La spettroscopia NMR in-cell offre un approccio unico per studiare la struttura e la funzione delle proteine direttamente nelle cellule viventi e per monitorare processi biologicamente rilevanti come le interazioni proteina-ligando. Questo bioreattore NMR può mantenere un numero elevato di cellule umane vitali e metabolicamente attive per diversi giorni nello spettrometro, consentire applicazioni NMR in-cell in tempo reale. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi proteina intracellulare solubile e liberamente cadente sottoposta a cambiamenti conformazionali o chimici.
L'etichettatura degli isotopi estende ulteriormente l'applicabilità del metodo. Per iniziare, assemblare l'unità di flusso utilizzando un secondo tubo NMR dell'unità di flusso, che verrà successivamente sostituito con quello contenente le celle. Fare riferimento alle istruzioni per l'uso dell'unità di flusso per il corretto assemblaggio.
Impostare il bagno d'acqua collegato al controllo della temperatura dell'unità di flusso a 37 gradi Celsius e posizionare la bottiglia del serbatoio nel bagno d'acqua. Collegare il tubo FEP della bottiglia del serbatoio alla pompa. Ruotare la valvola del bioreattore per bypassare e pre-riempire la pompa con il mezzo.
Quindi, ruotare la valvola del bioreattore per fluire e pre-riempire il bioreattore con il mezzo a 0,1 millilitri al minuto. Prendi un pallone T75 di cellule T HEK 293 trasfettate dall'incubatore di anidride carbonica e rimuovi il mezzo esaurito. Aggiungere due millilitri di tripsina EDTA alle cellule e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per staccare le cellule.
Inattivare la tripsina con 20 millilitri di DMEM completo e sospendere completamente le cellule tubando su e giù. Quindi, trasferirli in un tubo centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 800X G per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
Trasferire il pellet di cella in un tubo microcentrifugale da 1,5 millilitri. Per incorporare le celle in fili di agarosio, sciogliere un'aliquota di agarosio solidificato a 85 gradi Celsius in un riscaldatore a blocchi, quindi tenerlo in soluzione a 37 gradi Celsius nel riscaldatore a blocchi. Con una pipetta Pasteur, riempire il fondo del tubo NMR dell'unità di flusso con 60-70 microlitri di gel di agarosio all'1,5% e posizionarlo sul ghiaccio per creare un tappo inferiore alto cinque millimetri.
Riscaldare il pellet della cella per 15-20 secondi nel riscaldatore a blocchi e sospendere con cura le celle in 450 microlitri di soluzione di agarosio, evitando la formazione di bolle. Aspirare la sospensione cellulare/agarosio in un tubo PEEK cromatografico lungo 30 centimetri di diametro interno di 0,75 millimetri collegato a una siringa da un millilitro. Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente per due minuti.
Pre-riempire il tubo NMR dell'unità di flusso con 100 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Gettare fili di cellule incorporate nell'agarosio nel tubo NMR dell'unità di flusso spingendo delicatamente la siringa. Rimuovere il tubo NMR vuoto dall'unità di flusso e aumentare la portata a due millilitri al minuto per alcuni minuti per rimuovere le bolle di gas residue nel tubo di ingresso.
Impostare la portata a 0,2 millilitri al minuto e inserire il tubo NMR contenente le celle spingendolo verso l'alto lentamente ma costantemente. Fornire il mezzo del bioreattore a una portata di 0,1 millilitri al minuto. Impostare la temperatura nello spettrometro NMR su 310 Kelvin e inserire l'unità di flusso nello spettrometro.
Una volta inserito il bioreattore nello spettrometro NMR, attendere qualche minuto per consentire lo scambio del mezzo. Regola la corrispondenza e la sintonizzazione del canale del protone, fai scorrere il magnete e calcola la lunghezza dell'impulso duro del protone di 90 gradi. Regolare i livelli di potenza del protone in ogni sequenza di impulsi in base all'impulso duro del protone.
