Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal cuore e Stroke Foundation of Canada e da The Morris e Bella Fainman Family Foundation. Gli autori vorrei ringraziare Veronique Michaud per il suo aiuto tecnico con il sistema di imaging ad ultrasuoni VEVO770.

Tutte le procedure sono state approvate dal istituzionale animale cura Comitato della McGill University Montreal, QC, Canada. Tutte le attrezzature necessarie sono elencata nella tabella I.
1. murino (C57BL/6J) IVC stasi protocollo
<ol><li>Preparazione all'intervento Nota: Questo è un intervento chirurgico di sopravvivenza e di conseguenza, un'adeguata tecnica asettica deve essere seguita in ogni momento. Questo include assicurandosi che tutti i materiali sono a portata di mano, la pulizia e sterilizzazione degli strumenti prima e tra uso e che designa una zona sterile sulla superficie di lavoro per tutto il materiale sterile.<ol>
<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e materiali in autoclave. Uno sterilizzatore di perlina di vetro è sufficiente per sterilizzare suggerimenti strumento tra gli animali, se più di una procedura venga eseguita in una sola volta.</li>
		<li>Anestetizzare topi maschii C57Bl/6 di 8-10 settimane vecchio con una miscela di 100% ossigeno e 2,5% isoflurane. Nota: Regolare il flusso di ossigeno e isoflurano come necessario.</li>
		<li>Confermare amputate pizzicando la zampa posteriore dell'animale tra le dita dei piedi con il forcipe. Nessuna risposta dal pizzico indica che l'animale è anestetizzato.</li>
		<li>Somministrare analgesici a lento rilascio (buprenorfina) tramite iniezione sottocutanea. Dare ai topi una dose di 1 mg di analgesico per 1 kg di peso corporeo (1 mg/kg).</li>
		<li>Posto unguento oculare su entrambi gli occhi dell'animale affinché nessun dissecazione corneale per tutta la durata della procedura.</li>
		<li>Somministrare per via sottocutanea 0,2 - 0,5 mL di liquidi isotonici per 10 g di peso corporeo.</li>
		<li>Fissare l'animale alla tabella chirurgia utilizzando nastro chirurgico. Metti l'animale in posizione supina per esporre l'addome. Eseguire un intervento chirurgico su un rilievo di riscaldamento per evitare l'ipotermia.</li>
		<li>Rimuovere i capelli dall'addome del mouse mediante applicazione di una crema depilatoria per 1-2 min. pulire l'area addominale pulire con garza e acqua distillata, se necessario.</li>
		<li>In alternativa, rimuovere i capelli dall'addome di rasatura con un rasoio elettrico piccolo.</li>
		<li>Sterilizzare l'addome con Baxedin (soluzione di clorexidina gluconato BP) prima di effettuare qualsiasi incisioni. Applicare etanolo leggermente con una garza per evitare eccessive perdite di calore causata dall'evaporazione dell'alcool.</li>
	</ol></li>
	<li>Esposizione della Vena Cava inferiore (IVC)
	<ol>
<li>Utilizzando le forbici chirurgiche, eseguire una laparotomia per aprire la cavità addominale.<ol>
<li>Sollevi la pelle con il forcipe al basso addome e praticare un'incisione verticale parallela su entrambi i lati della linea alba. Effettuare l'incisione prima a sinistra o a destra della linea alba, a seconda la manualità dell'operatore. L'incisione è fatta partire dal midline per assistere in ecografia più tardi.</li>
			<li>Fare un'incisione seconda, orizzontale nella parte superiore dell'addome. Nota: Al momento la penetrazione nell'addome, la muscolatura dovrebbe essere "tented" e poi penetrata con le forbici chirurgiche per evitare di danneggiare gli organi addominali.</li>
			<li>Ripetere le incisioni verticali e orizzontali su strato del muscolo addominale dell'animale. Essere sicuri di tenda la muscolatura durante la penetrazione nell'addome per non danneggiare gli organi sotto. Attenzione: Sollevare pelle e muscolo dall'intestino e altri organi interni quando fare incisioni per non forare loro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Piegare la pelle e muscolo da incisione per esporre la cavità addominale.</li>
		<li>Applicare garza, inumidito con soluzione isotonica, ai lati dell'apertura della ferita ed esternare l'intestino. Applicare pressione su entrambi i lati dell'addome per assistere l'esternalizzazione degli intestini. Utilizzare movimenti dolci con un cotton-fioc per spostare gli intestini. Immergere la garza in soluzione isotonica e posto sopra l'intestino esternalizzato.<ol>
<li>Garza deve essere pre-inumidito prima del posizionamento sul tessuto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spostare da parte qualsiasi grasso peritoneale ed esporre il IVC fra le vene iliache e renali.</li>
