Name: vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Riconosciamo lo staff del World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, per il loro instancabile lavoro nel curare e fornire molti dei ceppi virali utilizzati per gli esperimenti di competenza vettoriale nostri e di altri gruppi. Il lavoro presentato è stato finanziato dal McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e dalle sovvenzioni NIH AI120942 e AI121452.

Tutte le procedure eseguite in questi protocolli sono state eseguite nel pieno rispetto dei protocolli approvati dall'Institutional Biosafety Committee e dall'Institutional Animal Care and Use Committee della University of Texas Medical Branch di Galveston.
1. Amplifica ZIKV nelle celle Vero
<ol><li>Coltiva cellule Vero (CCL-81 o VeroE6) nella modifica di Dulbecco del mezzo essenziale minimo (DMEM) di Eagle integrato con il 10% v / v siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l'1% (v / v) penicillina-streptomicina (100 U / mL e 100 μg / mL, rispettivamente) in un incubatore umidificato a 37 ° C con co5% con co 2 a una confluenza compresa tra 80-90% in un pallone di coltura tissutale di 150 cm2.</li>
	<li>In un armadio di biosicurezza (BSC), rimuovere il mezzo e smaltire in candeggina al 10% o in una diluizione di lavoro di doppio ammonio quaternario (Tabella dei materiali). Inoculare immediatamente il monostrato con 1 mL di stock virale, mirando a 0,1-1 particella virale infettiva per cellula. Agitare immediatamente il pallone in modo tale che l'inoculo entri in contatto con il monostrato nella sua interezza.</li>
	<li>Ricaricare il mezzo a un volume di 5 ml utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina. Quindi spostare il pallone nell'incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per 60 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il pallone dall'incubatrice e portarlo in un BSC. Aggiungere ulteriore mezzo a un volume totale di 15 ml utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina. Spostare il matraccio in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Esaminare il pallone ogni giorno al microscopio a contrasto di fase per l'evidenza di effetti citopatici (CPE). Procedere alla raccolta virale (fase 1.7) quando solo circa il 40-50% delle cellule rimane nel monostrato, generalmente 3-5 giorni dopo la concentrazione a seconda del ceppo di ZIKV utilizzato.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e metterlo in un flaconcino conico da 50 ml. Chiarire il surnatante dei detriti cellulari mediante centrifugazione (3.500 x g per 20 min). NOTA: se più palloni sono stati infettati in modo identico, i supernatanti di più palloni possono essere combinati in tubi conici da 50 ml.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante dal tubo conico da 50 ml in uno fresco, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Integrare il surnatante con FBS inattivato dal calore ad una concentrazione finale del 30% (v/v). Aliquotare questa miscela in singoli tubi con tappo a vite e congelare a -80 °C fino all'uso.</li>
</ol>2. Preparazione di farine di sangue artificiali
<ol><li>Il giorno in cui le zanzare devono essere esposte a farina di sangue infettiva, accendere la fonte di energia (Tabella dei materiali) in un impianto di contenimento degli artropodi in modo tale che le unità di alimentazione ( Tabella deimateriali) siano preriscaldate nel momento in cui le zanzare sono preparate per l'esposizione.</li>
	<li>Preparare farine di sangue artificiali utilizzando uno dei metodi descritti di seguito.<ol>
<li>Metodo 1: Combinare sangue umano appena raccolto (entro una settimana) citrato o eparinizzato acquistato commercialmente 1:1 v/v con brodo virale (preparato come descritto nel paragrafo 1). NOTA: Questo metodo è subordinato all'assenza di anticorpi contro la famiglia virus/virus presenti nel sangue.</li>
		<li>Se l'assenza di anticorpi non può essere confermata o se la fonte di sangue è nota per avere una precedente esposizione al flavivirus, lavare e imballare manualmente gli eritrociti.<ol>
<li>In un BSC, aggiungere 30 mL di sangue umano intero a un tubo conico da 50 mL e rabboccare fino a 50 mL con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
