Dieses Protokoll ist bedeutsam, da lin-negative Zellen und SK-Zellen, die aus denselben Spendermäusen isoliert wurden, keinen offensichtlichen Unterschied in der Erzeugung von MLL-AF9-induzierter AML aufwiesen. Auch die IP-Injektion von leukämischen Zellen kann erfolgreich ein Mausmodell für AML entwickeln. Im Vergleich zu herkömmlichen Transplantationsmethoden ist diese Technik bequemer und kostengünstiger.
Sterilisieren Sie zunächst die 8 bis 10 Wochen alte CD45.1-Maus des weiblichen C57BL/6J-Mäuses mit 70 % Ethanol. Legen Sie die Maus auf eine sterile OP-Unterlage auf einer Styroporplatte und stecken Sie die Beine durch die Pfotenballen der Maus. Schneiden Sie die Haut oberhalb der Bauchhöhle an der Mittellinie auf und erweitern Sie den Unterhautraum in Richtung der Hinterbeine mit einer sterilen Schere mit scharfem Ende.
Verlängern Sie den Schnitt von der Bauchmittellinie bis zu den Knöcheln und erweitern Sie den Unterhautraum unter den Hinterbeinen mit den Klingen einer scharfen Schere. Schneiden Sie die Achillessehne mit einer scharfen Schere durch. Halten Sie die Sehne mit einer Pinzette mit Zähnen fest und schneiden Sie das andere Ende, das am Oberschenkelknochen befestigt ist, ab, um den Gastrocnemius-Muskel zu entfernen.
Schneiden Sie die am Knie befestigte Quadrizepssehne mit einer Schere durch. Halten Sie die Sehne fest und schneiden Sie den Muskelkopf durch, der am Oberschenkelknochen befestigt ist, um den Gastrocnemius-Muskel zu entfernen. Schneiden Sie die anderen Muskeln, die den Oberschenkelknochen umgeben, am Ende des Schienbeins ab.
Schneiden Sie als Nächstes den Knöchel mit einer scharfen Schere ab und achten Sie darauf, dass das Schienbein intakt bleibt. Halten Sie das distale Ende des Oberschenkelknochens fest und schneiden Sie das Hüftgelenk mit einer Schere auf, wobei Sie darauf achten müssen, dass der Hüftkopf intakt bleibt. Übertragen Sie die Tibien und Femurs in einen Flusspuffer in einem 15-Milliliter-Röhrchen.
Trenne das Schien- und Oberschenkelsystem, indem du das Knie von Hand brichst. Entfernen Sie die Patella, den Knorpel und die Femurkondylen, um das Tibiaplateau und den distalen Femur freizulegen. Entfernen Sie die Muskeln mit steriler Gaze und tränken Sie die Knochen in einem Flusspuffer.
Schneiden Sie den Oberschenkelhals ab und spülen Sie die Knochenmarkzellen mit Flusspuffer von beiden Enden des Oberschenkelknochens mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel. Als nächstes durchtrennen Sie den Knöchel tibia und spülen die Knochenmarkzellen mit Flusspuffer von beiden Enden der Tibia. Dispergieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel auf und ab pipettieren.
Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension drei Minuten lang bei vier Grad Celsius und 400 g. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Lysepuffer der roten Blutkörperchen (RBC), um die Erythrozyten drei Minuten lang zu lysieren. Fügen Sie fünf Milliliter Flusspuffer hinzu, um die Lyse zu stoppen.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Flusspuffer. Setzen Sie ein 70-Mikron-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Röhrchen und führen Sie die Suspension durch das Sieb, um die Zellen aufzufangen. Stellen Sie die Zellkonzentration mit Durchflusspuffer auf einmal 10 bis acht pro Milliliter in Polypropylenröhrchen mit rundem Boden ein.
Wählen Sie liniennegative Zellen mit einem hämatopoetischen Mauszellisolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Sobald Sie fertig sind, zentrifugieren Sie die sortierten hämatopoetischen Stammzellen und unsortierten liniennegativen Zellen und resuspendieren Sie sie in drei Millilitern 2X Zytokinen, IMDM-Medien und drei Millilitern viralem Überstand in einer retroreduktiv beschichteten Schale. Inkubieren Sie die Schüssel in einem befeuchteten 5%Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 6 oder 24 Stunden.
Nach der Transduktion werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Verwenden Sie bei Bedarf Trypsin, um die Zellen zu sammeln, die am Boden der Schale befestigt sind. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in vorgewärmtem PBS.
Injektion von Zellen in die primäre Empfängermaus retroorbital oder intraperitoneal mit einer 27-Gauge-Halbnadel. Überwachen Sie die Maus täglich. Nach einem Monat wird wöchentlich Blut durch retroorbitale Blutung entnommen, um die Leukozytose zu überwachen, indem das vollständige Blutbild auf einem HEMAVET ausgewertet wird.
