In questo protocollo, dimostriamo il processo di purificazione per ottenere canali TRP purificati a lunghezza intera, che è il primo passo necessario per studiare le proprietà elettrofisiologiche e ottenere informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera. Sulla base del meccanismo di campionamento del complesso proteico INAD e utilizzando perle di nichel a basso costo con capacità molto più elevata, una quantità sufficiente di canali TRP può essere purificata dalle teste di mosca. A dimostrare la procedura sarà Yuyang Liu, un tecnico del nostro laboratorio.
Per iniziare, trasformare il plasmide pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 in cellule E.coli BL21, utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico del cloruro di calcio. Inoculare una singola colonia in 10 millilitri di Luria Bertani medium, e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere i 10 millilitri di coltura di semina in un litro di Luria Bertani medium e incubare a 37 gradi Celsius.
Dopo che la densità ottica delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 gradi Celsius e aggiungere 0,1 millimolari isopropil-beta-D-1-tiogalattopoliranoside. Dopo la sovraespressione, pellet un litro di cellule coltivate per centrifugazione e risospeso in 40 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Caricare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius.
Aumentare lentamente la pressione dell'omogeneizzatore a 800 bar. Aprire la linguetta di ingresso e lasciare che le celle risospese passino circolarmente attraverso una valvola con fessure strette. Caricare cinque millilitri di perline di glutatione in una colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 50 millilitri di tampone salino tamponato con fosfato, per un totale di tre volte.
Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48, 384 volte G.Aggiungere circa 40 millilitri del surnatante del lisato cellulare centrifugato alle perle di glutatione equilibrate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Sospendere le perle di glutatione ogni 10 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, aprire la linguetta di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso.
Scartare la frazione di flusso e risciacquare due volte le restanti perle di glutatione, con 50 millilitri di tampone salino tamponato con fosfato. Aggiungere 15 millilitri di tampone di eluizione alle perle di glutatione e risospesciare le perline ogni 10 minuti. Eluire il frammento TRP 1261-1275 con tag GST in un tubo conico da 50 ml e caricarlo in una colonna di esclusione delle dimensioni.
Raccogliere cinque millilitri delle proteine eluite per tubo e concentrare i frammenti purificati in un millilitro mediante centrifugazione in una colonna di centrifuga di ultrafiltrazione in una centrifuga refrigerata. Per purificare il frammento NORPA 863-1095 con etichetta His, seguire la procedura precedentemente dimostrata utilizzando perline di nichel. Raccogliere mosche adulte in tubi centrifughi conici da 50 millilitri e congelarli in azoto liquido per 10 minuti.
Agitare vigorosamente i tubi congelati a mano e trasferire la miscela su tre setacci in acciaio inossidabile impilati in sequenza e preraffreddati. Agitare i setacci e spazzare via le teste di mosca dal setaccio a 40 maglie usando un pennello. Trasferirli in cinque tubi conici millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius.
Omogeneizzare 0,5 grammi di teste in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello pre-raffreddati. Sciogliere le teste omogeneizzate in cinque millilitri di tampone di lisi 10X, seguito da centrifugazione a 20, 817 volte G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Il surnatante spin down viene ulteriormente centrifugato 100.000 volte G a quattro gradi Celsius per 60 minuti.
Aggiungere un millilitro di perline di nichel nella colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline tre volte con 10 millilitri di acqua a doppia distillazione a quattro gradi Celsius. Equilibrare le perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi, tre volte a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di 600 micromolari purificati his-tagged proteina NORPA 863-1095 nella colonna di nichel e incubare la colonna.
Sospendere le perline ogni 10 minuti. Aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso e lavare le perle di nichel con 10 millilitri di tampone di lisi fredda. Quindi, aggiungere il surnatante freddo di omologenato della testa di Drosophila nella colonna di nichel.
Dopo l'incubazione, lavare le perline con 10 millilitri di tampone di lisi e aggiungere 500 microlitri di 600 micromolari gst-tagged TRP 1261-1275 proteina nelle perline. Raccogliere la frazione eluita dalla colonna di gravità. Lavare le perle di nichel con 10 millilitri di tampone legante.
Quindi, aggiungere il tampone di eluizione e raccogliere la frazione di eluizione dalla colonna del flusso di gravità. Concentrare le frazioni eluite dalla purificazione del canale TRP di Drosophila, utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da quattro millilitri. Iniettare il campione nella colonna di esclusione delle dimensioni ed eluire le proteine con una portata ragionevole.
Il frammento TRP 1261-1275 con tag GST è stato espresso in cellule di E.coli e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di esclusione delle dimensioni. Allo stesso modo, il frammento NORPA 863-1095 con tag His è stato espresso e purificato utilizzando perline di nichel e colonna di esclusione delle dimensioni. Il canale TRP eluito è separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 marcato con GST, per cromatografia di esclusione dimensionale.
Come sottoprodotto, i complessi INAD, ePKC, NORPA 863-1095 sono ottenuti dopo la competizione peptidica TRP 1261-1275. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo, è omogeneizzare le teste di mosca in azoto liquido e risolvere l'omogeneizzato in tampone contenente un detergente chiamato DDM. Seguendo questa procedura, possiamo anche purificare l'intero complesso proteico INAD che può essere utilizzato per studiarne i meccanismi di assemblaggio e regolazione.
Una potenziale applicazione futura di questo metodo sarà quella di studiare le informazioni strutturali del canale Endogeno Drosophila TRP utilizzando tecniche Cryo-EM. Inoltre, è anche possibile misurare le proprietà elettrofisiologiche dei canali Endogeni Drosophila TRP purificati nella membrana lipidica a doppio strato artificiale.