			<li>Centrifuga a 3.500 x g per 20 min.</li>
			<li>Aspirare il surnatante versando delicatamente in una vaschetta contenente candeggina al 10% o diluizione di lavoro di doppio ammonio quaternario, facendo attenzione a non scartare il pellet di eritrociti.</li>
			<li>Aggiungere 10 ml di PBS e picchiettare delicatamente il fondo del tubo conico contro il fondo del BSC in modo tale che il pellet di eritrociti sia stato ricostituito. Portare il volume della sospensione fino a 50 ml con PBS. Mescolare per inversione delicata.</li>
			<li>Ripetere i passaggi 2.2.2.1−2.2.2.4 per un totale di 4−6x. Confermare che il surnatante è chiaro o solo leggermente rosa e non più opaco. Rimuovere tutto il surnatante usando una pipetta sierologica. Sospendere il pellet di eritrociti in 1−2 ml di PBS.</li>
			<li>Assemblare la farina di sangue: 350 μL di eritrociti confezionati, 100 μL di saccarosio al 10%, 200 μL di FBS inattivato dal calore, ATP ricombinante da 900 μM e 2 ml di stock virale opportunamente diluito utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sovrapporre un'unità serbatoio standard da 3 ml(Tabella dei materiali)con la pelle di un topo non infetto (altre opzioni includono film di paraffina, membrane collagenose o involucro di salsiccia).</li>
	<li>Posizionare il serbatoio coperto su asciugamani di carta bianca. Aggiungere ~ 2 mL di farina di sangue infettiva al serbatoio 1 mL alla volta. Ispezionare l'asciugamano sotto l'alimentatore per eventuali prove di perdite. Se sono presenti perdite, recuperare la farina di sangue dagli alimentatori e scartare le coperture. Sigillare gli alimentatori con tappi. Ancora una volta conferma che non sono presenti perdite.</li>
</ol>3. Backtitration di farine di sangue/test della placca
<ol><li>Utilizzando il volume rimanente della farina di sangue preparata, eseguire una serie di diluizioni seriali 10x (cioè 6 diluizioni, che vanno da diluito 10x a 1.000.000x) utilizzando DMEM integrato con FBS inattivato dal calore al 2% v / v e 1% (v / v) penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Aliquota 100 μL delle diluizioni nei pozzetti di 24 o 12 piastre di pozzo dal più diluito al più concentrato.</li>
	<li>Incubare per 1 ora in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Alla fine del periodo di incubazione di 1 ora, riportare le piastre nel BSC e aggiungere 1 mL o 2 mL di sovrapposizione di metilcellulosa alle piastre a 24 pozzetti o 12 pozzetti, corrispondentemente.</li>
	<li>Riposizionare le piastre sovrapposte in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 3-7 giorni (virus dipendente dal ceppo).</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatore e portarle nel BSC. Scartare la sovrapposizione di metilcellulosa in una vaschetta contenente il 10% di candeggina o un doppio disinfettante al ammonio quaternario.</li>
	<li>Lavare ogni pozzetto 2 volte con PBS, scartando il lavaggio in una teglia contenente il 10% di candeggina o doppio ammonio quaternario.</li>
	<li>Aggiungere ~1 mL di metanolo:acetone (1:1 v:v) e lasciare che le celle si fissino sulla piastra per almeno 30 minuti nel BSC a temperatura ambiente (RT). Scartare il metanolo: acetone secondo la politica istituzionale sui rifiuti organici.</li>
	<li>Visualizza ZIKV utilizzando uno dei due metodi descritti di seguito.<ol>
<li>Dopo la rimozione del metanolo: acetone, colorare immediatamente con una soluzione di cristallo viola (0,25% p/v in metanolo al 30%) per 5 minuti. Risciacquare 2 volte nell'acqua del rubinetto e lasciare asciugare, quindi visualizzare direttamente ad occhio per prove di placche o distruzione del monostrato.</li>
		<li>In alternativa, eseguire il test di formazione del focus.<ol>
<li>Lasciare asciugare le piastre all'aria fino a quando non rimane alcun fissativo organico. NOTA: questo dovrebbe richiedere ~ 2-3 ore al di fuori del BSC, ma può essere accelerato dall'essiccazione all'aria in un BSC o in una cappa di fumi chimici.</li>