Stützen Sie das Auge mit Daumen und Zeigefinger und dringen Sie dann mit einem sterilen Hämatokrit-Kapillarrohr durch den inneren Canthus in den venösen Sinusplexus ein. Sammeln Sie 20 bis 25 Mikroliter Blut in einem EDTA-Blutentnahmeröhrchen und schließen Sie die Augenlider, um die Blutung zu stoppen. Tragen Sie einen Tropfen Gentamycin Sulfat Augenlösung auf das Auge auf.
Wenn die weißen Blutkörperchen viermal 10 bis vier Zellen pro Mikroliter erreichen, isolieren Sie die Knochenmarkszellen, indem Sie die Oberschenkelknochen und Tibien mit Flusspuffer spülen, gefolgt von einer Erythrozytenlyse wie zuvor beschrieben. Um die Splenozyten zu entnehmen, legen Sie die Maus auf ein steriles chirurgisches Pad auf einer Styroporplatte und stecken Sie die Beine durch die Pfotenballen der Maus. Sterilisieren Sie die Maus mit 70%Ethanol.
Schneiden Sie die Haut und den Muskel an der Mittellinie auf, um die Bauchhöhle mit einer sterilen Schere freizulegen. Isolieren Sie die Milz und legen Sie sie in einen Flusspuffer in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Die Milz wird in einer sechs Zentimeter großen Schale mit drei Millilitern Durchflusspuffer durch ein 70-Mikron-Sieb gesiebt.
Übertragen Sie die Zellen aus der Schale in ein 15-Milliliter-Röhrchen, zentrifugieren Sie dann die Einzelzellsuspension, entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet drei Minuten lang in fünf Millilitern RBC-Lysepuffer. Fügen Sie fünf Milliliter Flusspuffer hinzu, um die Lyse zu stoppen und die Zellsuspension zu zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Durchflusspuffer, mischen Sie es und passieren Sie es durch ein 70-Mikron-Zellsieb, um die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln.
Identifizierung von Zellen der primären akuten myeloischen Leukämie (AML) durch Färbung der Splenozyten und Knochenmarkszellen mit FITC-konjugiertem Anti-Maus-CD45.1-Antikörper und Nachweis auf einem Durchflusszytometer. Die Zellen werden zunächst auf FSC-A, FSC-H und FSC-A, SSC-A angesteuert, um Singuletts zu erhalten. Die CD45.1-positive Population wird im FL1-Diagramm durch Vergleich mit ungefärbten Zellen kontrolliert.
Für die Sekundärtransplantation werden CD45.1 AML-Milzzellen von primären retroorbitalen Empfängern in PBS resuspendiert und retroorbital in die männliche CD45.2-Maus injiziert. Das Vorliegen einer aberranten Leukozytose und einer erhöhten Infiltration leukämischer Zellen im Knochenmark und in der Milz unterstützt die Möglichkeit, Knochenmarklinien-negative Zellen zur Erzeugung einer primären AML zu verwenden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei primären Empfängern beobachtet, die mit LSK oder liniennegativen Zellen translatiert wurden.
Die AML-Zellen verbreiten sich in der Bauchhöhle der primären Empfänger durch gemischte Leukämie- oder MLL-AF9-transduzierte liniennegative Zellen. Diese Ergebnisse bestätigten auch die Etablierung einer primären AML durch intraperitoneale Injektion von MLL-AF9-transduzierten Knochenmark-Lineage-negativen Zellen in Form von Leukozytose und das Vorhandensein von AML-Zellen im Knochenmark und in der Milz von Empfängermäusen. Allerdings dauerte die Primärtransplantation mittels intraperitonealer Injektion trotz gleicher Anzahl von Spenderzellen länger als die retroorbitale Injektion.
Die sekundären Empfänger zeigten Leukozytose und signifikante Hepatosplenomegalie in weniger als einem Monat nach der Transplantation. Die AML-Zellen wurden auch im peripheren Blut, Knochenmark und in der Milz sowie in der Bauchhöhle nachgewiesen. Die intraperitoneale Injektion von acht mal 10 an die fünf AML-Zellen erreichte ein vergleichbares Engraftment wie die retroorbitale Injektion von acht mal 10 an die fünf AML.
Die tertiären Empfängermäuse zeigten akute AML-Symptome wie Leukozytose und Hepatosplenomegalie, das Vorhandensein von Leukämiezellen im Blut, Knochenmark und in der Milz, die histologische Beobachtung des Femurs und der Milz zeigte außerdem die Infiltration leukämischer Zellen. Im Vergleich zu den sekundären und tertiären Transplantationen verlief die tertiäre Transplantation wesentlich schneller als die sekundäre Transplantation. Für das aktuelle Modell ist das Sortieren von LSK-Zellen nicht erforderlich.
Lin-negative Zellen können 6 Stunden oder 24 Stunden lang mit dem AML-Virus transduziert werden. Es hat keinen Einfluss auf die Effizienz der Modelleinrichtung.
