注射格里鲁斯双形蛋

该技术是用于测定板球胚胎发育或幼虫发育的实验基础方法。该技术的主要优点是，它具有灵活性，将支持几种类型的实验方法，如使用RNA干扰或基因组操作的方法。实验室的主要调查员哈德利·威尔逊·霍奇将展示这一程序。

要开始此过程，用滴水将斜面的旋转研磨机平面弄湿。将拉针放入斜面，将其转动到 20 度角。放下针头，直到它只接触研磨板，并斜面两到三分钟。

通过将斜面针放在已粘附在玻璃显微镜幻灯片上的双斗胶带上来评估斜面。将幻灯片放在配备相机和图像采集软件的复合显微镜的舞台上。使用 20 倍目标获取针头图像。

使用成像软件测量针头的内部流明直径，刚到斜面开口。丢弃开口小于 8 微米或大于 12 微米的针头。首先，在水中制作40毫升1%的加糖，倒入10厘米的培养皿中。

在蛋井凝固之前，先在蛋井表面盖上蛋井盖章。凝固一次，取出印戳以露出井口。接下来，用含有1%青霉素链霉素的HBS填充阿加罗斯井板。

将盖子放在盘子上，用 Parafilm 包装，并将其存放在摄氏四度。在此之后，用白色游乐场沙子填充一个35毫米的培养皿，制作一个鸡蛋收集盘，让板球人产卵。用纸巾方形覆盖鸡蛋盘，切入约18由18厘米。

用纸巾加上自来水。然后，倾斜培养皿，轻轻挤压顶部以去除多余的水。将纸巾方的角落塞到盘子下面，将鸡蛋放在倒置的盖子中，这将有助于将纸巾放在原位。

将鸡蛋盘放入板球箱，让成年女性将鸡蛋放入一到两个小时。同时，让加糖盘加热到室温，准备将鸡蛋放在注射中。准备好后，从板球箱中取出现在含有刚产的鸡蛋的鸡蛋收集盘。

取下纸巾，将孔径介于 0.5 至 1 毫米之间的过滤器放在烧杯上。在轻轻的自来水下将产卵盘的内容冲洗到过滤器中。沙粒会通过过滤器网落入下面的烧杯，而板球蛋留在过滤器篮中。

用反渗透水填充容器，并放在托盘中。将过滤器倒置在容器上，用水龙头敲打盘子，将鸡蛋倒入水中。鸡蛋会沉入容器的底部。

接下来，用剪刀将 P1000 移液器尖端切开，使开口直径约为 3 毫米。将这个尖端放在P1000移管器上，并用它来将鸡蛋从容器转移到阿加罗斯蛋模盘上。使用塑料钳子，将鸡蛋排在加糖井中。

每个鸡蛋都会沉入单个井的底部。用盖子盖住培养皿，直到准备注射。首先，将鸡蛋盘放在解剖显微镜下，并选择大约10倍的低放大倍率。

使用 20 微升加载尖端和 P10 移液器绘制 1.5 微升喷射溶液，并将加载尖端插入注射针的宽端。将注射溶液排出注射针中。将针头插入注射壳体并拧紧，确保针头正确且牢固地插入壳体中。

然后小心地将注射壳体插入微操纵器中，小心不要被针头打断或受伤。通过显微镜观察鸡蛋和针头时，将针头移近菜盘网格左上角的 X。放下针头，直到尖端进入HBS加上青霉素链霉素缓冲溶液在菜中。

将针头放在视野中，移动蛋盘，使针头比鸡蛋更接近菜的边缘几毫米。在此之后，将显微镜设置为适合罗达明的过滤器，以观察针头中的荧光并聚焦在针头上。在微注射器上，顺时针缓慢转动平衡旋钮，直到注射溶液开始从针头中泄漏到悬浮液中。

然后稍微逆时针转动旋钮，直到染料停止从针头中泄漏。在针仍然以视场为中心时，移动蛋盘，使针头瞄准要先注射的鸡蛋。将放大倍数调整到大约 50 倍，以便单个鸡蛋填充大部分视野。

使用微操纵器和手放在鸡蛋盘上，将针头移动到注射位置。使用微操纵器推进针头，并将尖端插入要注射的第一个卵子中，确保将针头插入卵子长度的 20% 至 30%，从卵子的后端垂直于卵子的长轴。将溶液与喷射脚踏板或喷射按钮一起注入微注射器。

鸡蛋内一小块荧光材料表明注射成功。在此之后，从鸡蛋中收回针头。如果鸡蛋在缩回针头时无意中从井中抬出，则使用小钳子将鸡蛋推回井中，同时缩回针头。

在这项研究中，板球卵子被注射使用一种技术，作为许多实验中的基础方法，包括但不限于RNA干扰和基因组操作。存活率是评价实验成功与否的重要参数。大多数死蛋很容易被视觉识别，因为蛋黄和胚胎组织开始不均匀地团块，最终大部分蛋黄会迁移到蛋的一侧。

在四到六天后评估时，超过85%的未注射卵子存活下来，而注射实验试剂的卵子的存活率通常较低。为了了解尝试的实验操作的真正效果，需要控制注射本身的所有方面，包括针刺、染料和缓冲液的引入，或车辆的存在或双绞合RNA。评估注射的表型结果的方式取决于注射的表型结果。

例如，由于特定的 mRNA 击倒而导致的表型变化在总解剖水平上可能很明显。另一方面，如果使用背负转位酶将编码EGFP标记组蛋白2B基因的cDNA插入板球基因组，则利用荧光来激发EGFP标记的组蛋白2B蛋白。调整平衡，使针头不堵塞是此过程的关键步骤。

由于蛋黄有时会堵塞针尖，因此您可能需要在随后的注射后进行几次调整。板球是一种血小昆虫，其基础分支，以研究良好的全脂代谢昆虫，如果蝇。研究板球的发展将有助于我们了解整个动物王国的进化和发展。

这种技术需要一些练习。我们建议练习控制注射，直到注射后四五天的存活率至少为 80%