			<li>Lavare ogni pozzetto 3 volte per 15 minuti ciascuno in PBS non sterile (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale. Rimuovere PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di blocco (PBS + 3% FBS) a ciascun pozzo e roccia per 15 minuti a RT.</li>
			<li>Aggiungere 100 μL per pozzetto di anticorpo primario α-ZIKV o α-flavivirus (ad esempio, ibridoma del gruppo flavivirus D1-4G2-4-15 [4G2]) a una diluizione 1:2.000 in soluzione bloccante. Incubare con dondolo per un minimo di 4 ore (preferibilmente durante la notte, non superiore a 18 ore) a RT.</li>
			<li>Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte per 15 minuti ciascuno con PBS (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale.</li>
			<li>Aggiungere 100 μL per pozzetto dell'anticorpo secondario (capra α topo HRP-marcato) diluito 1:2.000 nel tampone bloccante. Incubare con dondolo per 1 ora a RT.</li>
			<li>Lavare 3 volte per 15 minuti ciascuno con PBS (Mg2+ e Ca2+ libero) su un bilanciere a piastra orbitale.</li>
			<li>Aliquota 100 μL di reagente per lo sviluppo del substrato (Tabella dei materiali) per pozzetto. Piastre di roccia a RT per 15 min.</li>
			<li>Arrestare la reazione allo sviluppo di focolai / placche rimuovendo il substrato e risciacquando le piastre 2 volte con acqua del rubinetto. Versare l'acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria le piastre prima di quantificare.</li>
			<li>Contare i focolai virali per determinare il numero di FFU presenti nel campione dato.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Somministrazione di farine di sangue
<ol><li>Usa le zanzare Ae. aegypti 2-4 giorni dopo l'eclosione. Ordinare le zanzare femmine in cartoni di cartone da 0,5 L con coperchi schermati e privarle di zucchero (generalmente 36-48 ore prima della farina di sangue infettiva). Fornire acqua ad libitum tramite batuffoli di cotone saturi d'acqua.</li>
	<li>Rimuovere i batuffoli di cotone saturi d'acqua al mattino in cui le zanzare saranno esposte alla farina di sangue infettiva.</li>
	<li>Collegare serbatoi contenenti farine di sangue artificiali ai cavi dell'unità di alimentazione all'interno di un vano portaoggetti di plastica trasparente.</li>
	<li>All'interno del vano portaoggetti, posizionare una scatola di cartone da 0,5 L con un coperchio schermato, contenente 50-100 zanzare Ae. aegypti affamate, sotto l'unità di alimentazione attaccata al serbatoio. NOTA: le zanzare opportunamente affamate si nutrono generalmente entro 20 minuti. L'alimentazione può essere prolungata secondo necessità per aumentare le dimensioni del campione nelle popolazioni più lente, anche se questo non dovrebbe estendersi oltre i 60 minuti, perché il titolo virale (ZIKV) può diminuire all'interno dell'alimentatore dopo ~ 60 minuti.</li>
	<li>Al termine dell'alimentazione, rimuovere il serbatoio e immergere nella candeggina al 10% appena fatta.</li>
	<li>Anestetizzare a freddo le zanzare mediante incubazione per 30 s a -20 °C o per 5 minuti in frigorifero.</li>
	<li>All'interno del vano portaoggetti, versare le zanzare in una capsula di Petri sul ghiaccio. Conta e ordina le femmine ingorgate dalle zanzare non impegnate. Smaltire le zanzare non innestate per immersione in un tubo conico da 50 ml riempito con etanolo al 70%. Mentre le zanzare sono ancora anestetizzate, versarle di nuovo nella scatola di cartone da 0,5 L e coprire rapidamente con lo schermo e il coperchio. Tagliare la rete dello schermo in eccesso dal cartone e fissare la rete con del nastro adesivo.</li>
	<li>Aggiungere un batuffolo di cotone saturo di saccarosio acquoso filtrato sterile al 10% sullo schermo di ciascuna scatola. Metti tutti i cartoni delle zanzare in un grande contenitore secondario di plastica con una spugna umida per mantenere l'umidità.</li>
	<li>Posizionare un contenitore secondario contenente cartoni di zanzare in un'incubatrice con una temperatura di 27 ± 1 °C (o a seconda dei casi per simulare le condizioni nella regione di interesse) con l'80% di ± il 10% di umidità relativa e un ciclo luce-buio 16:8). Mantenere le zanzare con accesso ad libitum al 10% di saccarosio fino al completamento degli esperimenti.</li>
</ol>5. Acquisizione ed elaborazione del campione
