هذه التقنية بمثابة طريقة تأسيسية للتجارب المصممة لم مقايسة الجنينية أو اليرقات التنمية من لعبة الكريكيت. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مرنة وستدعم عدة أنواع من النهج التجريبية، مثل تلك التي تستخدم تدخل الحمض النووي الريبي أو التلاعب الجينومي. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون هادلي ويلسون هورش، الباحث الرئيسي في المختبر.
لبدء هذا الإجراء الرطب الطائرة طاحونة الغزل من المطوق مع المياه نازف. ضع الإبرة المسحوبة في الممشوق وحولها إلى زاوية 20 درجة. خفض الإبرة حتى مجرد لمس لوحة طحن وت شطبها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
تقييم شطبة عن طريق وضع إبرة مشطوف على الشريط عصا مزدوجة التي تم الالتزام بها شريحة المجهر الزجاجي. ضع الشريحة على خشبة مسرح مجهر مركب مجهز بكاميرا وبرنامج للحصول على الصور. الحصول على صورة من الإبرة باستخدام هدف 20x.
استخدام برنامج التصوير لقياس قطر التجويف الداخلي للإبرة فقط قريبة لفتح مشطوف. تخلص من أي إبر ذات فتحة أصغر من ثمانية ميكرومترات أو أكبر من 12 ميكرومتر. أولاً، اصنع 40 ملليلتر من 1٪ agarose في الماء وسكبه في طبق بيتري طوله 10 سنتيمترات.
وضع ختم البيض جيدا على سطح agarose قبل أن يتجمد. بمجرد أن يتم ترسيخ agarose ، وإزالة الطابع للكشف عن الآبار. المقبل, ملء لوحة بئر agarose مع HBS تحتوي على 1٪ البنسلين ستريبتوميسين.
ضع الغطاء على الطبق، ولفه في بارا فيلم واخزنه عند أربع درجات مئوية. بعد هذا، ملء طبق بيتري 35 ملليمتر مع رمال الملعب الأبيض لجعل طبق جمع البيض للصراصر لوضع البيض في. غطي طبق البيض بمنشفة ورقية مربعة تقطع إلى حوالي 18 في 18 سنتيمترًا.
ملء مع مياه الصنبور من خلال منشفة ورقية. ثم، إمالة طبق بيتري والضغط بلطف على الجزء العلوي لإزالة المياه الزائدة. ثني زوايا ساحة منشفة ورقية تحت الطبق ووضع طبق البيض في غطاء مقلوب مما يساعد على الحفاظ على منشفة ورقية في مكانها.
ضع طبق البيض في سلة الكريكيت واسمح للإناث البالغات ببويض البيض لمدة ساعة إلى ساعتين. وفي الوقت نفسه، تسمح لطبق agarose لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة استعدادا لعقد البيض للحقن. عندما تكون جاهزة، قم بإزالة طبق جمع البيض، الذي يحتوي الآن على بيض مُنْضَن حديثاً، من صندوق الكريكيت.
إزالة منشفة ورقية ووضع مصفاة مع حجم المسام بين 0.5 ومتر واحد ملليمتر فوق منقار. شطف محتويات طبق وضع البيض في المصفاة تحت مياه الصنبور الجارية بلطف. سوف تسقط الحبوب الرملية من خلال شبكة المصفاة في القارس أدناه في حين أن بيض الكريكيت يبقى في سلة المصفاة.
املأ الحاوية بماء التناضح العكسي وضعه في صينية. عكس مصفاة على الحاوية والاستفادة منه ضد الطبق لإزاحة البيض في الماء. البيض سوف يغرق في الجزء السفلي من الحاوية.
بعد ذلك، استخدم المقص لقطع طرف P1000 ماصة لجعل فتحة ما يقرب من ثلاثة ملليمترات في القطر. ضع هذه النصيحة على طرّب P1000، واستخدمه لنقل البيض من الحاوية إلى طبق قوالب البيض agarose. باستخدام ملاقط بلاستيكية، يصطف البيض في آبار أغاروز.
كل بيضة سوف تغرق في الجزء السفلي من بئر الفرد. غطي طبق بيتري بغطاء حتى يصبح جاهزاً للحقن. للبدء، ضع طبق البيض تحت المجهر التشريحي وحدد تكبيرًا منخفضًا يبلغ حوالي 10x.
ارسم 1.5 ميكرولتراتر من محلول الحقن باستخدام 20 نصائح تحميل ميكرولتر وماصة P10 وأدخل طرف التحميل في الطرف الواسع من إبرة الحقن. طرد محلول الحقن في إبرة الحقن. أدخل الإبرة في مسكن الحقن وشدها ، مع التأكد من إدخال الإبرة بشكل صحيح وبحزم في السكن.
