使用高细胞密度生物反应器通过实时定量细胞内 NMR 监测人细胞中蛋白质-配体相互作用

细胞内NMR光谱提供了一种独特的方法，可以直接研究活细胞中的蛋白质结构和功能，并监测生物学相关过程，如蛋白质 - 配体相互作用。该NMR生物反应器可以在光谱仪中保持大量人类细胞的活力和代谢活性数天，从而实现实时细胞内NMR应用。该方法可以应用于任何可溶的、自由翻滚的细胞内蛋白质，经历构象或化学变化。

同位素标记进一步扩展了该方法的适用性。首先，使用第二个流动单元NMR管组装流动单元，该流动单元稍后将被包含细胞的流动单元替换。请参阅流量单元操作说明，了解正确组装。

将连接到流量单元温度控制的水浴设置为37摄氏度，并将储液瓶放入水浴中。将储液瓶的 FEP 管连接到泵。转动生物反应器阀旁路并用介质预填充泵。

然后，转动生物反应器阀门流动，并用每分钟0.1毫升的培养基预填充生物反应器。从二氧化碳培养箱中取一个转染的HEK 293 T细胞的T75烧瓶，并除去用过的培养基。向细胞中加入两毫升胰蛋白酶EDTA，并在室温下孵育五分钟以分离细胞。

用20毫升完全DMEM灭活胰蛋白酶，并通过上下移液彻底重新悬浮细胞。然后，将它们转移到50毫升的离心管中。在室温下以800X G离心细胞五分钟并弃去上清液。

将细胞沉淀转移到1.5毫升的封闭式微量离心管中。要将细胞嵌入琼脂糖线中，在块加热器中以85摄氏度融化一等分试样的凝固琼脂糖，然后将其保持在块加热器中以37摄氏度的溶液中。使用巴斯德移液器，用60至70微升的1.5%琼脂糖凝胶填充流动单元NMR管的底部，并将其放在冰上以形成一个5毫米高的底部塞。

在块状加热器中加热细胞沉淀15至20秒，并小心地将细胞重新悬浮在450微升琼脂糖溶液中，避免形成气泡。将细胞/琼脂糖悬浮液吸入内径为0.75毫米的30厘米长的色谱PEEK管中，连接到一毫升注射器。让管道在室温下冷却两分钟。

在室温下用100微升PBS预填充流动单元NMR管。通过轻轻推动注射器，将嵌入琼脂糖中的细胞线投射到流动单元NMR管中。从流动单元中取出空的NMR管，并将流速增加到每分钟两毫升几分钟，以除去进气管中的残留气泡。

将流速设置为每分钟0.2毫升，并通过缓慢但稳定地向上推动来插入含有细胞的NMR管。以每分钟0.1毫升的流速供应生物反应器培养基。将 NMR 光谱仪中的温度设置为 310 开尔文，并将流动单元插入光谱仪中。

将生物反应器插入 NMR 光谱仪后，等待几分钟以允许介质交换。调整质子通道的匹配和调谐，填充磁体，计算质子90度硬脉冲长度。根据质子硬脉冲调整每个脉冲序列中的质子功率水平。

记录第一个 zgesgp 质子 NMR 谱，以记录现场均匀性的样品含量。将 zgesgp 和 p3919gp 或 SOFAST-HMQC 实验复制到所需数量，并将它们排在采集后台处理程序中。通过用无菌长针注射器刺穿硅胶管，将外部分子的浓缩溶液注入介质储液瓶中。

在NMR实验结束时，用空管替换含有细胞的管，并用水冲洗流动单元。对于表达未标记碳酸酐酶的细胞，通过应用零填充和指数行宽窗口函数来处理p3919gp光谱。对于表达氮-15标记的超氧化物歧化酶的细胞，通过在两个维度上应用零填充和平方符号钟窗口函数来处理SOAFST-HMQC光谱。

在 MATLAB 中，使用自定义脚本导入光谱区域Load_ascii_spectra。运行Load_acqus脚本以从一维光谱中提取时间戳。通过运行mcr_main脚本打开 MCR-ALS 2.0 GUI，然后在"数据选择"选项卡中加载光谱矩阵。

通过绘制数据来检查数据。通过奇异值分解或手动评估分量的数量，并选择一种方法来初始估计纯光谱。可以使用最纯粹的变量检测或演化因子分析。

在"选择数据集"窗口中，选择"继续"。在"约束:行模式"窗口中设置浓度的约束。应用非负性约束，选择 fnnls 作为实现，选择两个作为物种数。

然后，应用一个闭包约束，将约束设置为一个，闭包约束条件等于，并应用于所有物种。在约束:列模式窗口中设置光谱的约束。应用非负性约束，选择 fnnls 作为实现，选择 2 作为物种数。

在最后一个窗口中，设置 50 次迭代和 0.01 收敛标准。指定浓度、光谱和标准差的输出名称。单击继续运行 MCR-ALS 管接头。

生物反应器中的细胞可以保持存活长达72小时，正如台盼蓝测试所证实的那样。该生物反应器用于实时监测两种抑制剂乙酰唑胺和甲唑胺与HEK 293 T细胞细胞质基质中过表达的碳酸酐酶的结合。使用第一个激发雕刻质子光谱评估来自过表达蛋白质的信号的存在和场均一性。

在碳酸酐酶的情况下，通过观察WATERGATE光谱百万分之11至16之间的区域中的质子信号来监测两种抑制剂的细胞内结合，这些信号由锌配位组氨酸和其他芳香残基引起。通过出现其他信号确认了成功的绑定。MCR-ALS用于分离游离和结合碳酸酐酶产生的NMR信号，并提供两种物质的相对浓度分布。

应用生物反应器监测由谷胱甘肽过氧化物酶模拟物ebselen促进的锌结合超氧化物歧化酶分子内二硫化物键的形成。对2D光谱选定区域的MCR-ALS分析将两个物种产生的信号分开，并提供了它们的相对浓度分布。缓慢而稳定地插入和取出流动单元NMR管非常重要，以避免可能导致形成气泡的压力跳跃。

NMR生物反应器的发展为研究原子分辨率时间依赖过程铺平了道路，例如绘制重制调控和活细胞中的药物/靶标相互作用。