрами белкового экстракта из одного раза по 10 до шести макрофагов в течение ночи при четырех градусах Цельсия во вращающемся держателе микропробирки.
На следующий день, чтобы окрасить комплекс белковых бактерий, добавьте античеловеческое антитело SLAMF1 в микропробирку, перемешайте смесь и инкубируйте в течение ночи в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте. После промывки комплексов белковых бактерий с помощью FACS ресуспендируйте их в буфере FACS и получите образец на проточном цитометре. С помощью хирургического пинцета с круглым носиком поместите 12-миллиметровую круглую крышку в лунки 24-луночного планшета для культивирования.
Инкубируйте покровный лист с антигенами родамина микобактерий туберкулеза в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации добавьте 100 микролитров белкового экстракта, разведенного в 300 микролитрах PBS и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре с перемешиванием. Оберните крышку тарелки для культуры парафиновой пленкой.
Добавьте каплю 60 микролитров предварительно титрованного первичного антитела против SLAMF1 на крышку, покрытую парафиновой пленкой. Осторожно снимите покровное стекло с пластины с помощью изогнутого хирургического пинцета с тонким концом и иглы. После инкубации с первичным и вторичным раствором антител удалите лишнюю жидкость и закрепите защитное стекло на каплю монтажной жидкости, помещенную на предметное стекло.
Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп и понаблюдайте за клетками с помощью соответствующих фильтров. Моноциты были успешно выделены из PBMC с чистотой 95% или выше, а макрофаги, полученные из моноцитов, были получены после приверженности и ночного культивирования. Поверхностная экспрессия SLAMF1 индуцировалась в макрофагах, стимулированных антигенами микобактерий туберкулеза, и ее уровни были подтверждены с помощью проточной цитометрии.
Взаимодействие между SLAMF1 и целыми клетками микобактерий туберкулеза было продемонстрировано с помощью анализа поперечного сшивания с последующей проточной цитометрией. Взаимодействие между антигенами SLAMF1 и Mycobacterium tuberculosis визуализировалось с помощью флуоресцентной микроскопии с колокализацией, подтвержденной объединенными изображениями.
