Gli autori vorrebbero ringraziare Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert per la loro assistenza nella caratterizzazione del virus derivato dal clone. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell&#39;Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive, NIH con sovvenzioni AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).

1. Trasformazione e recupero dei plasmidi di cloni infettivi <ol><li> Trasformare entrambi i plasmidi (separatamente) utilizzando un protocollo di trasformazione commerciale ( ad esempio , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con alcune modifiche. Entrambi i plasmidi contengono un gene che codifica per la resistenza all&#39;ampicillina, quindi utilizzare ampicillina o carbenicillina per la selezione. La carbenicillina è preferita, in quanto è più stabile. <ol><li> Rimuovere le celle (vedere tabella dei materiali) da congelatore da -80 ° C e scongelare su ghiaccio per 5-10 min. Brodo Lysogeny (LB) (contenente 10 g / L NaCl e 25 μg / mL carbenicillina, chiamato LB-carb) e il brodo con repressione catabolita (SOC (senza antibiotici) - venuta con le cellule) a 37 ° C. </li><li> Aggiungere fra 100 pg-10 ng in 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μL di cellule competenti; Mescolare delicatamente spostando il tubo. </li><li> Incubare i tubi in ghiaccio per 5 min. </li><li> Tubazioni a scossa termica a 42 ° C per 30 sIn un bagno d&#39;acqua. Ritorna al ghiaccio per 2 minuti subito dopo lo shock termico. </li><li> Pipettare 950 μL di temperatura ambiente SOC in ogni tubo e mescolare pipettando. Distribuire 100 μL di miscela batterica su un piatto di LB-carb e incubare per una notte a 37 ° C (circa 12-14 h). </li></ol></li><li> Rimuovere le piastre da incubatore a 37 ° C dopo 12-14 h di incubazione. Posizionare le piastre in un cassetto scuro a temperatura ambiente per permettere alle colonie di continuare a crescere (circa 8-9 h). </li><li> Utilizzando 5 ml di brodo Terrific (TB, contenente 25 μg / mL di carbenicillina, chiamato TB-carb), coltivate 5-10 piccole colonie per ogni plasmide per una notte a 30 ° C in un agitatore batterico (circa 14-16 h). NOTA: Le piccole colonie sono un indicatore che il plasmide è intatto; Le colonie con plasmidi contenenti delezioni, riarrangiamenti o mutazioni (qui chiamati eventi di instabilità) crescono più velocemente e quindi saranno più grandi. Pertanto, si dovrebbe cercare di prendere le colonie più piccole sul piatto, in particolare noT selezionando le più grandi colonie presenti. Alcune colonie di medie dimensioni possono anche essere selezionate per completezza. La temperatura inferiore utilizzata riduce la probabilità che le cellule si svilupperanno (OD 600 superiore a 0,6-0,8). Poiché la maggior parte dei ricercatori esegue la crescita durante la notte, consente un maggiore controllo e riduzione delle probabilità di sovraesposizione. </li><li> Controllare le colture liquide per la torbidità (circa OD 600 di 0,6-0,8). Posizionare eventuali tubi torbidi a 4 ° C e permettere a altri tubi di diventare torbidi crescendo per più tempo. NOTA: Non coltivare i batteri ai valori OD 600 maggiori di quelli raccomandati, in quanto possono verificarsi eventi di instabilità plasmidica. </li><li> Estrarre il DNA plasmidico da batteri con un kit di miniprep plasmide commerciale (vedi tabella dei materiali). Eluire in 15 μl di pre-riscaldato (a 70 ° C in un blocco di riscaldamento) tampone di eluizione. Lasciare che il buffer di eluizione si incuba sulla colonna per 5 minuti prima della centrifugazione. NOTA: conservare almeno 1 ml di questa coltura di starter a 4 ° C perUlteriore utilizzo nella fase successiva. </li><li> Digest 10 μL dei plasmidi recuperati per valutare se gli eventi di instabilità del plasmide si sono verificati durante la coltura. NOTA: Digest p1 con SalI / NheI e p2 con BamHI / HindIII a 37 ° C per 1 h. Confermare la presenza delle bande corrette dopo la digestione ( Figura 2a ) mediante elettroforesi a gel e procedere al punto 2. Se si prepara il DNA del