<ol><li>Nei giorni specificati dopo l'alimentazione, aspirare un numero predeterminato di zanzare dai cartoni appropriati utilizzando un aspiratore meccanico all'interno di un vano portaoggetti. Coprire il tubo di raccolta con un tondo di cotone dopo aver acquisito il numero richiesto di zanzare.</li>
	<li>Anestetizzare a freddo le zanzare mediante incubazione per 30 secondi a -20 °C o per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>All'interno del vano portaoggetti, versare le zanzare in una capsula di Petri sul ghiaccio. Utilizzando due paia di pinze, rimuovere tutte e sei le zampe di ciascuna zanzara e posizionarle in un tubo microcentrifuga a fondo rotondo preetichettato da 2 mL contenente un cuscinetto a sfere in acciaio inossidabile sterilizzato (7/32 ") e 500 μL di mezzi di raccolta delle zanzare (MCM) composti da DMEM, 2% FBS, 1% penicillina-streptomicina e 2,5 μg / mL di amfotericina.</li>
	<li>Posizionare delicatamente la zanzara su una goccia di olio minerale per trattenerla, avendo cura di non permettere alcun contatto tra l'olio e la testa e la proboscide della zanzara.</li>
	<li>Inserire la proboscide della zanzara in una punta della pipetta da 10 μL riempita con 10 μL di FBS inattivato dal calore. NOTA: In alternativa, la pipetta può essere riempita con saccarosio, sangue o olio minerale. L'olio consente la visualizzazione diretta delle bolle di saliva tramite microscopia ottica.</li>
	<li>Lasciare salivare la zanzara per 30 minuti. Espellere la punta della micropipetta contenente FBS + saliva in un tubo di microcentrifuga contenente 100 μL di MCM, quindi posizionare la carcassa in un tubo microcentrifuga a fondo tondo da 2 mL separato contenente un cuscinetto a sfere in acciaio sterilizzato e 500 μL di MCM. Assicurarsi che i tubi utilizzati per i corpi, le gambe e la saliva siano etichettati in modo che sia chiaro che tutti e tre i campioni provengono dalla stessa zanzara.</li>
	<li>Mentre le zanzare stanno salivando, eseguire i passaggi 5.3-5.5 sulle zanzare rimanenti.</li>
	<li>Trasportare i tubi contenenti i corpi e le gambe a un dispositivo di omogeneizzazione del tessuto di fresatura di perline contenuto all'interno di un BSC. Triturare tutti i campioni del corpo e delle gambe a 26 Hz per 5 minuti per liberare particelle virali nel surnatante. Chiarire tutti i campioni mediante centrifugazione a 200 x g per 5 minuti a pellet detriti cellulari. NOTA: A questo punto, i campioni possono essere congelati a -80 °C o analizzati immediatamente.</li>
</ol>6. Rilevazione di ZIKV mediante test infettivo
<ol><li>In un BSC, preparare 24 piastre di coltura tissutale con cellule Vero(10 5 cellule per pozzetto) 24 ore prima dell'inizio del test infettivo. Etichettare ogni pozzetto con l'identità di una singola zanzara/campione.</li>
	<li>Se i campioni sono stati congelati a -80 °C, lasciare scongelare.</li>
	<li>Rimuovere il supporto dalle piastre cellulari Vero prima dell'inoculazione con campioni una piastra alla volta.</li>
	<li>Per i campioni contenenti corpi o zampe, aliquotare accuratamente 100 μL di surnatante chiarificato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non disturbare i detriti delle cellule di zanzara dal pellet. NOTA: i campioni di saliva possono essere diluiti 1:1 (v/v) con MCM prima dell'inoculazione sulle cellule per conservare i campioni per una successiva titolazione, se necessario.</li>
	<li>Spostare le piastre in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 1 ora.</li>
	<li>Riportare le piastre al BSC e aggiungere ~ 1 mL di copertura di metilcellulosa a ciascun pozzetto. Riposizionare le piastre sovrapposte in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 e incubare per 3-7 giorni (virus/ceppo-dipendente).</li>
	<li>Eseguire la fissazione e la visualizzazione come descritto nei passaggi 3.6-3.9.</li>
	<li>Per quanto riguarda il punteggio tramite un test di formazione del fuoco, quantificare i pozzetti positivi esaminando al microscopio ottico. Il rilevamento della colorazione intracitoplasmatica delle cellule in un pozzo indica la presenza di virus. I campioni vengono valutati esclusivamente come focus-positivi o -negativi.</li>
</ol>