		<li>Fare un'identificazione iniziale di rami laterali evidenti. Un ramo laterale apparirà come più piccolo, ma significativa vena che si dirama dalla IVC, tra renale e iliaca vene. Sistema vascolare può variare notevolmente fra i topi. Topi possono avere rami laterali presenti su uno o entrambi i lati del IVC.</li>
	</ol></li>
	<li>Legatura dei rami laterali Nota: Se rami laterali sono presenti, è seguita la seguente procedura per ciascuno di essi. Se non è presente, procedere al passaggio 4: posizionamento della sutura iniziale sotto il IVC. Il sito di legatura del IVC sarà immediatamente distale della vena renale sinistra, indipendentemente dalla presenza di rami laterali.<ol>
<li>Eseguire una dissezione smussa su ciascun lato del ramo laterale. Scollamento è il processo di apertura ripetutamente forcipe smussato con una leggera pressione, in modo da spezzare attraverso fascia senza danneggiare i vasi circostanti. Attenzione: Evitare forature o danneggiare la vena.</li>
		<li>Sollevare il ramo e passare una sezione di 6-0 sutura seta sotto la vena. Fare sempre attenzione quando il sollevamento o lo spostamento di navi. Si consiglia di afferrare il grasso intorno ai vasi, altrimenti c'è il rischio di danneggiare la nave.</li>
		<li>Mezzo di sutura forcipe, fare una legatura chirurgica intorno al ramo laterale utilizzando il nodo chirurgico standard tecnica di legatura. Legatura completa è fatto per garantire 100% occlusione della vena. Utilizzare almeno tre tiri di legatura per fissare saldamente la legatura.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.3 per qualsiasi restanti rami laterali.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione dell'aorta addominale da IVC
	<ol>
<li>Eseguire una dissezione smussa intorno la IVC immediatamente distale dalla vena renale di sinistra. L'aorta addominale è collegato a IVC tramite fascia, pertanto eseguire iniziale dissezione smussa intorno alla IVC e l'aorta addominale. Attenzione: Evitare di perforatura o di danneggiare la vena. Non rompersi o puntura sia vaso. Questa è la parte più critica della procedura, con il più alto rischio di danno vascolare.</li>
		<li>Continuare ad applicare una leggera pressione tramite dissezione smussa fino a quando una finestra trasparente è fatta fra l'aorta e IVC.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionamento della sutura e legatura IVC
	<ol>
<li>Passare una sezione di 6-0 sutura seta sotto l'IVC e l'aorta addominale.</li>
		<li>Individuare la sutura attraverso la finestra creata tra l'IVC e l'aorta. Utilizzare pinze per tirare il filo di sutura e infilarla fra l'aorta addominale e IVC. Far passare la sutura attraverso con attenzione, cercando di non tirare/puntura la IVC e dell'aorta addominale.</li>
		<li>Fare una legatura chirurgica intorno IVC con il forcipe di sutura, garantendo una totale occlusione della vena. Ancora una volta, rendere la legatura immediatamente distale dalla vena renale di sinistra.</li>
		<li>Fare tre tiri di sutura per garantire la legatura. Nota: È anche possibile passare la sutura sotto l'IVC e l'aorta prima che separa i due come opzione alternativa. In alternativa, le suture 7-0 Prolene possono essere utilizzate per la legatura dei rami laterali e IVC.</li>
	</ol></li>
	<li>La chiusura della ferita e cure post-operatorie
	<ol>
<li>Verificare che l'aorta addominale è stato lasciato senza interruzioni e che tutti i rami laterali sono stati legati. L'IVC appare dilatato distale dal sito legatura e nessun sangue flusso sarà visibile.</li>
		<li>Posto tutto grasso peritoneale e intestini indietro nella cavità addominale.</li>
		<li>Chiudere la ferita con sutura forcipe e sutura seta 6-0. Utilizzare un suturare corrente (semplice continuo) e assicurarsi che la sutura non sarà troppo stretta. Una sutura stretta rompe quando l'animale si sveglia e si muove intorno la sua gabbia.<ol>
<li>In alternativa, è possibile utilizzare clip PDS, Vicryl, Vicryl, Dexon o in acciaio inox per la chiusura della ferita.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sutura lo strato del muscolo addominale prima mediante sutura appropriata tecnica di legatura.</li>
		<li>Ripetere la tecnica di sutura per la pelle e verificare la chiusura della ferita è sufficiente. Nota: Se si utilizza la stessa sutura ago e filo per più animali, sterilizzare sia in etanolo al 70% prima di ogni utilizzo.</li>
		<li>Rimuovere l'animale dal gas anestetico e metterli in un'incubatrice di 34 ° C per almeno 30 minuti.</li>
		<li>Ancora una volta, somministrare 0,2 - 0,5 mL di liquidi isotonici per 10 g di peso corporeo per via sottocutanea. Fluidi possono essere dato nei giorni successivi per mantenere il peso corporeo pre-operatoria, se necessario.</li>
