Questo protocollo è significativo perché le cellule lin-negative e le cellule SK isolate dagli stessi topi donatori non avevano alcuna differenza apparente nella generazione di LMA indotta da MLL-AF9. Inoltre, l'iniezione IP di cellule leucemiche può sviluppare con successo un modello murino di LMA. Rispetto ai metodi di trapianto convenzionali, questa tecnica è più conveniente e meno costosa.
Per iniziare, sterilizzare il topo femmina CD45.1 C57BL/6J di 8-10 settimane con etanolo al 70%. Posizionare il mouse su un tampone chirurgico sterile su una tavola di polistirolo e fissare le gambe attraverso le zampe del mouse. Tagliare la pelle sopra la cavità addominale sulla linea mediana e allargare lo spazio sottocutaneo verso le zampe posteriori con forbici sterili affilate.
Estendere l'incisione dalla linea mediana addominale fino alle caviglie e allargare lo spazio sottocutaneo sotto le zampe posteriori con le lame delle forbici affilate. Tagliare il tendine d'Achille con forbici affilate. Tenere il tendine usando una pinza con i denti e tagliare l'altra estremità attaccata al femore per rimuovere il muscolo gastrocnemio.
Tagliare il tendine del quadricipite attaccato al ginocchio con forbici affilate. Tenere il tendine e tagliare la testa muscolare attaccata al femore per rimuovere il muscolo gastrocnemio. Tagliare gli altri muscoli che circondano il femore all'estremità attaccata alla tibia.
Quindi, tagliare la caviglia con forbici affilate, assicurandosi che la tibia rimanga intatta. Tenere l'estremità distale del femore e tagliare l'articolazione dell'anca con forbici affilate, assicurandosi che la testa del femore rimanga intatta. Trasferire le tibie e i femori in un tampone di flusso in un tubo da 15 millilitri.
Separare la tibia e il femore rompendo il ginocchio a mano. Rimuovere la rotula, la cartilagine e i condili femorali per esporre il plateau tibiale e il femore distale. Rimuovere i muscoli con una garza sterile e immergere le ossa in un tampone di flusso.
Tagliare il collo del femore e lavare le cellule del midollo osseo con tampone di flusso da entrambe le estremità del femore utilizzando una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 23. Quindi, tagliare il malleolo tibiale e lavare le cellule del midollo osseo con tampone di flusso da entrambe le estremità della tibia. Disperdere le cellule pipettando su e giù usando una siringa da 10 millilitri con un ago da 18 gauge.
Centrifugare la sospensione monocellulare a quattro gradi Celsius e 400 G per tre minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di globuli rossi, o RBC, tampone di lisi per lisare i globuli rossi per tre minuti. Aggiungere cinque millilitri di tampone di flusso per fermare la lisi.
Quindi centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di flusso. Posizionare un filtro cellulare da 70 micron su un tubo da 50 millilitri e passare la sospensione attraverso il filtro per raccogliere le celle. Regolare la concentrazione della cella con tampone di flusso a una volta 10 all'otto per millilitro in tubi di polipropilene a fondo tondo.
Selezionare le cellule negative del lignaggio utilizzando un kit di isolamento delle cellule ematopoietiche del topo secondo le istruzioni del produttore. Una volta fatto, centrifugare le cellule staminali ematopoietiche selezionate e le cellule negative del lignaggio non selezionate e risospendere in tre millilitri di 2X di citochine, mezzi IMDM e tre millilitri di surnatante virale in un piatto rivestito retro-riducente. Incubare il piatto in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 6 o 24 ore.
Dopo la trasduzione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Se necessario, utilizzare la tripsina per raccogliere le cellule attaccate al fondo del piatto. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in PBS preriscaldato.
Iniettare cellule nel topo ricevente primario retroorbitalmente o intraperitonealmente con un mezzo ago calibro 27. Monitorare il mouse ogni giorno. Dopo un mese, raccogliere il sangue settimanalmente mediante sanguinamento retroorbitale per monitorare la leucocitosi valutando l'emocromo completo su un HEMAVET.
