Abbiamo sviluppato un metodo cromatografico rapido che separa i componenti della reazione IVT e può essere utilizzato per monitorare il consumo di NTP e la produzione di mRNA. Con questo metodo possiamo ottimizzare la reazione IVT, massimizzare la resa dell'mRNA riducendo al minimo la formazione di impurità di processo e il costo della reazione. La nostra metodologia è stata pionieristica nel campo dell'mRNA, dimostrando come l'accoppiamento dei dati analitici della reazione IVT possa portare a rese più elevate e costi inferiori.
Il settore sta ora esplorando altri strumenti analitici di processo in linea, come la spettroscopia Raman, ma la cromatografia mantiene ancora un posto centrale grazie al suo potere risolutivo e all'elevata velocità. Abbiamo mostrato come acquisire strumenti analitici ad alta produttività con la progettazione di software sperimentali per ottenere un'ottimizzazione completa della reazione IVT. Ciò ha portato alla massima resa di reazione IVT di 25 grammi per litro.
Il nostro metodo consente di monitorare contemporaneamente le concentrazioni di mRNA e NTP con tempi di lettura brevi, quindi è adatto per il monitoraggio IVT quasi in tempo reale. Il campo dell'mRNA si sta ora muovendo verso la produzione continua di mRNA e, naturalmente, stiamo sviluppando strumenti di nuova generazione per supportare questa transizione. Per iniziare, scongelare e preriscaldare tutti i reagenti, ad eccezione degli enzimi, a 37 gradi Celsius per 15 minuti in un blocco termico impostato a 300 giri al minuto.
Contrassegnare ogni provetta con un numero e un punto temporale designati per la trascrizione in vitro o l'IVT. Mentre i reagenti si scongelano, pipettare due microlitri di EDTA da 100 millimolari in provette sterili da 0,5 millilitri. Ora togliete gli enzimi dal congelatore e conservateli temporaneamente in un frigorifero.
Preparare da 50 a 100 microlitri della miscela di reazione con volumi appropriati di reagenti IVT. Aggiungere l'RNA polimerasi T7 come ultimo reagente quando tutti i reagenti IVT sono miscelati. Rimuovere immediatamente due microlitri della miscela IVT e pipettarla in provette da 0,5 millilitri precedentemente preparate contenenti due microlitri di EDTA.
Posizionare le provette di reazione contenenti miscele IVT nel blocco termico e incubarle a 37 gradi Celsius. A ogni punto temporale desiderato, rimuovere due microlitri del campione IVT dalla miscela di reazione e pipettare in provette contenenti EDTA. Dopo che l'analisi cromatografica conferma la completa deplezione degli NTP, estinguere le reazioni IVT di massa con EDTA a una concentrazione finale di 50 millimolari.
Per la reazione IVT Fed-Batch, mescolare le scorte di ciascun NTP e cloruro di magnesio. Dopo aver impostato la reazione, quando la concentrazione di NTP scende al di sotto del 10%, aggiungere un volume appropriato di mangime alla reazione IVT di massa. Una volta raggiunta la produzione di mRNA desiderata, inattivare l'intera reazione con EDTA fino a una concentrazione finale di 50 millimolari.
Per il condizionamento della colonna, equilibrare una colonna analitica da 0,1 millilitri a temperatura ambiente per 12 ore prima dell'analisi. Fissare la colonna al sistema cromatografico, seguendo la direzione indicata sull'alloggiamento della colonna. Quindi lavare la colonna con 50 volumi di colonna di acqua bidistillata seguiti da 50 volumi di colonna di MPA a una portata di un millilitro al minuto.
Quindi, eseguire almeno tre campioni bianchi iniettando solo MPA prima dell'analisi per stabilire la linea di base. Procedere ora con l'analisi del campione di prova di idoneità del sistema e dei campioni della curva di calibrazione. Per il test di idoneità del sistema, combinare il reagente di capping NTP, il modello di DNA plasmidico e l'mRNA.
Ora creare lo standard di calibrazione utilizzando il campione di mRNA purificato diluito di concentrazione nota con fase mobile A.Se necessario, creare standard con concentrazioni finali di NTP di 0,5, due, cinque, 10, 15 e 20 micromolari per generare la curva di calibrazione per tutti gli NTP. Determinare la diluizione minima necessaria per i campioni IVT utilizzando la formula. Prima di diluire per l'analisi cromatografica, agitare e centrifugare il campione IVT temprato.
Pipettare l'MPA e il cloruro di sodio in una fiala di vetro conica, quindi aggiungere il campione IVT temprato. Agitare il campione preparato e caricarlo nell'autocampionatore, impostato a quattro gradi Celsius. Iniettare 25 microlitri del campione diluito sulla colonna analitica e misurare l'assorbanza a 260 e 280 nanometri per ogni campione IVT.
Dopo aver completato l'analisi di tutti i campioni IVT, iniettare nuovamente lo standard del test di idoneità del sistema per confermare la stabilità del sistema. La rapida analisi in linea consente di monitorare la produzione di mRNA nel tempo. In questo esperimento, abbiamo confrontato l'influenza della composizione del tampone IVT sulla cinetica IVT.
L'IVT eseguita con il tampone A ha determinato il più alto tasso di produzione di mRNA, seguita dal tampone B e dal tampone C. La reazione IVT può essere eseguita anche come Fed-Batch. Il monitoraggio del consumo di NTP consente di regolare la concentrazione alimentando la reazione con NTP e cloruro di magnesio. Poiché le aggiunte di mangime diluiscono la reazione IVT, la concentrazione di mRNA in IVT diminuisce ad ogni edizione del mangime.
