Dans ce protocole, nous démontrons le processus de purification pour obtenir des canaux TRP purifiés sur toute la longueur, ce qui est la première étape nécessaire pour étudier les propriétés électrophysiologiques et obtenir des informations structurelles sur le canal TRP de la drosophile sur toute la longueur. Sur la base du mécanisme d’échantillonnage du complexe protéique INAD et en utilisant des billes de nickel à faible coût avec une capacité beaucoup plus élevée, une quantité suffisante de canaux TRP peut être purifiée des têtes de mouche. Yuyang Liu, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, transformez le plasmide pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 en cellules E. coli BL21, en utilisant la méthode de transformation par choc thermique au chlorure de calcium. Inoculer une seule colonie dans 10 millilitres de milieu Luria Bertani et croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ajouter les 10 millilitres de culture d’ensemencement dans un litre de milieu Luria Bertani et incuber à 37 degrés Celsius.
Une fois que la densité optique des cellules atteint 0,5, refroidissez les cellules à 16 degrés Celsius et ajoutez 0,1 millimolaire isopropyl-bêta-D-1-thiogalactopyranoside. Après surexpression, pastillez un litre de cellules cultivées par centrifugation et remettez en suspension dans 40 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Chargez les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur haute pression, pré-refroidi à quatre degrés Celsius.
Augmentez lentement la pression de l’homogénéisateur à 800 bars. Ouvrez la languette d’entrée et laissez les cellules remises en suspension passer circulairement à travers une vanne à fentes étroites. Chargez cinq millilitres de billes de glutathion dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez les perles avec 50 millilitres de tampon salin tamponné au phosphate, pour un total de trois fois.
Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48, 384 fois G.Ajouter environ 40 millilitres du surnageant du lysat de cellule centrifugé aux billes de glutathion équilibrées dans la colonne d’écoulement gravitationnel, et incuber pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Remettez en suspension les perles de glutathion toutes les 10 minutes. Après 30 minutes d’incubation, ouvrez la languette de sortie de la colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement.
Jetez la fraction d’écoulement et rincez deux fois les billes de glutathion restantes avec 50 millilitres de tampon salin tamponné au phosphate. Ajouter 15 millilitres de tampon d’élution aux perles de glutathion et remettre les perles en suspension toutes les 10 minutes. Eluter le fragment TRP 1261-1275 étiqueté GST dans un tube conique de 50 mL et le charger dans une colonne d’exclusion de taille.
Recueillir cinq millilitres de protéines éluées par tube et concentrer les fragments purifiés à un millilitre par centrifugation dans une colonne de spin d’ultrafiltration dans une centrifugeuse réfrigérée. Pour purifier le fragment NORPA 863-1095 étiqueté His, suivez la procédure précédemment démontrée à l’aide de perles de nickel. Recueillez les mouches adultes dans des tubes de centrifugeuse coniques de 50 millilitres et congelez-les dans de l’azote liquide pendant 10 minutes.
Secouez vigoureusement les tubes congelés à la main et transférez le mélange dans trois tamis en acier inoxydable pré-refroidis empilés séquentiellement. Secouez les tamis et balayez les têtes de mouche du tamis à 40 mailles à l’aide d’une brosse. Transférez-les dans des tubes coniques de cinq millilitres et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.
Homogénéiser 0,5 gramme de têtes dans de l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon pré-refroidis. Dissoudre les têtes homogénéisées dans cinq millilitres de tampon de lyse 10X, suivie d’une centrifugation à 20, 817 fois G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Le surnageant de rotation est en outre centrifugé 100 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes.
Ajouter un millilitre de billes de nickel dans la colonne d’écoulement par gravité et laver les perles trois fois avec 10 millilitres d’eau double distillée à quatre degrés Celsius. Équilibrez les billes avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse, trois fois à quatre degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres de 600 micromolaires purifiés de la protéine NORPA 863-1095 purifiée dans la colonne de nickel et incuber la colonne.
Remettez enseveli les perles toutes les 10 minutes. Ouvrez le robinet de sortie de la colonne pour séparer les billes et la fraction traversante, et lavez les billes de nickel avec 10 millilitres de tampon de lyse à froid. Ensuite, ajoutez un surnageant froid de l’homogénat de tête de drosophile dans la colonne de nickel.
Après l’incubation, lavez les billes avec 10 millilitres de tampon de lyse et ajoutez 500 microlitres de 600 micromolaires de protéine tRP 1261-1275 marquées GST dans les perles. Collectez la fraction éluée de la colonne de gravité. Lavez les billes de nickel avec 10 millilitres de tampon de liaison.
Ensuite, ajoutez un tampon d’élution et collectez la fraction d’élution de la colonne d’écoulement par gravité. Concentrez les fractions éluées de la purification du canal TRP de la drosophile, à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de quatre millilitres. Injecter l’échantillon dans la colonne d’exclusion de taille et éluer les protéines avec un débit raisonnable.
Le fragment TRP 1261-1275 marqué GST a été exprimé dans des cellules E. coli et purifié à l’aide de perles de glutathion et d’une colonne d’exclusion de taille. De même, le fragment NORPA 863-1095 marqué his a été exprimé et purifié à l’aide de billes de nickel et d’une colonne d’exclusion de taille. Le canal TRP élué est séparé du peptide TRP 1261-1275 marqué GST excessif, par chromatographie d’exclusion de taille.
En tant que sous-produit, les complexes INAD, ePKC, NORPA 863-1095 sont obtenus après la compétition peptidique TRP 1261-1275. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole est d’homogénéiser les têtes de mouches dans de l’azote liquide et de résoudre l’homogénat dans un tampon contenant un détergent appelé DDM. En suivant cette procédure, nous pouvons également purifier l’ensemble du complexe protéique INAD qui peut être utilisé pour étudier ses mécanismes d’assemblage et de régulation.
Une application future potentielle de cette méthode consistera à étudier l’information structurelle du canal TRP endogène de la drosophile à l’aide des techniques Cryo-EM. En outre, il est également possible de mesurer les propriétés électrophysiologiques des canaux endogènes purifiés de la Drosophile TRP dans la membrane lipidique bicouche artificielle.