ثم أدخل بعناية في مسكن الحقن في ميكرومانبولاتور، مع الحرص على عدم كسر أو التعرض للأذى من قبل الإبرة. أثناء النظر إلى كل من البيض والإبرة من خلال المجهر ، حرّك الإبرة بالقرب من X في الزاوية اليسرى العليا من شبكة الطبق. خفض الإبرة حتى تلميح يدخل HBS بالإضافة إلى البنسلين ستريبتوميسين حل المخزن المؤقت في الطبق.
مركز الإبرة في مجال الرؤية وتحريك طبق البيض بحيث الإبرة هي بضعة ملليمترات أقرب إلى حافة الطبق من البيض. بعد ذلك، تعيين المجهر إلى مرشح مناسبة لرودامين لمراقبة الفلوريس في الإبرة والتركيز على طرف لها. على الحقن المجهري ببطء تحويل مقبض الباب التوازن في اتجاه عقارب الساعة حتى يبدأ حل الحقن لتسرب من الإبرة في حل التعليق.
ثم بدوره مقبض الباب مرة أخرى عكس عقارب الساعة قليلا حتى صبغ فقط يتوقف تسرب من الإبرة. مع الإبرة لا تزال تتمحور في مجال الرؤية، ونقل طبق البيض بحيث يتم توجيه الإبرة في البيضة التي سيتم حقنها أولا. ضبط التكبير إلى حوالي 50x بحيث تملأ بيضة واحدة معظم مجال الرؤية.
استخدام كل من micromanipulator ويد واحدة على طبق البيض لتحريك الإبرة في موقف للحقن. استخدم المايكرومانيبولاتر لتقدم الإبرة وأدخل الطرف في أول بيضة يتم حقنها، مع التأكد من إدخال الإبرة عند 20 إلى 30٪ من طول البيض من الطرف الخلفي لتعامد البيض على المحور الطويل للبيضة. حقن الحل مع إما دواسة القدم حقن أو زر الحقن على الحقن.
تشير bolة صغيرة من المواد الفلورية داخل البيضة إلى الحقن الناجح. بعد ذلك، تراجع الإبرة من البيضة. إذا تم رفع البيضة عن غير قصد من بئرها عند التراجع عن الإبرة ، استخدم ملقطًا صغيرًا لدفع البيضة مرة أخرى إلى البئر أثناء سحب الإبرة.
في هذه الدراسة، يتم حقن بيض الكريكيت باستخدام تقنية تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي. معدل البقاء على قيد الحياة هو معلمة هامة لتقييم نجاح هذه التجربة. معظم البيض الميت يمكن بسهولة أن تحدد عن طريق البصر كما صفار والأنسجة الجنينية داخل البويضة تبدأ في التكتل بشكل غير متساو، وفي نهاية المطاف معظم صفار سوف تهاجر إلى جانب واحد من البيضة.
عند تقييم بعد أربعة إلى ستة أيام، نجا أكثر من 85٪ من البيض غير المُصنَّع، في حين أن البيض المحقون بالكاشيف التجريبية كان معدل بقائه أقل بشكل عام. مطلوب السيطرة على جميع جوانب الحقن نفسه، بما في ذلك ثقب إبرة، وإدخال الصبغة والعزلة، أو وجود مركبة أو مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA، من أجل فهم الآثار الحقيقية للتلاعب التجريبية حاول. الطريقة التي يقيم المرء نتائج phenotypic من الحقن يعتمد على ما تم حقنه.
على سبيل المثال، قد تكون التغيرات الظاهرية نتيجة لضربات الميرنا المحددة واضحة على مستوى التشريح الإجمالي. من ناحية أخرى إذا تم إدراج cDNA ترميز EGFP الموسومة الجين histone 2B تحت سيطرة المروج أكتين G.bimaculatus في جينوم الكريكيت باستخدام transposase الظهر، يصبح من الممكن تصور كل نواة في البيض باستخدام الفلوريسنس لإثارة EGFP الموسومة hist 2B البروتين. ضبط التوازن بحيث لا تسد الإبر هو خطوة حاسمة في هذا الإجراء.
قد تحتاج إلى إجراء عدة تعديلات بعد الحقن اللاحقة منذ صفار أحيانا تسد طرف إبرة. الكريكيت هو حشرة hemimetabolous التي فروع basally إلى الحشرات الهولوميتabolous درس جيدا مثل Drosophila. إن دراسة تطوير لعبة الكريكيت ستساعدنا على فهم المزيد عن التطور والتطور في جميع أنحاء المملكة الحيوانية.
هذه التقنية تأخذ بعض الممارسة. نوصي بممارسة الحقن التحكم حتى معدل البقاء على قيد الحياة أربعة أو خمسة أيام بعد الحقن هو على الأقل 80٪
