هذا البروتوكول مهم لأن الخلايا سالبة الخط وخلايا SK المعزولة من نفس الفئران المانحة لم يكن لها فرق واضح في توليد AML الناجم عن MLL-AF9. أيضا ، يمكن لحقن IP لخلايا اللوكيميا تطوير نموذج ماوس من AML بنجاح. بالمقارنة مع طرق الزرع التقليدية ، فإن هذه التقنية أكثر ملاءمة وأقل تكلفة.
للبدء ، قم بتعقيم أنثى الماوس C57BL / 6J CD45.1 البالغة من العمر 8 إلى 10 أسابيع باستخدام 70٪ من الإيثانول. ضع الماوس على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الأرجل من خلال وسادات مخلب الماوس. قطع الجلد فوق تجويف البطن عند خط الوسط وتوسيع المساحة تحت الجلد نحو الساقين الخلفيتين بمقص معقم حاد.
قم بتمديد الشق من خط الوسط البطني وصولا إلى الكاحلين وقم بتوسيع المساحة تحت الجلد أسفل الساقين الخلفيتين باستخدام شفرات المقص الحاد. قطع وتر العرقوب بمقص حاد. امسك الوتر باستخدام ملقط مع الأسنان واقطع الطرف الآخر المتصل بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق.
قطع وتر عضلات الفخذ تعلق على الركبة مع مقص نهاية حادة. امسك الوتر واقطع رأس العضلة المتصل بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق. قطع العضلات الأخرى المحيطة بعظم الفخذ في النهاية متصلة بالساق.
بعد ذلك ، قم بقص الكاحل بمقص حاد ، مع التأكد من بقاء الساق سليمة. امسك الطرف البعيد من عظم الفخذ واقطع مفصل الورك بمقص حاد ، مع التأكد من بقاء رأس الفخذ سليما. نقل القصبة وعظم الفخذ إلى مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب سعة 15 ملليلتر.
افصل بين الساق وعظم الفخذ عن طريق كسر الركبة باليد. قم بإزالة الرضفة والغضاريف واللقمات الفخذية لكشف هضبة الظنبوب وعظم الفخذ البعيد. قم بإزالة العضلات باستخدام شاش معقم ونقع العظام في مخزن مؤقت للتدفق.
قطع عنق الفخذ وغسل خلايا نخاع العظم مع عازلة التدفق من طرفي عظم الفخذ باستخدام حقنة 10 ملليلتر مع إبرة قياس 23. بعد ذلك ، قم بقطع malleolus الظنبوبي وطرد خلايا نخاع العظم بمحلول تدفق من طرفي الظنبوب. قم بتفريق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر بإبرة قياس 18.
أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة عند أربع درجات مئوية و 400 غرام لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء ، أو RBC ، محلول التحلل لتحلل كرات الدم الحمراء لمدة ثلاث دقائق. أضف خمسة ملليلتر من محلول التدفق لإيقاف التحلل.
ثم أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق. ضع مصفاة خلية 70 ميكرون على أنبوب سعة 50 ملليلتر ومرر المعلق عبر المصفاة لجمع الخلايا. اضبط تركيز الخلية مع المخزن المؤقت للتدفق إلى واحد في 10 إلى ثمانية لكل مليلتر في أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المستدير.
حدد الخلايا سالبة النسب باستخدام مجموعة عزل الخلايا المكونة للدم في الماوس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالخلايا الجذعية المكونة للدم المصنفة والخلايا السلبية غير المصنفة وإعادة تعليقها في ثلاثة ملليلتر من 2X من السيتوكينات ، ووسائط IMDM ، وثلاثة ملليلتر من المادة الطافية الفيروسية في طبق مطلي بالاختزال الرجعي. احتضان الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 6 أو 24 ساعة.
بعد التنبيغ ، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إذا لزم الأمر ، استخدم التربسين لجمع الخلايا المرتبطة بقاع الطبق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا.
حقن الخلايا في الماوس المتلقي الأساسي بأثر رجعي أو داخل الصفاق باستخدام إبرة نصف قياس 27. مراقبة الماوس يوميا. بعد شهر واحد ، اجمع الدم أسبوعيا عن طريق النزيف خلف الحجاج لمراقبة زيادة عدد الكريات البيضاء عن طريق تقييم تعداد الدم الكامل على HEMAVET.
دعامة العين بالإبهام والسبابة ، ثم اخترق الضفيرة الجيبية الوريدية بأنبوب شعري هيماتوكريت معقم من خلال الكانثوس الداخلي. اجمع 20 إلى 25 ميكرولترا من الدم في أنبوب جمع الدم EDTA وأغلق الجفون لوقف النزيف. ضع قطرة واحدة من محلول العيون كبريتات الجنتاميسين على العين.