<ol>
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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui descritti forniscono un flusso di lavoro generalizzato per condurre analisi delle competenze vettoriali. Come quadro generale, molte di queste metodologie sono conservate in tutta la letteratura. Tuttavia, c'è un notevole spazio per le modifiche (recensito in Azar e Weaver1). Virus (ad esempio, lignaggio virale, conservazione del virus di sfida, storia di passaggio virale), entomologia (ad esempio, colonizzazione di laboratorio di popolazioni di zanzare, immunità innata, microbioma ...

La competenza vettoriale è definita come la capacità a livello di specie, popolazione e persino individuo, di un dato artropode come una zanzara, una zecca o una mosca di sabbia flebotomina, di acquisire e trasmettere un agente biologicamente con replicazione o sviluppo nell'artropode1,2. Per quanto riguarda le zanzare e i virus trasmessi dagli artropodi (cioè gli arbovirus), l'agente viene assorbito da un ospite viremico da una zanzara femmina. Dopo l'ingestione, il virus deve infettare in modo produttivo una di una piccola popolazione di cellule epiteliali dell'intestino medio3, superando vari ostacoli fisiologici come la degradazione proteolitica da parte degli enzimi digestivi, la presenza del microbiota (barriera di infezione dell'intestino medio, o MIB) e la matrice peritrofica secreta. L'infezione dell'epitelio midgut deve essere seguita dalla replicazione del virus e dall'eventuale fuga dal midgut nel sistema circolatorio aperto della zanzara, o emolinfa, che rappresenta l'insorgenza di un'infezione disseminata che supera la barriera di fuga del midgut (MEB). A questo punto il virus può stabilire infezioni dei tessuti secondari (ad esempio, nervi, muscoli e corpi adiposi) e continuare a replicarsi, sebbene tale replicazione secondaria possa non essere strettamente necessaria affinché il virus infetti le cellule acinari delle ghiandole salivari (superando la barriera di infezione della ghiandola salivare). L'uscita dalle cellule acinari della ghiandola salivare nelle loro cavità apicali e quindi il movimento nel dotto salivare consente l'inoculazione del virus in ospiti successivi al morso e completa il ciclo di trasmissione1,2,4,5,6,7.
Dato questo meccanismo di diffusione ben caratterizzato e generalmente conservato all'interno di un vettore di zanzara, le valutazioni delle competenze vettoriali di laboratorio sono spesso metodologicamente simili, sebbene esistano differenze nei protocolli1,2. Generalmente, dopo l'esposizione orale al virus, le zanzare vengono sezionate in modo che i singoli tessuti come l'intestino medio, le gambe, le ovaie o le ghiandole salivari possano essere analizzati per l'infezione virale, l'infezione disseminata, l'infezione disseminata / potenziale trasmissione transovarica e l'infezione disseminata / potenziale competenza di trasmissione, rispettivamente8. La semplice presenza di un virus nelle ghiandole salivari, tuttavia, non è una prova definitiva della capacità di trasmissione, data l'evidenza di una barriera di fuga/uscita della ghiandola salivare (SGEB) in alcune combinazioni vettore/virus1,2,4,5,7,9. Il metodo standard per dimostrare la competenza di trasmissione rimane la trasmissione delle zanzare a un animalesuscettibile10,11,12. Tuttavia, dato che per molti arbovirus ciò richiede l'uso di modelli murini immunocompromessi13,14,15,16,questo metodo è spesso proibitivo in termini di costi. Un'alternativa comunemente usata è la raccolta della saliva della zanzara, che può essere analizzata mediante reazione a catena trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) o un test infettivo per dimostrare la presenza del genoma virale o di particelle infettive, rispettivamente. Vale la pena notare che tali metodi di raccolta della saliva in vitro possono sovrastimare12 o sottostimare17 la quantità di virus depositata durante l'alimentazione in vivo, indicando che tali dati devono essere interpretati con cautela. Tuttavia, il metodo in vitro è molto prezioso se analizzato dal punto di vista della semplice presenza di virus nella saliva, indicando il potenziale di trasmissione.
Esistono due approcci principali per determinare il ruolo dei vettori di zanzare nelle epidemie di malattie arbovirali. Il primo metodo prevede la sorveglianza sul campo, in cui le zanzare vengono raccolte nel contesto della trasmissione attiva18,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, dato che i tassi di infezione sono in genere piuttosto bassi (ad esempio, il tasso di infezione stimato dello 0,061% delle zanzare nelle aree di circolazione attiva del virus Zika (ZIKV) negli Stati Uniti21), l'incriminazione di potenziali specie di vettori può essere fortemente distorta dalla metodologia di cattura25,26 e dalla casualità (ad esempio, campionando un individuo infetto su 1.600 non infetti)21 . Tenendo conto di ciò, un determinato studio potrebbe non acquisire zanzare sufficienti sia in numero grezzo che in diversità di specie per campionare accuratamente le zanzare coinvolte nella trasmissione. Al contrario, le analisi della competenza vettoriale vengono eseguite in un ambiente di laboratorio, consentendo un controllo rigoroso di parametri come la dose orale. Sebbene non pienamente in grado di rappresentare la vera complessità dell'infezione da zanzara e la capacità di trasmissione in un ambiente di campo, queste valutazioni di laboratorio rimangono potenti strumenti nel campo dell'arbovirologia.
Sulla base di varie analisi di competenza vettoriale con ZIKV in diverse specie di zanzare, popolazioni e metodi27,28,29,30,31,32,nonché di una recente revisione delle valutazioni della competenza vettoriale1,descriviamo qui molti dei protocolli associati a un tipico flusso di lavoro di competenza vettoriale. In questi esperimenti, tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (la città di Salvador, Brasile; repubblica Dominicana; e la bassa valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un singolo ceppo di ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 o 6 log10 unità di focalizzazione (FFU) / mL dosi sotto forma di farine di sangue artificiali. Successivamente, sono stati analizzati per prove di infezione, infezione disseminata e competenza di trasmissione dopo vari periodi di incubazione estrinseca (2, 4, 7, 10 e 14 giorni) mediante dissezione e un test infettivo basato su colture cellulari. Sebbene l'attuale flusso di lavoro / protocolli sia ottimizzato per ZIKV, molti elementi sono direttamente traducibili in altri arbovirus trasmessi dalle zanzare nel contenimento degli artropodi e nei livelli di biosicurezza 2 e 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32&quot; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secondary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontamination</td></tr><tr><td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; feeding units</td></tr><tr><td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&amp;mu;g/mL, 50mL/Bottle</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal preparation</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &amp;deg;C), 250g/Bottle</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td></tr><tr><td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Plastic Plugs</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Power Unit (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; power source</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&amp;mu;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Developing solution for focus forming assay</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr></tbody></table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