Registrare un primo spettro NMR di protoni zgesgp per registrare il contenuto del campione nell'omogeneità del campo. Copiare gli esperimenti zgesgp e p3919gp o SOFAST-HMQC nel numero desiderato e metterli in coda nello spooler di acquisizione. Iniettare una soluzione concentrata della molecola esterna al flacone del serbatoio medio perforando il tubo di silicone con una siringa sterile con ago lungo.
Alla fine dell'esperimento NMR, sostituire il tubo contenente le celle con un tubo vuoto e risciacquare l'unità di flusso con acqua. Per le cellule che esprimono anidrasi carbonica non etichettata, elaborare gli spettri p3919gp applicando la funzione di riempimento zero e di allargamento esponenziale della finestra. Per le celle che esprimono azoto-15 etichettato, superossido dismutasi, elaborare gli spettri SOFAST-HMQC applicando il riempimento zero e la funzione campana a segno quadrato in entrambe le dimensioni.
In MATLAB, importa le regioni spettrali utilizzando lo script personalizzato Load_ascii_spectra. Eseguire lo script Load_acqus per estrarre i timestamp dagli spettri 1D. Aprire la GUI di MCR-ALS 2.0 eseguendo lo script mcr_main e, nella scheda Selezione dati, caricare la matrice spettrale.
Controlla i dati tracciandoli. Valutare il numero di componenti, per scomposizione del valore singolare o manualmente, e selezionare un metodo per la stima iniziale degli spettri puri. È possibile utilizzare il rilevamento delle variabili più pure o l'analisi fattoriale in evoluzione.
Nella finestra Selezione del dataset selezionare Continua. Impostare i vincoli per le concentrazioni nella finestra Modalità vincoli:riga. Applicare un vincolo di non negatività, selezionando fnnls come Implementazione e due come numero di specie.
Quindi, applicare un vincolo di chiusura, impostare il vincolo su uno, la condizione di vincolo di chiusura come uguale a e applicarla a tutte le specie. Impostate i vincoli per gli spettri nella finestra Modalità vincoli:colonna. Applicare un vincolo di non negatività, selezionando fnnls come implementazione e due come numero di specie.
Nella finestra finale, impostare 50 iterazioni e un criterio di convergenza 0,01. Specificare i nomi di output per concentrazioni, spettri e deviazione standard. Fare clic su Continua per eseguire il raccordo MCR-ALS.
Le cellule nel bioreattore possono essere mantenute in vita fino a 72 ore, come confermato da un test del tripano blu. Il bioreattore è stato utilizzato per il monitoraggio in tempo reale del legame di due inibitori, acetazolamide e metazolamide all'anidrasi carbonica sovraespressa nel citosol delle cellule T HEK 293. La presenza di segnali dalla proteina sovraespressa e l'omogeneità di campo è stata valutata con il primo spettro protonico che scolpisce l'eccitazione.
Nel caso dell'anidrasi carbonica, il legame intracellulare dei due inibitori è stato monitorato osservando segnali protonici nella regione tra 11 e 16 parti per milione dello spettro WATERGATE, derivanti dalle istidine che coordinano lo zinco e altri residui aromatici. Il successo del legame è stato confermato dalla comparsa di segnali aggiuntivi. MCR-ALS è stato utilizzato per separare i segnali NMR derivanti dall'anidrasi carbonica libera e legata e per fornire i profili di concentrazione relativa delle due specie.
Il bioreattore è stato applicato per monitorare la formazione del legame disolfuro intramolecolare superossido dismutasi legato allo zinco promosso da ebselen, una glutatione perossidasi mimica. L'analisi MCR-ALS su regioni selezionate dello spettro 2D ha separato i segnali derivanti dalle due specie e ha fornito i loro profili di concentrazione relativa. È importante inserire e rimuovere il tubo NMR dell'unità di flusso lentamente e costantemente per evitare salti di pressione che possono causare la formazione di bolle.
Lo sviluppo di bioreattori NMR ha spianato la strada allo studio dei processi dipendenti dal tempo della risoluzione atomica, come la traccia della regolazione redux e le interazioni farmaco/bersaglio nelle cellule viventi.