		<li>Monitorare l'animale fino al recupero per garantire il successo della chirurgia e valutare la salute generale dell'animale. Attenzione: Aspettatevi una lieve postura ricurva per una procedura invasiva come questo, ma l'animale si comporterà normalmente più presto post-operazione di 30 minuti.</li>
		<li>Mettere l'animale in una propria gabbia e non metterlo con gli altri animali fino a quando completamente recuperato.</li>
		<li>Ri-amministrare analgesico ogni giorno per fino a 48 h operata.</li>
		<li>Posto cibo sul pavimento della gabbia per l'animale mentre in recupero. Altra cura speciale non è generalmente necessario.</li>
		<li>Esaminare il sito della ferita per arrossamento, gonfiore, o scarico e altri segni di infezione.</li>
		<li>Se necessario, rimuovere le suture dopo 7-10 giorni.</li>
		<li>Eseguire immediatamente l'eutanasia se chirurgia ha esito negativo (ad esempio, significativi danni e/o sangue perdita del vaso) o animale non migliora con cure post-operatorie. L'eutanasia è generalmente effettuata a operata di 48 h. Per gli esperimenti più lunghi, è possibile utilizzare 7-0 Prolene per legare i rami laterali e VCI e suture di Vicryl 5-0 per chiudere la cavità addominale.<ol>
<li>Eseguire l'eutanasia amputate dell'animale in un'induzione come descritto in precedenza, tranne al 5% isoflurane. Questa è seguita da asfissia con 100% CO2 mentre anestetizzati.</li>
			<li>Dopo la conferma dell'eutanasia per asfissia (perdita del battito cardiaco e non respira), eseguire dislocazione cervicale per garantire completa eutanasia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. protocollo di ultrasuono ad alta frequenza di
Nota: Questo protocollo è adattato dalla signora Davis Institute roditore Phenotyping Core SOP per l'imaging ad ultrasuoni ad alta frequenza. Questo protocollo viene effettuato post-operatorio 24 h, ma può essere fatto prima, purché l'animale sta rispondendo bene alla chirurgia. Il protocollo può essere effettuato in qualsiasi momento su topi sani ed è spesso fatto per confrontare prima e dopo la chirurgia.
<ol><li>
Preparazione dell'animale
	<ol>
<li>Metti l'animale in una camera di induzione e anestetizzare l'animale con una miscela di 100% ossigeno e 2,5% isoflurane.</li>
		<li>Accendere il monitor di temperatura e frequenza cardiaca. Lampada di calore posizione sopra tabella per tenere caldo animale durante la procedura.</li>
		<li>Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e applicare il lubrificante di occhio per evitare disidratazione corneale. Posizionare l'animale sulla piattaforma di analisi e fissare il tubo anestetico per bocca/naso dell'animale.</li>
		<li>Ultrasuono caldo gel a 37 ° C e mettere il gel sull'addome dell'animale. Il gel per ultrasuoni è riscaldato mediante un sistema di riscaldamento dell'acqua che pompe caldo acqua attraverso le bobine che sono avvolti intorno alla bottiglia di gel.</li>
		<li>Per misure di frequenza cardiaca (se necessario), mettere gel per elettrodi 4 elettrodi della piattaforma di analisi e fissare le zampe dell'animale per il piattaforma/elettrodi con nastro chirurgico. Metti l'animale in posizione supina per l'imaging del IVC. Il sistema di imaging a ultrasuoni comprende una piattaforma di analisi che viene riscaldata e contiene gli elettrodi per il monitoraggio dell'animale.</li>
		<li>Per misure di temperatura, mettere il gel per elettrodi sul termometro e inserire nel retto dell'animale.</li>
		<li>Regolare la lampada di calore e isoflurano come necessario garantire quell'animale è confortevole, ha una respirazione tra 30-70 bpm ed è tenuto a 37 ° C.</li>
		<li>Se necessario, Radere l'addome dell'animale o Rimuovi i peli con la crema depilatoria. Applicare per 1-2 minuti e pulire con garza e acqua distillata. Nota: I capelli troppo possono influenzare la qualità delle immagini.</li>
		<li>Posizionare la garza sotto o al lato dell'animale per catturare qualsiasi gel per ultrasuoni in eccesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L'IVC e l'embolo di imaging
	<ol>
<li>Attivare il software di imaging e avviare un nuovo studio.</li>
		<li>Selezionare un scanhead adeguato per l'imaging. Il scanhead usato qui è per gli organi addominali (frequenza: 35 MHz, lunghezza focale: 12,8 mm).</li>
		<li>Registrare tutte le informazioni pertinenti circa l'animale. Questo può includere animale ID, sesso, peso, data di nascita, ceppo, ecc.</li>
		<li>Abbassare il scanhead fino a quando non sta toccando il gel per ultrasuoni sull'animale.</li>
		<li>Avviare la sonda scanhead per iniziare 2-D imaging dell'animale. In questa modalità, le immagini sono presentate come due dimensioni, in varie tonalità di grigio.</li>