Proptose l'occhio con il pollice e l'indice, quindi penetrare nel plesso del seno venoso con un tubo capillare ematocrito sterile attraverso il canto interno. Raccogliere da 20 a 25 microlitri di sangue in un tubo di raccolta del sangue EDTA e chiudere le palpebre per fermare l'emorragia. Applicare una goccia di soluzione oftalmica di gentamicina solfato sull'occhio.
Quando i globuli bianchi raggiungono quattro volte 10 alle quattro cellule per microlitro, isolare le cellule del midollo osseo lavando i femori e le tibie con tampone di flusso, seguito da lisi dei globuli rossi come descritto in precedenza. Successivamente, per raccogliere gli splenociti, posizionare il mouse su un tampone chirurgico sterile su una tavola di polistirolo e fissare le gambe attraverso le zampe del topo. Sterilizzare il mouse con etanolo al 70%.
Tagliare la pelle e il muscolo sulla linea mediana per esporre la cavità addominale con forbici sterili affilate. Isolare la milza e metterla in un buffer di flusso in un tubo da 15 millilitri. Mescolare la milza attraverso un filtro da 70 micron in un piatto di sei centimetri con tre millilitri di buffer di flusso.
Trasferire le cellule dal piatto a un tubo da 15 millilitri, quindi centrifugare la sospensione monocellulare, scartare il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di lisi RBC per tre minuti. Aggiungere cinque millilitri di tampone di flusso per fermare la lisi e centrifugare la sospensione cellulare. Risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di flusso, mescolare e passare attraverso un filtro a celle da 70 micron per raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri.
Identificare le cellule della leucemia mieloide acuta primaria, o LMA, colorando gli splenociti e le cellule del midollo osseo con l'anticorpo CD45.1 coniugato FITC e rilevando su un citometro a flusso. Le cellule vengono prima controllate su FSC-A FSC-H e FSC-A SSC-A per acquisire singoletti. La popolazione CD45.1 positiva è controllata sul grafico FL1 confrontandolo con le cellule non colorate.
Per il trapianto secondario, risospendere le cellule spleniche LMA CD45.1 da riceventi retroorbitali primari in PBS e iniettarle retroorbitalmente nel topo maschio CD45.2. La presenza di leucocitosi aberrante e una maggiore infiltrazione di cellule leucemiche nel midollo osseo e nella milza supporta la fattibilità dell'utilizzo di cellule negative del midollo osseo per generare LMA primaria. Non sono state osservate differenze significative nei riceventi primari tradotti con LSK o cellule negative per il lignaggio.
Le cellule AML si diffondono nella cavità addominale dei riceventi primari dalla leucemia a linea mista o dalle cellule negative trasdotte della linea MLL-AF9. Questi risultati hanno anche confermato l'istituzione di LMA primaria tramite iniezione intraperitoneale di cellule negative della linea del midollo osseo trasdotte MLL-AF9 sotto forma di leucocitosi e la presenza di cellule LMA nel midollo osseo e nella milza dei topi riceventi. Tuttavia, il trapianto primario tramite iniezione intraperitoneale ha richiesto più tempo per sviluppare AML rispetto all'iniezione retro-orbitale nonostante lo stesso numero di cellule donatrici.
I riceventi secondari hanno mostrato leucocitosi ed epatosplenomegalia significativa in meno di un mese dopo il trapianto. Le cellule AML sono state rilevate anche nel sangue periferico, nel midollo osseo e nella milza, nonché nella cavità peritoneale. L'iniezione intraperitoneale di otto volte 10 alle cinque cellule AML ha ottenuto un attecchimento paragonabile all'iniezione retro-orbitale di otto volte 10 alle cinque AML.
I topi riceventi terziari mostravano acutamente segni di LMA tra cui leucocitosi ed epatosplenomegalia, presenza di cellule leucemiche nel sangue, nel midollo osseo e nella milza, l'osservazione istologica del femore e della milza dimostravano ulteriormente l'infiltrazione delle cellule leucemiche. Rispetto ai trapianti secondari e terziari, il trapianto terziario è progredito molto più velocemente del trapianto secondario. Per il modello corrente, l'ordinamento delle celle LSK non è necessario.
Le cellule Lin-negative possono essere trasdotte con il virus AML per 6 ore o 24 ore. Non influirà sull'efficienza dell'istituzione del modello.