plasmide mediante l&#39;amplificazione a cerchio di rotolamento (RCA), riservare un po &#39;di eluato di miniprep per servire come template. </li></ol> 2. Preparazione di un sufficiente DNA plasmidico per la legatura NOTA: La legatura e la successiva elettroporazione richiedono una quantità sufficiente di DNA plasmidale che deve essere generato tramite maxiprep o RCA. Mentre il maxiprep è l&#39;approccio tradizionalmente utilizzato, RCA offre il vantaggio di non richiedere batteri, eliminando così il potenziale di tossicità indotta dal plasmide nei batteri che possono causare eventi di instabilità. <ol><li><stRong&gt; Eseguire la seguente procedura maxiprep. <ol><li> Per ciascun plasmide che ha dimostrato il corretto schema di digestione dell&#39;enzima di restrizione nella sezione precedente, aggiungere 500 μl di coltura d&#39;avviamento a 1 L di brodo di TB-Carb (25 μg / mL carbenicillina) e agitare per una notte a 30 ° C (circa 14-16 h , Circa OD 600 di 0,6-0,8). NOTA: non consentire alla coltura di crescere oltre questo valore OD 600 . Ciò potenzialmente può determinare eventi di instabilità all&#39;interno dei plasmidi. </li><li> Raccogli i batteri e eseguite maxipreps per protocollo del produttore (vedi tabella dei materiali). </li></ol></li><li> Utilizzando il miniprep salvato dal punto 1.6, eseguire quanto segue per la procedura RCA. <ol><li> Trasferire 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μl di campione di tampone. </li><li> Diluire il campione a 95 ° C per 3 minuti e poi incubare a 4 ° C fino a quando non è pronto per l&#39;uso. </li><li> Preparare l&#39;amplificazione commercialePremix (vedi tabella dei materiali ). Combinare 50 μl di tampone di reazione con 2 μl di miscela enzimatica in un tubo posto sul ghiaccio. NOTA: La premiscela di amplificazione deve essere mantenuta sul ghiaccio fino a quando non sarà pronta per l&#39;uso. È conveniente preparare un mix master combinando reagenti sufficienti per il numero richiesto di reazioni di amplificazione. Ogni premiscela non utilizzata deve essere scartata. </li><li> Trasferire 50 μl di preparata preparata di amplificazione al campione denaturato. </li><li> Incubare i tubi di reazione a 30 ° C per 18 ore. </li><li> Incubare i tubi a 65 ° C per 10 minuti per inattivare la polimerasi ø29 DNA. </li><li> Conservare i tubi di reazione a 4 ° C oa -20 ° C fino all&#39;uso pronto. NOTA: A questo punto, il plasmide DNA preparato con entrambi i metodi dovrebbe essere quantificato (utilizzando l&#39;assorbanza a 260 nm) e il genoma ZIKV dovrebbe essere Sanger sequenziato interamente per confermare eventi di instabilità (delezioni e riarrangiamenti) durante la preparazione. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome primario </td><td> Sequenza (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1For. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 632For. </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1201For. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1663For. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 2008For. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV conservato 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 2605Per. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4132For. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4665For. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 5219For. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6119Per. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6769Per. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 7343Per. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 8243Per. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV conservato 9133For. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 9686For. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10455Per. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Primer per il sequenziamento di cloni cDNA. I plasmidi possono essere sequenziati interamente con i primer elencati. Primeri contrassegnati come indici &quot;conservati&quot;Che sono probabilmente in grado di sequenziare / amplificare tutti i genotipi di ZIKV. I primer contrassegnati come &quot;PRVABC59&quot; sono specifici a questo ceppo ma possono anche funzionare per altri ceppi di genotipo asiatici e forse altri genotipi. 3. Preparazione di RNA trascritto in vitro <ol><li> Impostare la reazione di digestione del DNA preparato con maxiprep o RCA. <ol><li> Per la digestione p1, mescolare 10 μL di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di BamHI-HF, 3 μL di rSAP o CIP e 3,3 μg di DNA p1. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Per la digestione p2, mescolare 10 μl di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di EcoRI-HF e 13,3 μg di DNA p2. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1-2 ore. </li><li> Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 30 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare ilColonna per 5 min prima della rotazione). NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito. </li></ol></li><li> Preparare la reazione di legame. <ol><li> Combinare 10 μl di tampone di reazione di DNA di 10x T4, 3 μL di ligasi del DNA di T4 (400 U / μL), 29 μl di p1 purificato e 29 μl di p2 purificato. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o 16 ° C per una notte. </li><li> Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 10 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare colonna per 5 minuti prima della filatura). NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito. </li></ol></li><li> Eseguire i plasmidi non digeriti, i plasmidi digeriti e la legatura su un gel agarosico. Il prodotto di legatura dovrebbe avere una banda di peso molecolare superiore (circa 11 kb) rispetto a solo il plasmide digerito, indicando che la legatura ha avuto successo ( Figura 2b ).</li><li> Impostare T7 in vitro reazione di trascrizione. <ol><li> Combinare 10 μL di 2x ARCA / NTP Mix, 2 μL di miscela polimerasi T7 RNA e 8 μL di reazione di legatura purificata per un volume finale di 20 μL. NOTA: L&#39;ARCA incluso nel mix è un analogo di protezione che è incorporato esclusivamente nell&#39;orientamento corretto. Gli analoghi di protezione standard possono determinare solo il ~ 50% delle trascrizioni con un tappo nell&#39;orientamento corretto. </li><li> Incubare per 4 ore a 37 ° C. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA tramite uno spettrofotometro UV. Facoltativamente, eseguire un gel agarosante denaturante per confermare la lunghezza del trascritto RNA. </li></ol></li></ol> 4. Salvataggio del virus infettivo mediante elettroporazione <ol><li> Giorni prima dell&#39;elettropazione, preparare 1 pallone T182 di cellule Vero (tra T150 e T182 è accettabile, coltivato in DMEM + 10% siero fetale fetale (FBS)) per struttura da recuperare. Includi 1 T182 come un controllo di transforzione falsa. CeDeve essere utilizzato a confluenza del 70-80%. </li><li> Quando le cellule sono pronte, posizionare 12 mL / reazione di DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in un bagno d&#39;acqua riscaldato a 37 ° C. </li><li> Staccare le cellule mediante trypsinizzazione con un protocollo standard e recuperare le cellule nel supporto con il 10% di FBS per inattivare la tripsina; Centrifugare le cellule a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Le cellule di lavaggio in soluzione salina fosfato-tampone 1x (PBS), celle di pelleto a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ripetere due volte questo passaggio per un totale di tre lavaggi. </li><li> Resuspendere le cellule in 200 μL di RPMI 1640 + 10 mM HEPES (sterile) per # campioni. Trasferire 200 μL di sospensione cellulare in un tubo sterile. Le cellule devono essere di ~ 0,5 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 20 μL di acqua (controllare la negazione negativa) o 20 μL di RNA (preferibilmente 5-10 μg) prodotta nel passaggio 3.4 ad ogni set di cellule. Mescolare delicatamente facendo scorrere il tubo e trasferire il contenuto del tubo in una cuvetta di elettroporazione di divario di 2 mm. </li><li> Impostare