		<li>Individuare l'IVC e l'aorta addominale spostando la piattaforma del mouse durante la x - e/o y-aereo, mentre anche in movimento il scanhead attraverso il piano z. Nota: Sangue vasi apparirà con il loro bianco di pareti e il sangue all'interno quasi nero. Aorta addominale sarà pulsare intensamente e hanno pareti più spesse, mentre l'IVC sarà hanno pareti più sottili e comprimere/espandere facilmente l'immagine dello schermo quando il scanhead viene spostato e giù. Il sito di legatura sarà evidente, come la vena sarà essere dilatata e la parete venosa arriverà a un punto. Qualsiasi embolo formata all'interno sarà solido sotto l'imaging ad ultrasuoni e non comprimerà facilmente come fa la parete venosa. La vena comprimerà solo sopra la legatura, dove nessun embolo è formato.</li>
		<li>All'individuazione della IVC e il sito di legatura, centro loro il punto focale degli ultrasuoni, al fine di ottenere l'immagine più accurata.<ol>
<li>Se l'immagine è troppo buio per vedere chiaramente, regolare il gel e rimuovere eventuali bolle d'aria con un cotton-fioc.</li>
			<li>Se necessario, inclinare il scanhead 45° verso sinistra o verso destra e riadattare la piattaforma animale per vedere chiaramente la vena. Ciò avviene se c'è interferenza con il scanhead. In questo scenario, la vena deve essere imaged ad angolo lato per evitare la sutura. Nota: Immagine interferenza è spesso causato da macchie scure della pelle il posizionamento della sutura della ferita poveri, bolle nel gel ultrasuoni o degli animali.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando il software, prendere le foto di tutte le strutture desiderate e fare misurazioni utilizzando qualsiasi strumenti di misurazione. Misure comuni includono l'area della sezione trasversale dell'embolo o larghezza del sito legatura.</li>
		<li>Modificare la modalità di imaging Doppler onda di impulso di fare misure del flusso sanguigno. Questa modalità consente l'imaging del flusso sanguigno vascolare e la misura della velocità di flusso, tra altre variabili.</li>
		<li>Inclinare la piattaforma di analisi per abbassare l'estremità posteriore dell'animale.</li>
		<li>Modificare la posizione di angolo della scanhead in modo che metterà in contatto il gel con un angolo di circa 30° dalla parte posteriore dell'animale.</li>
		<li>Riposizionare la piattaforma animale e scanhead. Se necessario, riposizionare l'IVC e la legatura.</li>
		<li>Effettuare misure del flusso sanguigno intorno al sito di legatura per confermare lo stasis e prendere qualsiasi immagine desiderate. Misure comuni di flusso sanguigno includono velocità media, velocità di picco o velocità mediana.</li>
		<li>Salvare le misure o le immagini scattate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recupero di clean-up e animale
	<ol>
<li>Sollevare il scanhead per posizione iniziale e riposizionare la piattaforma animale alla posizione iniziale, come pure.</li>
		<li>Rimuovere il gel in eccesso fuori l'animale con una garza. Farlo delicatamente in modo che la sutura della ferita non sarà essere rotto.</li>
		<li>Rimuovere il termometro dal retto dell'animale e l'animale fuori dalla piattaforma.</li>
		<li>Metti l'animale nella sua gabbia e un incubatore di 34 ° C.</li>
		<li>Monitorare l'animale fino al recupero. La procedura è molto minore e non invasivo. L'animale si sveglia rapidamente. Continuare il monitoraggio degli animali nei giorni seguenti conformemente al punto 1.6 del presente protocollo.</li>
		<li>Pulire la piattaforma animale con garza e disinfettante.</li>
		<li>Pulire il scanhead con garza e acqua distillata. Attenzione: Pulire il scanhead molto delicatamente e solo con acqua distillata.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2 per il prossimo animale.<ol>
<li>Se fatto con tutti i soggetti, verificare che tutte le immagini e le registrazioni sono state salvate. Quindi spegnere tutte le apparecchiature e software.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+diagnosed+deep+vein+thrombosis+in+the+general+population:+systematic+review.">Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).</li><li>McGuinness, C. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ci sono diversi passaggi critici per la formazione del trombo venoso successo utilizzando il modello di stasi. Induzione di trombosi della vena è più impegnativo in vecchi topi dovuta all'accumulo di grasso che circonda la vena cava inferiore e l'aorta. Idealmente, i topi sottoposti a questa procedura dovrebbero essere 8 - 10 settimane fa. Dovrebbe prestare molta attenzione a non indurre danno endoteliale nell'IVC durante la dissezione smussa e la legatura. Inoltre, è fondamentale per mantenere l'animale in un'incubat...