عندما تصل خلايا الدم البيضاء إلى أربعة في 10 إلى الخلايا الأربع لكل ميكرولتر ، قم بعزل خلايا نخاع العظم عن طريق غسل عظم الفخذ والساق بمحلول التدفق ، متبوعا بتحلل كرات الدم الحمراء كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، لحصاد الخلايا الطحالية ، ضع الماوس على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الساقين من خلال منصات مخلب الفأر. تعقيم الماوس مع 70 ٪ من الإيثانول.
قطع الجلد والعضلات في خط الوسط لفضح تجويف البطن بمقص معقم حاد. عزل الطحال ووضعه في مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب 15 ملليلتر. قم بربط الطحال من خلال مصفاة 70 ميكرون في طبق ستة سنتيمترات مع ثلاثة ملليلتر من محلول التدفق.
انقل الخلايا من الطبق إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر ، ثم قم بالطرد المركزي للتعليق أحادي الخلية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء لمدة ثلاث دقائق. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق لإيقاف التحلل والطرد المركزي لتعليق الخلية. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق ، واخلطها ومررها عبر مصفاة خلية 70 ميكرون لجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 ملليلتر.
تحديد خلايا ابيضاض الدم النخاعي الحاد الأولي ، أو AML ، عن طريق تلطيخ خلايا الطحال وخلايا نخاع العظم باستخدام الجسم المضاد المترافق CD45.1 المضاد للفأر FITC والكشف عن مقياس التدفق الخلوي. يتم أولا بوابات الخلايا على FSC-A FSC-H و FSC-A SSC-A للحصول على مفردات. يتم إغلاق السكان الإيجابيين CD45.1 على مخطط FL1 من خلال مقارنته بالخلايا غير الملوثة.
للزرع الثانوي ، أعد تعليق خلايا الطحال CD45.1 AML من المتلقين الأساسيين خلف الحجاج في PBS وحقنها بأثر رجعي في ذكر الفأر CD45.2. إن وجود زيادة عدد الكريات البيضاء الشاذة وزيادة تسلل خلايا اللوكيميا في نخاع العظم والطحال يدعم جدوى استخدام الخلايا السلبية لسلالة نخاع العظم لتوليد ابيضاض الدم النقوي الحاد الأولي. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في المتلقين الأساسيين المترجمين باستخدام LSK أو الخلايا السلبية النسب.
تنتشر خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) في تجويف البطن للمتلقين الأساسيين عن طريق ابيضاض الدم المختلط أو الخلايا السلبية للنسب المنقولة MLL-AF9. أكدت هذه النتائج أيضا إنشاء AML الأولي عن طريق الحقن داخل الصفاق للخلايا السلبية لسلالة نخاع العظم المحول MLL-AF9 في شكل زيادة عدد الكريات البيضاء ووجود خلايا AML في نخاع العظام والطحال من الفئران المتلقية. ومع ذلك ، استغرقت عملية الزرع الأولية عن طريق الحقن داخل الصفاق وقتا أطول لتطوير ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) مقارنة بالحقن خلف الحجاج على الرغم من العدد المتساوي للخلايا المانحة.
أظهر المتلقون الثانويون زيادة عدد الكريات البيضاء وتضخم الكبد والطحال الكبير في أقل من شهر واحد بعد الزرع. تم الكشف عن خلايا AML أيضا في الدم المحيطي ونخاع العظام والطحال ، وكذلك في التجويف البريتوني. حقق الحقن داخل الصفاق لثمانية في 10 إلى خلايا AML الخمس تطعيما مشابها للحقن المداري الخلفي من ثمانية في 10 إلى خمسة AML.
أظهرت الفئران المتلقية من الدرجة الثالثة علامات ابيضاض الدم النقوي الحاد بما في ذلك زيادة عدد الكريات البيضاء وتضخم الكبد والطحال ، ووجود خلايا اللوكيميا في الدم ونخاع العظام والطحال ، وأظهرت الملاحظة النسيجية لعظم الفخذ والطحال تسلل خلايا اللوكيميا. بالمقارنة مع عمليات الزرع الثانوية والثالثية ، تقدمت عملية الزرع الثلاثية بشكل أسرع بكثير من عملية الزرع الثانوية. بالنسبة للنموذج الحالي ، فإن فرز خلايا LSK غير ضروري.
يمكن تحويل الخلايا سالبة اللين بفيروس AML لمدة 6 ساعات أو 24 ساعة. لن يؤثر ذلك على كفاءة المؤسسة النموذجية.
