Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune delle importanti domande nel campo della produzione di processi Bio per quanto riguarda gli aspetti della caratterizzazione della linea cellulare e l'ottimizzazione mediata e di processo. I vantaggi di questa tecnica sono che fornisce un maggiore controllo nei contenitori di scuotimento e consente l'automazione e le prestazioni di un gran numero di studi su piccola scala per una rapida generazione di dati. A dimostrare la procedura saranno Sai Rashmika Velugula e Casey Kohnhorst, ricercatori del mio laboratorio.
Inizia immergendo un vile stock di tre volte 10 al settimo mostrano cellule per millilitro di mezzo di congelamento in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quando rimane solo un piccolo flusso di ghiaccio, pipettare delicatamente la sospensione cellulare rapidamente scongelata alcune volte e trasferire un millilitro di cellule in un pallone sterile a tre scosse ventilato da 125 millilitri contenente 29 millilitri di mezzo OptiCHO. Posizionare il pallone in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e 8%CO2 scuotendolo a 130 giri/min.
Subcultura delle cellule dopo 72 ore in 100 millilitri di mezzo fresco di 37 gradi Celsius in un pallone filatore da 125 millilitri per un'altra incubazione di 72 ore a 37 gradi Celsius e 8%CO2 con agitazione a 70 giri/min. Il terzo giorno di sottocultura, aggiungere un mezzo fresco preri riscaldato al pallone filatore per mantenere le cellule ad una vitalità di almeno il 90% per le ultime 24 ore di coltura. La mattina dopo, fare clic sull'icona del desktop remoto e fare clic su Connetti.
Quando il desktop remoto è connesso, aprire il software del contatore delle celle e installare un nuovo Reagent Pak. Quindi, svuotare i rifiuti di Trypan Blue e innescare il sistema. Quindi, ridurre al minimo la connessione remota e aprire il software del microreaeree utilizzando un esperimento esistente come modello per creare un nuovo esperimento.
Prima di iniziare una corsa, definire le piastre utilizzate durante la corsa nella sezione mimetica del software e posizionare 12 vasi di coltura sterili in ogni stazione di coltura. Posizionare le piastre di morsetto autoclavate sopra i recipienti e posizionare le piastre di agitazione sopra le piastre del morsetto assicurandosi che ogni perno sia inserito in modo sicuro. Quindi, fissare le piastre del morsetto con le viti e i nob forniti.
Per avviare il sistema eseguire la scansione del codice a barre fornito con ogni nave di coltura. Il sistema inizializza e verifica la presenza delle navi appropriate. Impostare il controllo della temperatura su 37 gradi Celsius e l'agitazione a 1.000 giri/min e accendere il monitor PH ad ossigeno disciolto.
Quindi, eseguire il programma di ricarica media. Una volta caricato tutto il mezzo, verranno aggiunti 35 microlitri di antischiam EX-CELL dalla piastra antischiostra ai vasi di coltura. Dopo 30 minuti iniziano a registrare l'ossigeno disciolto e il PH all'interno del mezzo di coltura, permettendo all'ossigeno disciolto di raggiungere un setpoint del 50%Dopo l'equilibrazione dell'ossigeno disciolto, accendere le aggiunte di base di fondo per raggiungere un setpoint PH di 7,1 per tutti i vasi di coltura.
La mattina seguente, eseguire il passo PH sospeso e trasferire l'intero contenuto del pallone filatore in un tubo conico sterile da 250 millilitri per la centrifugazione. Resuspend il pellet in mezzo abbastanza fresco che la densità finale sarà uno per 10 alla sesta cellule CHO per millilitro dopo aver aggiunto l'inoculo ai vasi di coltura e aggiungere le cellule sospese nei pozzi appropriati di una piastra sterile lidded 24 pozzetto. Aggiungere tre millilitri di inoculo ad ogni pozzo e posizionare la piastra inoculo sulla scrivania designata all'interno del cofano.
Quindi, lasciare che i vasi di coltura equilibrano per almeno un'ora e avviare il passaggio di conteggio EX-CELL cinque nel programma. Per l'analisi giornaliera dei nutrienti e dei metaboliti il secondo giorno, posizionare le piastre portatubi campione sui ponti designati e caricare tubi di microcentrifugo aperti nei supporti appropriati. Quindi, posizionare i campioni nel vassoio dell'analizzatore, per eseguire l'analisi dei nutrienti.
Per terminare l'esecuzione spegnere prima il controllo della temperatura seguito dall'agitazione. Interrompere il controllo PH dell'ossigeno disciolto e le aggiunte alla base di fondo, tutti gli altri controlli e il monitor di sistema. Svitare il morsetto e mescolare le piastre, rimuovere i vasi di coltura e avvitare le piastre di essiccazione nella stazione di coltura.
Quindi, eseguire il ciclo di asciugatura di due ore sul programma;fare clic su interrompi nel software bioreattore una volta terminato il ciclo di asciugatura. Per raccogliere le celle trasferire il fluido di coltura cellulare dai recipienti del reattore in corrispondenti tubi conici per la centrifugazione e filtrare i supernanti attraverso filtri PVDH sterili da 0,22 micrometri. Quindi, trasferire un millilitro di ogni supernatante di coltura cellulare sterile in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per una conservazione negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi del titolo.
Per misurare i formicolii IgG dei campioni, accendere prima il sistema biosensore di aiuto proteico. Dopo che la lampada si è riscaldata per almeno un'ora, lasciare che i campioni equilibrano a temperatura ambiente e prendereak una punta di aiuto proteico per campione in mezzo cellulare fresco per almeno 30 minuti. Quindi, impostare la temperatura della piastra a 26 gradi Celsius.
Caricare i campioni nel sistema ed eseguire il test utilizzando il saggio di default ad alta sensibilità con rigenerazione nel software di acquisizione dati. Utilizzando il contatore cellulare integrato, le densità cellulari medie vitali e le viabilità possono essere ottenute giornalmente per tutte le condizioni di coltura. Utilizzando l'analizzatore di nutrienti possiamo anche ottenere i profili nutrizionali e sottoprodotti che dimostrano la fattibilità del monitoraggio di questi attributi nel sistema del reattore microbio.
Inoltre, la produttività totale delle colture cellulari nelle varie condizioni di coltura di interesse può essere quantificata utilizzando il sistema biosensore di aiuto proteico come dimostrato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il protocollo funziona solo se la programmazione viene eseguita correttamente;garantendo l'esecuzione tempestiva dei passaggi del protocollo con errori minimi. Seguendo questa procedura è possibile eseguire altri metodi come:cromatografia liquida, spettrometria di massa e dispersione della luce multiangolo per rispondere a ulteriori domande riguardanti le proprietà fisiche e chimiche del prodotto prodotto.
