Nous avons développé une méthode de chromatographie rapide qui sépare les composants de la réaction IVT et peut être utilisée pour surveiller la consommation de NTP et la production d’ARNm. Avec cette méthode, nous pouvons optimiser la réaction IVT, maximiser le rendement de l’ARNm tout en minimisant la formation d’impuretés de processus et le coût de la réaction. Notre méthodologie a été pionnière dans le domaine de l’ARNm, montrant comment le couplage des données analytiques de la réaction IVT peut conduire à des rendements plus élevés et à des coûts réduits.
Le domaine explore maintenant d’autres outils d’analyse de processus en ligne, tels que la spectroscopie Raman, mais la chromatographie conserve toujours une place centrale en raison de son pouvoir de résolution et de sa vitesse élevée. Nous avons montré comment capturer des outils analytiques à haut débit avec un logiciel de conception d’expérience pour optimiser complètement la réaction IVT. Cela a conduit à un rendement le plus élevé de 25 grammes par litre.
Notre méthode permet de surveiller simultanément les concentrations d’ARNm et de NTP avec des temps de lecture courts, et convient donc à la surveillance IVT en temps quasi réel. Le domaine de l’ARNm s’oriente maintenant vers la poursuite de la fabrication d’ARNm, et nous développons bien sûr des outils de nouvelle génération pour soutenir cette transition. Pour commencer, décongelez et préchauffez tous les réactifs, à l’exception des enzymes, à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bloc thermique réglé à 300 tours par minute.
Marquez chaque tube avec un numéro de transcription in vitro ou IVT et un point temporel. Pendant que les réactifs décongèlent, pipetez deux microlitres d’EDTA de 100 millimolaires dans des tubes stériles de 0,5 millilitre. Sortez maintenant les enzymes du congélateur et conservez-les temporairement dans une glacière.
Préparez 50 à 100 microlitres du mélange réactionnel avec des volumes appropriés de réactifs IVT. Ajouter l’ARN polymérase T7 comme dernier réactif lorsque tous les réactifs IVT sont mélangés. Retirez immédiatement deux microlitres du mélange IVT et pipetez-le dans des tubes de 0,5 millilitre préalablement préparés contenant deux microlitres d’EDTA.
Placez les tubes réactionnels contenant des mélanges IVT dans le bloc thermique et incuberez-les à 37 degrés Celsius. À chaque point de temps souhaité, prélever deux microlitres de l’échantillon IVT du mélange réactionnel et pipeter dans des tubes contenant de l’EDTA. Après que l’analyse chromatographique a confirmé l’épuisement complet des NTP, tremper les réactions IVT en vrac avec l’EDTA jusqu’à une concentration finale de 50 millimolaires.
Pour la réaction IVT Fed-Batch, mélangez des stocks de chaque NTP et de chlorure de magnésium. Après avoir configuré la réaction, lorsque la concentration de NTP descend en dessous de 10 %, ajoutez un volume approprié de l’alimentation à la réaction IVT en vrac. Une fois que la production d’ARNm souhaitée est atteinte, inactivez toute la réaction avec de l’EDTA jusqu’à une concentration finale de 50 millimolaires.
Pour le conditionnement de la colonne, équilibrez une colonne d’analyse de 0,1 millilitre à température ambiante pendant 12 heures avant l’analyse. Fixez la colonne au système chromatographique, en suivant la direction indiquée sur le boîtier de la colonne. Ensuite, rincez la colonne avec 50 volumes de colonne d’eau distillée double suivie de 50 volumes de colonne de MPA à un débit d’un millilitre par minute.
Ensuite, analysez au moins trois échantillons vierges en injectant uniquement du MPA avant l’analyse pour établir la ligne de base. Passez maintenant à l’analyse de l’échantillon d’essai d’adéquation du système et des échantillons de la courbe d’étalonnage. Pour le test d’adéquation du système, combinez le réactif de coiffage NTP, la matrice d’ADN plasmidique et l’ARNm.
Créez maintenant l’étalon à l’aide de l’échantillon d’ARNm purifié dilué de concentration connue avec la phase mobile A.Si nécessaire, créez des étalons avec des concentrations finales NTP de 0,5, deux, cinq, 10, 15 et 20 micromolaires pour générer la courbe d’étalonnage pour tous les NTP. Déterminez la dilution minimale nécessaire pour les échantillons IVT à l’aide de la formule. Avant de diluer pour l’analyse chromatographique, tourbillonnez et faites tourner l’échantillon IVT trempé.
Pipetez le MPA et le chlorure de sodium dans un flacon en verre conique, puis ajoutez l’échantillon IVT trempé. Vortex l’échantillon préparé et chargez-le dans l’échantillonneur automatique, réglé à quatre degrés Celsius. Injectez 25 microlitres de l’échantillon dilué dans la colonne analytique et mesurez l’absorbance à 260 et 280 nanomètres pour chaque échantillon IVT.
Après avoir terminé l’analyse de tous les échantillons IVT, injectez à nouveau l’étalon de test d’adéquation du système pour confirmer la stabilité du système. L’analyse rapide en ligne permet de surveiller la production d’ARNm au fil du temps. Dans cette expérience, nous avons comparé l’influence de la composition du tampon IVT sur la cinétique IVT.
L’IVT réalisée avec le tampon A a entraîné le taux le plus élevé de production d’ARNm, suivi du tampon B et du tampon C. La réaction IVT peut également être effectuée en tant que Fed-Batch. Le suivi de la consommation de NTP permet d’ajuster la concentration en alimentant la réaction en utilisant des NTP et du chlorure de magnésium. Étant donné que les ajouts d’aliments diluent la réaction IVT, la concentration d’ARNm dans l’IVT diminue à chaque édition de l’aliment.