Tromboembolismo venoso (TEV), che è composto di trombosi venosa profonda (TVP) ed embolia polmonare, è la terza causa di morte cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus. È una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 5001. VTE può portare a: 1) morte attraverso embolia polmonare; 2) post-trombotica sindrome, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione; o 3) ipertensione polmonare cronica conseguente compromesso respiratorio cronico significativo. TEV è una malattia multi-fattoriale e può derivare da stasi del flusso sanguigno, danni alle pareti del vaso, e/o stati hypercoagulable a causa di una rottura dell'equilibrio tra la coagulazione e del sistema fibrinolitico, come è stata descritta più di cento anni fa di Virchow ed è noto come triade di Virchow.
Perché nella maggior parte dei casi è impossibile da ottenere campioni DVT umani, i ricercatori hanno sviluppato modelli sperimentali animali di DVT. Sono stati utilizzati diversi animali incluse ratto2del mouse3, coniglio4, maiale5, cane6e primate non umano7 . I topi possono essere geneticamente modificati e sono l'animale più frequentemente usato per studiare DVT. Tuttavia, come in tutti gli animali, DVT spontanea non è osservato nei topi. Pertanto, alterazioni fisiche o chimiche della parete venosa vengono utilizzate per creare trombosi nei topi. In precedenza abbiamo utilizzato il modello di cloruro ferrico per indurre trombosi nella vena cava inferiore (IVC) di topi8,9,10. Questo modello ha il vantaggio di produrre in modo affidabile gli emboli occlusivi pochi minuti e può essere utilizzato per indagare il ruolo dei farmaci anticoagulanti e antipiastrinici durante la TVP acuta. Tuttavia, è una procedura terminale. Così, per studiare la TVP acuta e cronica, il modello di stasi è più adatto. In questo modello, la formazione dell'embolo è indotta dall'interruzione completa del flusso di sangue nella VCI, uno dei fattori nella triade di Virchow per sviluppo di TVP. Questo modello può essere utilizzato per studiare la formazione di DVT e risoluzione, che è un vantaggio rispetto al FeCl3 modello11.
Abbiamo sviluppato un metodo non invasivo per seguire la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo utilizzando un sistema di micro-Imaging per applicazioni ad alta frequenza ultrasuoni12. Precedentemente abbiamo dimostrato che misura di trombosi venosa dall'ultrasuono correla favorevolmente con gli emboli ottenuti patologico. In due studi successivi abbiamo confermato che le misure ottenute con ultrasuoni in correlazione con l'embolo area quantificato di istochimica9,10e peso dell'embolo. Ancora più importante, abbiamo mostrato che l'ultrasuono ad alta frequenza può essere utilizzato per monitorare la formazione di trombosi venosa profonda in topi12. Può anche essere utilizzato per quantificare la risoluzione dell'embolo in modo non invasivo.
Qui, descriviamo il protocollo che consente la formazione di trombi utilizzando il modello murino di trombosi stasi-indotta e come formazione dell'embolo possa essere monitorata in modo non invasivo nel corso del tempo usando l'ultrasuono ad alta frequenza.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-0 perma-hand silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>706G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps (straight and curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Driver</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO 770 High Resolution Imaging System</td>
			<td>Visualsonics</td>
			<td>No longer sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR Buprenorphine</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>Given to LDI by Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systan eye oinment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>288/28062-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x2 sterile Gauze</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#104148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#7411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel (Aquasonic-100)</td>
			<td>Dufort &#38; Lavigne</td>
			<td>#AKEN4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water heated hard pad</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>#HHP-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar heater water pump TP500</td>
			<td>MATVET Inc.</td>
			<td>#R-500305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infra-red heating lamp</td>
			<td>electrimat inc.</td>
			<td>#1R175R-PAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse rectal temperature prope</td>
			<td>emkaTECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep vein thrombosis induced by stasis in mice monitored by high frequency ultrasonography

