우리의 프로토콜을 사용하여, 우리는 살아있는 마취 된 마우스의 운동 및 감각 뉴런에서 축삭 내 신호 엔도솜과 미토콘드리아의 역학을 시각화하고 정량적으로 평가할 수 있습니다. 생체 내에서 축삭돌기의 기저 생리학을 이해하고, 질병의 마우스 모델에서 말초 신경변성을 유도하는 중요한 병리-메카니즘을 밝히기 위해 사용될 수 있는 이 방법. 우리의 기술은 살아있는 운동 및 감각 뉴런의 축삭 수송에 대한 약리학 적 제제 및 유전자 요법과 같은 잠재적 인 치료법의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
이 기술은 특정 말초 신경 축삭에서 다른 소기관을 동시에 이미지화하고 노화뿐만 아니라 운동 질환 모델에 대한 연구를 중계하는 데 사용할 수 있습니다. 더 작은 근육에 최적의 근육 주사를 위해 등급이 매겨진 유리 마이크로 피펫을 당겨서 준비를 시작하십시오. 수술을 위해 멸균 수술 드레이프를 섭씨 37도로 설정된 히트 매트에 고정하고 수술 현미경을 배치하고 초점을 맞춥니다.
그런 다음 원고에 설명 된대로 필요한 모든 수술 도구와 도구를 포장을 풉니 다. 준비가 완료되면 마취 된 마우스를 수술 공간의 별도 영역에있는 마우스 피스로 옮기고 수술 부위에서 모피를 면도하기 전에 각막 및 페달 금단 반사가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 수술 테이프의 끈적 끈적한면을 사용하여 마우스에서 면도 된 모피를 제거하십시오.
다음으로, 마우스를 칭량 저울에 올려 놓고 수술 전 체중을 기록하십시오. 그런 다음 면봉을 사용하여 눈 윤활제를 바르고 마우스와 마우스 피스를 수술 부위로 옮깁니다. 경골 전방 또는 TA 근육을 주입하려면 마우스를 뒤쪽에 놓고 뒷다리를 중간 선에서 10도 스트레칭하십시오.
뒷다리가 올바른 위치에있을 때 발 전체에 수술 테이프를 놓습니다. 70 % 에탄올 또는 이와 동등한 용액을 사용하여 면도 된 부위를 멸균하십시오. 파상풍, 신경 독소 또는 HcT 용액의 무독성 조각을 당겨 유리 마이크로 피펫에 그립니다.
다음으로, 운동 및 플레이트 영역과 일치하는 영역에서 관심있는 근육을 약간 절개하십시오. 그러면. HcT를 주입하기 위해 근육의 외부 근막을 관통하십시오. 천천히 철수하기 전에 마이크로 피펫을 5 ~ 10 초 동안 그대로 두십시오.
주사를 게시하고 하나 ~ 두 개의 바늘로 절개를 닫으십시오. 이어서, 마우스를 30분 동안 관찰 하에 단리된 회복 케이지로 옮긴다. 수술 부위 주위에 수술 도구와 도구를 배치하여 좌골 신경을 노출시킬 준비를하십시오.
이미징 프로세스를 돕기 위해 각진 팁이있는 너비 한 센티미터의 좁은 직사각형으로 파라 필름을 절단하여 쐐기를 만듭니다. 준비가 완료되면 마우스를 수술 부위의 마우스 피스로 옮기고 수술 테이프를 사용하여 머리를 마우스 피스에 고정하십시오. 수술 테이프로 중앙선에서 45도까지 목표 뒷다리를 확장하고 고정하십시오.
각막과 페달 금단 반사가 없으면 가위를 사용하여 좌골 신경을 덮고있는 피부를 자릅니다. 그런 다음, 좌골 신경과 혈관을 손상시키지 않으면서 위에 놓인 이두근 대퇴골 근육과 근육 또는 결합 조직을 제거한다. 손상되지 않은 좌골 신경이 충분히 노출되면 좌골 신경 주변 부위에 미리 가온된 멸균 식염수를 바르면 건조를 방지할 수 있습니다.