un elettrOporatore a 170 V LV, omega (resistenza) a 0 e 950 μF (circa 625 V / cm e 20 ms di tempo per altre macchine). Impostare la resistenza all&#39;impostazione più bassa disponibile, 0 o ∞ se disponibile. </li><li> Impulsi una volta e subito aggiungere 600 μL di DMEM +15% FBS +10 mM HEPES che è stato riscaldato nel passaggio 4.2. Sciacquare bene all&#39;interno della cuvetta per rimuovere tutte le celle. Aggiungere le cellule a un pallone di coltura tissutale T75 contenente 10 ml di supporto pre-riscaldato. Rimuovere i supporti aggiuntivi dalla cuvetta utilizzando il contagocce incluso nella cuvetta. Fare attenzione a mantenere la sterilità. </li><li> Tappo di turbolenza per mescolare i supporti e le cellule e collocare in incubatore a 37 ° C. </li><li> Controllare il giorno successivo per la vitalità delle cellule e farlo ogni giorno fino a quando il 50-75% della morte cellulare viene osservata. La morte cellulare viene osservata confrontando il controllo di elettroporazione. NOTA: L&#39;effetto citopatico ZIKV (CPE) è abbastanza pronunciato nelle cellule Vero, provocando cellule arrotondate che si staccano e galleggiano nel mezzo di coltura. abbiamoHa osservato una gamma di 8-10 giorni come ideale per la raccolta. </li><li> Raccogliere il supernatante in un tubo conico e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari a&gt; 3.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante chiarificato in un nuovo tubo e completare con una concentrazione finale del 20% di FBS (da 100% di azione). Inoltre, aggiungere HEPES sterile ad una concentrazione finale di 10 mM come agente tampone per preservare l&#39;infettività del virus mentre è congelato (da uno stelo sterile di 1 M). </li><li> Mescolare il virus mediante vortexing e l&#39;aliquota in flaconcini a vite. Conservare a -80 ° C per un utilizzo futuro. </li></ol> 5. Titolazione del virus recuperato <ol><li> Seguire il numero appropriato di piastre da 6 o 12 pozzetti di cellule Vero il giorno prima della titolazione. </li><li> Rimuovere il virus dal congelatore e fare serie di diluizioni 10 volte in DMEM + 2% FBS in tubi o piatti a 96 pozzetti. NOTA: Il titolo atteso da cloni recuperati è compreso tra 1 x 10 6 e 5 x 10 7 PFU / mL. </li><li> Aggiungi 200 oR 400 μL di ciascuna diluizione in duplice copertura a un pozzetto di una piastra da 12 o 6 pozzetti, rispettivamente. </li><li> Posizionare le piastre in incubatore a 37 ° C e scendere ogni 15 minuti per un periodo di adsorbimento di ~ 1-1,5 h. </li><li> Rimuovere l&#39;inoculo virale e aggiungere 1 ml di overlay di DMEM-Tragacanth a 12 pozzetti o 2 mL (6 pozzetti) ad ogni pozzetto. NOTA: è possibile utilizzare agarosio, agar, metilcellulosa o altri supporti di sovrapposizione qui. </li><li> Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C per 5 giorni. Il tempo per una corretta formazione delle placche varia a seconda della sovrapposizione utilizzata. </li><li> Per fissare le celle, rimuovere le piastre dall&#39;incubatore e coprire decantamente in disinfettante. </li><li> Aggiungere un sufficiente 20% di etanolo / 0,1% di violetta di cristallo (CV) ad ogni pozzetto per coprire e turbare per mescolare. NOTA: Molti altri fissativi esistono e possono essere usati qui. Inoltre, se si utilizza una sovrapposizione di agarosio o di agar, è possibile utilizzare una seconda sovrapposizione in combinazione con il rosso neutro per visualizzare le placche senza fissaggio. L&#39;etanolo del 20% ha dimostrato di essereEfficace nell&#39;inattivazione dei virus avviluppati negli studi precedenti; Non utilizzare questa quantità per i virus non avvolti in quanto non saranno inattivati 19 . </li><li> Incubare le piastre per 30-60 minuti a temperatura ambiente (in un armadio di sicurezza di classe II); Scartare CV (secondo le normative locali) e lavare le piastre con acqua di rubinetto. </li><li> Lasciare le piastre per asciugare e contare manualmente le placche. NOTA: il riferimento 20 può essere utilizzato come riferimento aggiuntivo per eseguire test di placca. </li></ol>