La trombosi venosa è una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 500. Trombosi venosa profonda può condurre alla morte attraverso l'embolia polmonare o risultati nella sindrome post-trombotica, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione, o nell'ipertensione polmonare cronica conseguente significativo cronica delle vie respiratorie compromesso. Questa è la più comune malattia cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus ischemico ed è una sfida clinica per tutte le discipline mediche, come può complicare il corso di altre malattie come il cancro, la malattia sistematica, chirurgia e trauma principale.
Modelli sperimentali sono necessari per lo studio di questi meccanismi. Il modello di stasi induce embolo coerente dimensione e una quantità quantificabile dell'embolo. Tuttavia, è necessario sistematicamente lega i rami laterali della vena cava inferiore per evitare la variabilità nelle dimensioni dell'embolo e qualsiasi interpretazione di dati errati. Abbiamo sviluppato una tecnica non invasiva per misurare la dimensione dell'embolo usando l'ecografia. Utilizzando questa tecnica, che possiamo valutare lo sviluppo dell'embolo e risoluzione nel tempo dello stesso animale. Questo approccio limita il numero di topi necessaria per la quantificazione di coerenza con il principio di sostituzione, riduzione e perfezionamento degli animali nella ricerca di trombosi venosa. Abbiamo dimostrato che il peso dell'embolo e l'analisi istologica di embolo dimensione correlano con la misura ottenuta con l'ecografia. Pertanto, lo studio corrente descrive come indurre trombosi profonda della vena in topi utilizzando il modello di stasi della vena cava inferiore e come monitorare utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza.