그런 다음 곡선 포셉을 사용하여 깊숙이 놓인 결합 조직을 파괴하고 미리 준비된 파라필름 쐐기를 신경 아래에 놓습니다. 식염수에 담근 면봉을 노출 부위에 놓은 후 마우스를 열 매트 위로 옮기고 이소플루란과 산소로 채워진 유도 챔버로 옮깁니다. 이미징을 위해 맞춤형 현미경 스테이지에 22x64mm 커버 글라스를 놓고 커버 글라스의 위치를 테이프로 고정하십시오.
목표물에 침지 오일을 적용한 후, 현미경 스테이지를 거꾸로 된 현미경에 연결하고 오일 침지 된 목표를 천천히 올려 커버 글라스에 접촉시킵니다. 설치가 준비되면 테이프를 사용하여 마취 마우스 피스를 현미경 단계에 고정하십시오. 그런 다음 좌골 신경에서 면봉을 제거하고 노출 된 신경이 커버 글라스를 향하게하는 마우스 피스로 유도 챔버에서 마우스를 옮깁니다.
마우스의 머리를 마우스 피스에 고정시키고 가장 낮은 적절한 수준의 마취를 유지하면서 꼬리로 마우스를 부드럽게 들어 올려 노출 된 좌골 신경 근처의 덮개 슬립에 멸균 식염수를 첨가하십시오. 안구의 도움으로 좌골 신경을 찾아 최적의 초점을 결정하고 운동성 축삭 소기관을 포함하는 관심 영역을 선택하십시오. 그런 다음 획득 버튼을 클릭하고 관심 영역을 선택하여 컴퓨터 소프트웨어로 전환하십시오.
디지털 줌을 사용하여 80배 배율을 얻고 선택한 영역을 회전하여 축삭을 수평으로 시각화하여 영역(Region) 상자를 클릭하고 원하는 직사각형 영역을 선택합니다. 획득 모드에서 프레임 크기를 최소 1024x1024픽셀로 설정하고 100 ~ 1, 000프레임의 시간 경과 획득을 시작합니다. 마우스당 세 개의 축삭에서 최소 10개의 운동성 화물을 포획합니다.
이 연구에서, 생체내 운동 축색돌기-스펙티펙 표지는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 달성되었다. 콜린성 운동 축색돌기에서 강화된 녹색 꽃차례 단백질, 또는 eGFP 발현을 라이브, 마취된 ChAT로부터 관찰하였다. eGFP 마우스.
대안적인 방법으로, tdTomato는 ChAT로부터 갓 적출된 신경에서 발현된다. tdTomato 마우스는 추가적인 조직 처리 없이 달성되었다. 추가적으로, 축삭돌기는 골격근에 eGFP를 코딩하는 HcT 또는 아데노바이러스와 같은 추적자 또는 마커를 주입함으로써 확인되었다.
대표적인 분석은 HB9의 살아있는 운동 뉴런에서 신호 엔도솜의 생체내 축삭 수송을 나타내는 타임랩스 이미지 시리즈를 입증한다. GFP 마우스. GFP는 HB9에서 보다 세분화된 패턴을 가졌다.
GFP 축삭. 미토의 번식. ChAT를 가진 CFP 마우스.
tdTomato 마우스는 운동 축삭에서 미토콘드리아의 시각화를 가능하게했습니다. 또한, 랜비어의 노드도 식별될 수 있다. 미토의 근육에 HcT 주입.
CFP 마우스는 생체내에서 동일한 축삭돌기 내에서 엔도솜과 미토콘드리아의 신호전달을 동시에 시각화할 수 있게 하였다. 전방 및 역행적으로 움직이는 소기관과 정지 된 소기관이 관찰되었습니다. 영상화 과정 동안 감소된 마취는 큰 호흡 아티팩트의 충격을 제한할 수 있고, 따라서 축삭 수송의 추적 및 분석을 단순화할 수 있기 때문에 유리하다.
좌골 신경은 RNA 및 단백질 분석에 유익하여 소기관 역학을 운동 단백질 및화물 특이적 어댑터와 같은 축삭 수송 기계의 주요 구성 요소와 연관시킬 수 있습니다.