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid.">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone.">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li><li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography.">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065 (2014).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone.">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching.">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode...

Il virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) è un flavivirus dalle zanzare che è arrivato in Brasile nel 2013-14 ed è stato successivamente associato ad un massiccio focolaio di malattia febbrile che si è diffuso in tutte le Americhe 1 . Inoltre, ZIKV è stato collegato a gravi conseguenze della malattia, come la sindrome di Guillain-Barré negli adulti e la microcefalia nei feti e nei neonati 2 . Poco noto su ZIKV prima della sua diffusione rapida nell&#39;emisfero occidentale. Ciò comprendeva la mancanza di strumenti molecolari, ostacolando così la ricerca meccanicistica. Gli strumenti molecolari per i virus, come i cloni infetti cDNA, facilitano il vaccino e lo sviluppo terapeutico antivirale e consentono la valutazione dei fattori genetici virali correlati alla patogenesi virale differenziale, alla risposta immunitaria e all&#39;evoluzione virale. I cloni infettivi di Flavivirus sono noti per essere altamente instabili nei batteri dovuti alla crI promotori prokaryotici yptici presenti nei loro genomi 3 . Sono stati utilizzati diversi approcci per migliorare questo problema; Incluso l&#39;inserimento di ripetizioni tandem a monte delle sequenze virali 4 , la mutazione di sequenze 5 di promoter prokaryotiche presunte, suddividendo il genoma in plasmidi multipli 6 , vettori di numeri a bassa copia (compresi i cromosomi artificiali batterici) 7 , 8 e l&#39;inserimento di introni nel genoma virale 9 . Un sistema a tutta lunghezza senza modifiche è stato descritto per ZIKV; Tuttavia, questo clone sembrava essere attenuato nella coltura cellulare e nei topi 10 . Altri gruppi hanno introdotto gli introni nel genoma ZIKV, consentendo la distruzione di sequenze instabili nei batteri che possono essere splicate in cellule di mammiferi in vitro per la produzione di virus infettivo 11, 12 . Inoltre, un sistema basato su PCR intitolato Infectious-Subgenomic-Amplicons è stato usato con successo per salvare il prototipo MR766 ceppo di ZIKV 13 . L&#39;approccio qui descritto non richiede sequenze straniere, ma disturba il genoma nella regione di elevata instabilità usando plasmidi multipli, precedentemente impiegati con successo con la febbre gialla 6 , i dengue 14 , 15 e i virus del West Nile 16 . Inoltre, l&#39;aggiunta della sequenza ribozima di epatite D alle terminazioni genomiche virali facilita la creazione di un&#39;autentica 3 &#39;estremità senza la necessità di aggiungere un sito di linearizzazione. Inoltre, entrambi i plasmidi sono costruiti in un vettore di numero di copie basse (pACYC177, ~ 15 copie per cellula) per mitigare ogni tossicità residua 17 . Il virus recuperato mostra un profilo di crescita comparabile aVirus parenterale in curve di crescita in vitro in 8 linee cellulari comprendenti una varietà di tipi di cellule derivanti da entrambi i mammiferi e dagli insetti e ha mostrato identici profili patogeni nei topi e nelle infezioni, diffusione e velocità di trasmissione nelle zanzare 18 . Qui abbiamo un protocollo che descrive come coltivare i plasmidi infetti del clone, generare in vitro l&#39; RNA virale a piena lunghezza (il genoma virale) e recuperare il virus infettivo nella coltura cellulare. In primo luogo, descriviamo la propagazione di plasmidi in batteri o amplificazione senza batteri usando l&#39;amplificazione del cerchio di rotolamento (RCA). Successivamente, mostriamo come i due plasmidi vengono digeriti e successivamente legati insieme per generare virus a piena lunghezza. Infine, descriviamo la produzione di RNA trascritto e la sua successiva elettroporazione in cellule Vero, seguita da una titolazione del virus recuperato ( Figura 1 ). L&#39;approccio descritto è rapido, permettendo perR recupero di scorte di virus infettive in 1-2 settimane.