Modello di trombosi venosa stasi
Nel modello di stasi, topi sono anestetizzati e un'incisione è fatta per esporre la vena cava inferiore (IVC). L'incisione è fatta sul lato sinistro o destro del mouse invece di una laparotomia mediana in un modo che non avrebbe interferito con la sonda di ultrasuono. I muscoli addominali e la pelle si piega indietro per esporre il IVC (Figura 1). ...

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Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Il presente protocollo descrive la procedura per ottenere la trombosi venosa utilizzando un modello di stasi. Inoltre, stiamo utilizzando un metodo non invasivo per misurare la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo.

Trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dall'ecografia ad alta frequenza

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

deep-vein-thrombosis-induced-stasis-mice-monitored-high-frequency

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K Views.  McGill University. Il presente protocollo descrive la procedura per ottenere la trombosi venosa utilizzando un modello di stasi. Inoltre, stiamo utilizzando un metodo non invasivo per misurare la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo.

Video: Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Identificare i geni disregolazione indotta da sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to Witebsky's postulates, one of the criteria in diagnosing a disease as autoimmune is the reproduction of the disease in experimental animals by the passive transfer of autoantibodies. For epidermolysis bullosa acquisita (EBA), a prototypic organ-specific autoimmune disease of skin and mucous membranes, several experimental models were recently established. In the animal model described in our present work, purified IgG antibodies against a stretch of 200 amino acids (aa 757-967) of collagen VII are injected repeatedly into mice reproducing the blistering phenotype as well as the histo- and immunopathological features characteristic to human EBA 1. Full-blown widespread disease is usually seen 5-6 days after the first injection and the extent of the disease correlates with the dose of the administered collagen VII-specific IgG. The tissue damage (blister formation) in the experimental EBA is depending on the recruitment and activation of granulocytes by tissue-bound autoantibodies 2,-4. Therefore, this model allows for the dissection of the granulocyte-dependent inflammatory pathway involved in the autoimmune tissue damage, as the model reproduces only the T cell-independent phase of the efferent autoimmune response. Furthermore, its value is underlined by a number of studies demonstrating the blister-inducing potential of autoantibodies in vivo and investigating the mechanism of the blister formation in EBA 1,3,-6. Finally, this model will greatly facilitate the development of new anti-inflammatory therapies in autoantibody-induced diseases. Overall, the passive transfer animal model of EBA is an accessible and instructive disease model and will help researchers to analyze not only EBA pathogenesis but to answer fundamental biologically and clinically essential autoimmunity questions.

In the animal model described in our present work, purified IgG antibodies against a stretch of 200 amino acids (aa 757-967) of collagen VII are injected repeatedly into mice reproducing the blistering phenotype as well as the histo- and immunopathological features characteristic to human epidermolysis bullosa acquisita (EBA)1.

Granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Stenosi della Vena Cava inferiore: un modello murino di trombosi venosa profonda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Evaluation of Blood Lactate and Plasma Insulin During High-intensity Exercise by Antecubital Vein Catheterization

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different exercise modalities. During some exercise modalities (e.g., high-intensity interval exercise), blood metabolites and hormonal levels change in short periods of time. In the present study, we describe a method to catheterize the antecubital vein, which allows the collection of several blood samples during exercise. Insulin and venous lactate concentrations were measured during high-intensity exercise by the application of the described method. The exercise consisted of three 30 s bouts of high-intensity exercise separated by 4 min of recovery. After the last recovery period, a Wingate test was performed. Blood samples from the antecubital vein were obtained before and after each 30 s bout and before and after the Wingate test. As a result, it was possible to evaluate the plasma insulin and venous blood lactate variations during the exercise.

Here we present a protocol to obtain several blood samples from the antecubital vein during high-intensity interval training. This protocol may be useful for the measurement of blood metabolites and endocrinal markers during exercise.

Valutazione del lattato del sangue e del Plasma dell'insulina durante l'esercizio fisico ad alta intensità di cateterizzazione della vena antecubitale

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT in isomerasi indotta da glucosio (G6PI)

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...