Le procedure presentate descrivono una metodologia generalizzata per infettare le zanzare Aedes aegypti con il virus Zika in condizioni di laboratorio per determinare il tasso di infezione, l'infezione disseminata e la potenziale trasmissione del virus nella popolazione di zanzare in questione. Queste procedure sono ampiamente utilizzate con varie modifiche nelle valutazioni delle competenze vettoriali a livello globale. Sono importanti nel determinare il ruolo potenziale che una data zanzara (cioè specie, popolazione, individuo) può svolgere nella trasmissione di un determinato agente.

Tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (Salvador, Brasile; Repubblica Dominicana; e la Valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un ceppo epidemico di ZIKV dalle Americhe (ZIKV Mex 1-7, Stato del Chiapas, Messico, 2015) su una gamma di titoli di farina di sangue (4, 5 e 6 log10 FFU / mL) presentati in una farina di sangue artificiale a base di eritrociti umani lavati. Nei giorni 2, 4, 7, 10 e 14 postnfection, sottoinsiemi di zanzare sono stati elaborati per determinare l'i...

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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Il protocollo presentato può determinare la competenza vettoriale delle popolazioni di zanzare Aedes aegypti per un dato virus, come Zika, in un ambiente di contenimento.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

vector-competence-analyses-on-aedes-aegypti-mosquitoes-using-zika

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K Views.  University of Texas Medical Branch. Il protocollo presentato può determinare la competenza vettoriale delle popolazioni di zanzare Aedes aegypti per un dato virus, come Zika, in un ambiente di contenimento.

Video: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Ricerca

Genetica

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Editing del genoma nella zanzara della febbre gialla Aedes aegypti utilizzando CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Immunologia e infezioni

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantificazione di esaltazione anticorpo-dipendente del Virus in cellule umane primarie Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Biologia

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Utilizzo del colorante fluorescente, Rhodamine B, per studiare la competitività dell'accoppiamento nelle zanzare Aedes aegypti maschili

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Isolamento del virus associato alle zanzare dalle zanzare raccolte sul campo

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...