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin, Disodium Salt</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Amplification Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 units/ml</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400,000units/mL</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 High Throughput Electroporation System</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>Other machines are acceptable.</td></tr><tr><td>LB Broth with agar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>Can be homemade as well.</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>Can be homemade as well.</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>Culture Tubes</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 flasks</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Powder</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Denatured</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Oligos</td><td>IDT</td><td>see table 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>other methods are acceptable.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>other methods are acceptable.</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>other methods are acceptable.</td></tr><tr><td>Class II Biosafety Cabinet</td><td>Varies</td><td>N/A</td><td>This is necessary for live-virus work.</td></tr></tbody></table>

rescue and characterization of recombinant virus from a new world zika virus infectious clone

I cloni infetti cDNA consentono la manipolazione genetica di un virus, facilitando così il lavoro sui vaccini, la patogenesi, la replicazione, la trasmissione e l&#39;evoluzione virale. Qui descriviamo la costruzione di un clone infettivo per il virus Zika (ZIKV), che attualmente sta causando uno scoppio esplosivo nelle Americhe. Per evitare la tossicità per i batteri che è comunemente osservato con i plasmidi derivati ​​da flavivirus, abbiamo generato un sistema a due plasmidi che separa il genoma al gene NS1 ed è più stabile di quelli a piena lunghezza che non possono essere recuperati con successo senza mutazioni. Dopo la digestione e la legatura per unire i due frammenti, l&#39;RNA virale a piena lunghezza può essere generato mediante trascrizione in vitro con T7 RNA polimerasi. Dopo l&#39;elettroporazione di RNA trascritto nelle cellule, è stato recuperato il virus che ha mostrato simili cinetica di crescita in vitro e fenotipi di virulenza e infezione in vivo nei topi e nelle zanzare rispettivamente.

Il protocollo qui descritto consente di recuperare il virus Zika derivato dal clone infettivo. La manipolazione del sistema clone infettiva a due plasmidi è semplice quando viene eseguita con cura, rispetto alle versioni a piena lunghezza che sono altamente instabili (dati non mostrati). Dopo la digestione e la legatura dei due pezzi distinti, il RNA ricoperto viene prodotto usando la trascrizione in vitro con la T7 polimerasi, che viene poi elettroporato in cellule Ve...

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Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Views.  Colorado State University.  Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide. 

Video: Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantificazione di esaltazione anticorpo-dipendente del Virus in cellule umane primarie Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly and additional brain abnormalities. However, the mechanism underlying the pathogenesis of ZIKV in the developing brain remains unclear. Intracerebral surgical methods are frequently used in neuroscience research to address questions about both normal and abnormal brain development and brain function. This protocol utilizes classical surgical techniques and describes methods that allow one to model ZIKV-associated human neurological disease in the mouse nervous system. While direct brain inoculation does not model the normal mode of virus transmission, the method allows investigators to ask targeted questions concerning the consequence after ZIKV infection of the developing brain. This protocol describes embryonic, neonatal, and adult stages of intraventricular inoculation of ZIKV. Once mastered, this method can become a straightforward and reproducible technique that only takes a few hours to perform.

Here we describe a method for establishing a model of Zika virus-induced microcephaly in mouse. This protocol includes methods for embryonic, neonatal, and adult-stage intracerebral inoculation of the Zika virus.

Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Neuroscienze

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Salvataggio del virus zoka ricombinante da un clone cDNA cromosoma artificiale batterico

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

Isolamento e quantificazione del virus zika da più organi in un mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

Saggi antivirali ad alto rendimento per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Riepilogo

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