L'interazione proteina-proteina nella trascrizione è stata tradizionalmente studiata usando la dialisi del Por. Tuttavia, la por dialisi è puramente quantitativa. Usiamo l'interferometria del biostrato, o BLI, per superare questo problema.
Rispetto a Por dan, BLI rileva l'associazione e la dissociazione in tempo reale tra i partner di legame. Genera anche parametri cinetici quantitativi, che sono indicativi dei meccanismi di interazione. La tecnologia BLI può sembrare intimidatoria, ma non è difficile imparare A utilizzare questa tecnologia, è necessario avere l'accesso a uno strumento BLI e al software associato.
Questo video ti permetterà di adattarti facilmente alla tecnologia BLI. Circa 10 minuti prima dell'inizio di un test, pipettare 200 microlitri del tampone BLI in un tubo PCR. Rimuovere un biosensore in nichel NTA dalla confezione originale tenendo l'ampia porzione del biosensore utilizzando una mano guantata.
Posizionare il biosensore sul tubo PCR in modo che solo la punta di vetro del biosensore sia immersa nel buffer BLI. Mantenere la punta del biosensore sommersa per almeno 10 minuti per garantire la piena idratazione. Accendi la macchina Blitz.
Assicurarsi che la macchina sia collegata al computer tramite una porta di uscita dati USB sul retro della macchina. Sul computer, aprire il software associato e fare clic su Cinetica avanzata sul lato sinistro dello schermo. Nel software, digitare tutte le informazioni appropriate sull'esperimento sotto ogni rispettiva voce.
Fate clic su Tipo biosensore (Biosensor Type) e scegliete Nickel NTA dal menu a discesa. La durata di ogni passaggio può essere modificata rispetto all'impostazione predefinita in base alle esigenze. Per risultati ottimali utilizzare almeno 30 secondi per la linea di base iniziale e la linea di base e 120 secondi per l'associazione e la dissociazione.
Rimuovere il biosensore idratato in nichel NTA dal tubo PCR e apporrlo sul supporto del biosensore sulla macchina facendo scorrere l'ampia porzione del biosensore sul supporto. Inserire un tubo di microcentrifugo nero da 0,5 millilitri nel supporto del tubo della macchina e pipettare 400 microlitri di tampone BLI. Chiudere il coperchio della macchina in modo che la punta del biosensore diventi sommersa nel tampone nel tubo di microcentrifugo.
Fare clic su Avanti sul software per iniziare a registrare la linea di base iniziale. Al termine della registrazione del passaggio di base iniziale, aprire il coperchio della macchina. Spostare il dispositivo di scorrimento verso destra, in modo che il portaoccioline si trova di fronte alla freccia nera.
Pipettare quattro microlitri di un ligando dializzato is-taggato sul portaocciolo e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare la fase di caricamento. Al termine della registrazione della fase di caricamento, aprire il coperchio della macchina. Spostare il dispositivo di scorrimento a sinistra, in modo che il supporto del tubo sia ancora una volta situato di fronte alla freccia nera.
Chiudere il coperchio della macchina e assicurarsi che la punta del biosensore sia immersa nel tampone BLI del tubo nel supporto del tubo. La macchina e il software inizieranno automaticamente a registrare il passaggio di base. Al termine della registrazione del passaggio di base, aprire il coperchio della macchina.
Rimuovere il portagocciola e pulirlo pipettando qualsiasi proteina e risciacquarla con acqua doppia deionizzata per un totale di cinque volte. Utilizzare una salvietta tissutale per pulire la superficie del portaocciole dopo l'ultimo lavaggio. Sostituire di nuovo il portaocciolo sulla macchina.
Spostare il cursore sulla macchina a destra, in modo che il portaoccioline sia ancora una volta situato di fronte alla freccia nera. Pipettare quattro microlitri di un alita dializzato sul portapenne e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare la fase di associazione. Al termine della registrazione della fase di associazione, aprire il coperchio della macchina.
Spostare il cursore sulla macchina a destra, in modo che il supporto del tubo sia ancora una volta situato di fronte alla freccia nera e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare il passaggio di dissociazione. Al termine della registrazione della fase di dissociazione, aprire il coperchio della macchina e rimuovere il portagoccioline e il supporto del tubo. Risciacquare accuratamente entrambi con acqua doppia deionizzata per lavare via qualsiasi proteina.
Rimuovere il biosensore e scartarlo in modo sicuro. Ripetere questi passaggi per la stessa coppia di aliti ligandi utilizzando diverse concentrazioni di aliti. Una volta terminate tutte le esecuzioni, salvare i dati sul software facendo clic su File e Salva esperimento con nome sul lato sinistro dello schermo.
Nell'intestazione Esegui dati selezionare Correzione passo e Raccordo uno a uno e fare clic su Analizza per generare dati cinetici. Per estrarre i dati quantitativi in un foglio di lavoro e generare grafici, fare clic su Esporta in CSV e salvare i dati registrati come file CSV. Aprire il file CSV utilizzando un software per fogli di calcolo.
GrgA a figura intera è composto da 288 amminoacidi. Come mostrato qui, una regione media di 28 amminoacidi lega direttamente Sigma 28. Qui la regione centrale contrassegnata con un terminale finale His-tag è stato usato come ligando, che è stato prima immobilizzato sulla punta di un biosensore di nichel NTA.
Vengono mostrate registrazioni di esperimenti con tre diverse concentrazioni di aliti ciascuna che iniziano 30 secondi prima del legame del ligando e terminano due minuti dopo l'inizio dell'ultimo lavaggio. Una migliore visualizzazione dell'associazione e della dissociazione degli aliti ligandi è mostrata dopo la rimozione dei valori nelle prime due fasi e il ripristino della linea di base. Dopo aver lavato il GrgA 138-165 non legato e terminale dal biosensore, l'associazione in tempo reale con l'alyte è stata registrata in seguito all'aggiunta di Sigma 28.
Infine, la dissociazione in tempo reale è stata registrata dopo il lavaggio. Prima che il BLI dica, il glicerolo viene rimosso da ligandi e aaliti. Si consiglia di eseguire BLI subito dopo la dialisi, come discusso nel testo.
Dopo aver caratterizzato le interazioni proteina-proteina nella trascrizione con la BLI, si può indagare come l'interazione influenzi l'iniziazione della trascrizione, l'allungamento e o la terminazione.
