In questo video descriviamo una serie di procedure progettate per interrogare l'impatto di un'infezione virale e la conseguente risposta immunologica utilizzando un modello murino di infezione da Zika. Questo protocollo è significativo perché ci consente di sviluppare una comprensione meccanicistica dell'infezione e dell'immunità identificando la misura in cui un virus si è diffuso in tutto il corpo, trasversando le barriere fisiche e accedendo ai tessuti. Queste tecniche consentono una comprensione dettagliata della patogenesi virale e forniscono la capacità di sezionare il meccanismo di protezione fornito da vaccini o terapie.
Qui dimostriamo questo metodo usando l'infezione da virus Zika dei topi, ma questo metodo può essere applicato a una serie di infezioni virali tra cui altri flavivirus come il virus Dengue e alfavirus come il virus Chikungunya. Raccogliere gli organi del sistema nervoso centrale può essere impegnativo, quindi è importante che una persona pianifiche un piccolo esperimento ed essere pronta a praticare le tecniche in anticipo. Questo protocollo consente la rapida dissezione della diffusione virale all'interno di piccoli modelli animali con la capacità di visualizzare, catturare e archiviare dati sperimentali.
È importante dimostrare visivamente questo metodo per consentire allo sperimentatore di capire come raccogliere gli organi del sistema nervoso centrale. È anche importante vedere il livello di confluenza cellulare e l'intensità dei focolai virali. Per iniziare, utilizzare le forcep per rimuovere la pelle del mouse infetto.
Decapitare la testa del topo con le forbici, seguita dalla rimozione delle braccia e delle gambe. Per raccogliere il cervello, usa le forbici La Grange seghettate per tagliare il cranio attraverso il magnum del forame. Staccare il cranio con le forcep e raccogliere il cervello con una spatola.
Usando forti forbici smussate, rimuovere l'osso che circonda la colonna vertebrale, quindi tagliare l'osso pelvico per esporre il forame vertebrale a livello lombare. Quindi, rimuovere il più possibile il muscolo che circonda la colonna vertebrale. Con attenzione, posizionare la punta smussata dell'ago all'interno del foro vertebrale, evitando pressioni eccessive per evitare che l'ago sconfina nel corpo vertebrale.
Tenere forte per esercitare pressione sul corpo vertebrale e sull'ago e premere lo stantuffo della siringa per espellere il cavo nella piastra di Petri. Trasferire immediatamente il midollo spinale nel tubo etichettato e posizionare nel bagno di ghiaccio secco per un'ulteriore omogeneizzazione. Per l'omogeneizzazione, aggiungere un millilitro di DMEM e omogeneizzare il campione in un BeadBeater.
Dopo aver fatto in modo che gli organi siano omogeneizzati, centrifugare e aliquotare i campioni sul ghiaccio e conservare nel meno 80 gradi Celsius fino a quando necessario. Il giorno del test, rimuovere i campioni omogeneizzati dal congelatore meno 80 gradi Celsius e consentire loro di scongelarsi. Con i campioni sul ghiaccio, diluire il virus Zika dieci volte nel primo pozzo della piastra di diluizione e utilizzare una pipetta multicanale per fare dieci volte diluizioni seriali lungo la piastra, cambiando le punte ogni volta.
Aggiungendo 20 microlitri di campione in 180 microlitri di mezzi di crescita, cambiare le punte delle pipette tra ogni diluizione. Preparare la piastra di formatura della messa a fuoco rimuovendo il supporto dalla piastra piatta preparata a 96 pozzi che copre le virocelle. Per evitare che il monostrato si asciughi, aggiungere immediatamente 100 microlitri della diluizione del virus ad ogni pozzo nel viroplato.
Utilizzare lo stesso set di suggerimenti per aggiungere dalla concentrazione più bassa a la più alta. Piastra rocciosa da due a quattro volte e incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per una o due ore. Riscaldare il 2% di metilcellulosa a temperatura ambiente.
Quindi, diluire la soluzione del 2% di metilcellulosa nei mezzi di crescita con un rapporto di circa due a uno. Dopo l'incubazione, aggiungere 125 microlitri del supporto di crescita della metilcellulosa ad ogni pozzo delle piastre a 96 potte. Incubare di nuovo a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 32-40 ore.
Per fissare le virocelle, in un armadio di biosicurezza aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 5% sopra la parte superiore dello strato di metilcellulosa in ogni pozzo delle piastre a 96 potte. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. In alternativa, coprire le piastre con Parafilm e posizionarle a quattro gradi Celsius durante la notte.
Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere la sovrapposizione e mediare le cellule in un contenitore usa e getta all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Lavare delicatamente con 150 microlitri di PBS per pozzo. Rimuovere pbs dalle piastre e rimuovere la piastra dall'armadio di biosicurezza.
Ripetere il lavaggio PBS due volte, quindi aggiungere 150 microlitri per pozzo una volta il tampone di lavaggio FFA e lasciare a temperatura ambiente per cinque-10 minuti per permeabilizzare le celle fisse. Successivamente, usa l'anticorpo Zika primario per rilevare l'infezione. Preparare l'anticorpo primario 4G2 ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro nel tampone di colorazione FFA.
Far scorrere il tampone di lavaggio FFA dalle piastre e aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo primario nel tampone di colorazione FFA ad ogni pozzo. Quindi sigillare le piastre con Parafilm, o pellicola di plastica, e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Preparare l'anticorpo etichettato HRP anti-topo secondario ad una concentrazione da uno a 5.000 nel tampone di colorazione FFA.
Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale, lavare le cellule tre volte con 150 microlitri tampone di lavaggio FFA per pozzo. Rimuovere il buffer di lavaggio svolazzando ogni volta nel lavandino. Macchiare le cellule con l'anticorpo secondario nel tampone di colorazione FFA a 50 microlitri per pozzo e incubare da una a due ore a temperatura ambiente.
Successivamente, lavare le celle tre volte con il tampone di lavaggio FFA, di nuovo, rimuovendo il buffer di lavaggio svolazzando ogni volta nel lavandino. Aggiungere 50 microlitri del substrato TrueBlue in ogni pozzo. Attendere da due a 15 minuti fino a quando le macchie non sono completamente definite con uno sfondo minimo.
Dopo che le macchie sono visibili, lavare delicatamente con acqua usando una mano per proteggere il monostrato dalla forza dell'acqua che scorre. Toccare asciugare sugli asciugamani di carta. Poco dopo, utilizzare un ambito di sezionamento per contare manualmente i punti in ogni pozzo o utilizzare un contatore spot automatizzato.
Nel software ImmunoCapture, selezionare una diluizione con focolai facilmente distinguibili tra 20 e 200 per pozzo per ogni campione e calcolare il tricipite in unità di messa a fuoco per millimetro utilizzando la media dei pozzi duplicati. In questo esperimento, il carico virale è stato mostrato nei tessuti del sistema nervoso periferico e centrale dopo che ai topi Ifnar è stato somministrato il virus Zika per via sottocutanea. Il limite di rivelazione era compreso tra 100 e 500 FFU per grammo, basato sull'organo.
Quando si esegue il test di messa a fuoco, gli errori tecnici possono causare risultati non ottimali. La tossicità degli organi, guidata da un'alta concentrazione di fegato, ha alterato la sensibilità del saggio. Quando il titer virale nell'organo era inferiore alla tossicità, la FFA non riusciva a registrare con precisione i formicolio virali.
Le cellule renali hanno illustrato la tossicità con un'alta concentrazione di organi, ma sono state superate dal titolo virale a basse concentrazioni di organi. La pipettazione o il lavaggio vigorosi possono rimuovere il monostrato, portando a una perdita di dati che riportano in modo impreciso i risultati del titolazione. Fibre o peli presenti nella carta assorbente da banco da laboratorio, possono contaminare i singoli pozzi e causare errori significativi se si utilizza un programma di conteggio automatizzato.
La densità cellulare è un altro problema, che può avere un impatto drammatico sul successo di un saggio di messa a fuoco. Le cellule a circa il 60% di confluenza all'inizio del saggio, rispetto alle cellule placcate al 90% di confluenza, hanno mostrato una differenza drammatica che ha influenzato il saggio di formazione della messa a fuoco. Pianificare le dimensioni e la portata dell'esperimento in modo che la raccolta degli organi sia completata in modo efficiente, è la parte più importante della procedura, seguita dall'avvio del saggio di messa a fuoco con cellule di alta qualità.
Questa procedura è stata utilizzata per quantificare il virus per più famiglie virali. Questo protocollo può anche essere adattato allo schermo per i composti terapeutici e quantificare i tintori di anticorpi neutralizzanti. Queste tecniche sono utilizzate per quantificare il virus vivo e devono essere prese misure di sicurezza appropriate secondo le linee guida stabilite nel BMBL.
