Vorrei ringraziare i miei colleghi a MilliporeSigma, Philip J. Morrissey e Sherree L. Friend, per il loro sostegno e la loro guida negli anni. Vorrei anche ringraziare Vidya Venkatachalam e Bryan R. Davidson per il loro aiuto con la funzionalità BDC3 nel software IDEAS , Ryan P. Jessup per contribuire a modificare questo manoscritto, Raymond Kong per aiuto nel giorno della ripresa e un ringraziamento speciale All&#39;artista trucco Cynthia Xamonthiene.

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Sono impiegato da MilliporeSigma, il produttore dell&#39;immagine ImageStream di Amnis, che è stato utilizzato in questo studio.

Quando si esegue questa analisi, ci sono alcune cose da considerare. È importante avere campioni di controllo appropriati. Per questo esperimento sono stati utilizzati due diversi controlli: Controllo e Controllo + Chloroquine. Il campione di controllo è stato utilizzato per impostare la soglia per le regioni. Rappresenta il livello basale dell&#39;autofagia senza interrompere il degrado lisosomico ed è il controllo del campione di Starved. Tuttavia, il campione di controllo non è un controllo appropriato da confrontare con i risultati del campione di Starved + Chloroquine, in quanto il clorochina influisce sul campione di controllo. Pertanto, è stato necessario avere un campione Control + Chloroquine. Prima di effettuare qualsiasi analisi per l&#39;autofag, è importante analizzare / portare solo su singole celle che sono in messa a fuoco (ad esempio, gradiente RMS maggiore di 60), in quanto i risultati potrebbero essere influenzati se c&#39;è più di una cella o le immagini sono sfocato. È fondamentale che l&#39;autofagoEs e lisosomi sono al centro per il rilevamento corretto dei punti e l&#39;analisi BDC3. Le cellule apoptotiche devono essere rimosse prima dell&#39;analisi dell&#39;autofagia, in quanto possono risultare incline e non devono essere incluse. Ci dovrebbe essere una colorazione appropriata per tutti e tre i marcatori (ad es. LC3, p62 e LAMP1). Ad esempio, tutti e tre i marcatori sono intracellulari e devono avere un segnale punctato; Se il segnale non è punctato, o se è sulla superficie della cella, la colorazione non sarebbe appropriata e l&#39;esperimento / colorazione dovrebbe essere rifatta. Inoltre, affinché la BDC3 sia accurata, è fondamentale portare le celle che sono luminose per tutti e tre i marcatori fluorescenti di interesse. È necessario disporre di eventi positivi per impedire la misura di BDC3 su manufatti non specifici, artefatti di imaging e / o rumore. Ciò è cruciale, poiché BDC3 può potenzialmente amplificare gli artefatti che non sono veri segnali. Poiché BDC3 può essere eseguito solo su eventi luminosi positivi, molte celle potrebbero non essere incluse nell&#39;analisi finale; Questo è especVale per le celle di controllo che non hanno alcuna accumulazione di LC3, p62 e / o LAMP1. Pertanto, una limitazione di questo test è che BDC3 esamina solo le cellule positive per tutti e tre i marker, che potrebbero non essere appropriati per tutti gli esperimenti di autofagia. Come il BDS, che è stato precedentemente riportato 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 da solo non tiene conto del numero di organismi di autofagia che co-localizzano, risultando in larga misura Di variabilità nel numero di autofosomi. Pertanto, l&#39;approccio bivariato presentato da Rajan et al. era impiegato. Guardando le trame bivariate, si potrebbe chiedere seLe cellule devono essere positive per LC3, p62 e LAMP1; Perché ci sono tante cellule che hanno 0 punti? Questo perché il segnale LC3 potrebbe essere abbastanza luminoso per la co-localizzazione, ma potrebbe non soddisfare la soglia impostata dalla maschera di picco (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) necessaria per essere considerata una individuare. Il protocollo qui presentato ha usato il MIFC per contare puncta LC3 e la co-localizzazione di tre marcatori autofagia per misurare il flusso autofagico. In condizioni basali (campione di controllo), il numero di autofagosomi era basso e alcune cellule sono state trovate con &quot;High Spots&quot;. Con l&#39;aggiunta di clorochina, che inibisce la fusione di autosfosi / lisosomi, si è verificato un aumento del numero di macchie LC3. Dal momento che il lisosoma non è in grado di abbattere l&#39;autofagogo e il p62, che risiede nell&#39;autofago, ciò porta ad un aumento della co-localizzazione dell&#39;accumulo di autolysosomi LC3, p62 e LAMP1. Questo effetto è stato amplificato sotto lo starvat nutrienteIone, che induce autofagia. Tuttavia, senza l&#39;aggiunta di clorochina, non vi è stato un aumento significativo del numero di autofosomi, probabilmente a causa di un aumento del tasso di turnover autofagico. Quando le cellule sono state affamate in presenza di clorochina, vi è stato un aumento della co-localizzazione e il numero di autofosomi, che supporta la conclusione che la fame aumenta il flusso autofagico. EBSS è noto per essere un potente induttore di autofagia. Pertanto, si prevede che l&#39;aumento sia grande. Se si utilizza un altro metodo, ad esempio l&#39;induzione di farmaci, per indurre l&#39;autofagia, la differenza tra i controlli e quelli trattati può essere più sottile. Questo particolare protocollo è stato progettato per misurare l&#39;autofagia nelle linee cellulari umane, ma il dosaggio potrebbe essere adattato ad altre specie passando ad anticorpi per quella particolare specie. Inoltre, il metodo di analisi potrebbe essere utilizzato per qualsiasi applicazione intracellulare che richiede la co-localizzazioneDi tre sonde / marcatori.

Macroautophagy, qui di seguito denominato autophagy, è un percorso catabolico in cui i componenti danneggiati o disfunzionali, le proteine ​​a lungo termine e gli organelli sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati 1 . L&#39;autofagia è un processo dinamico e multistep che coinvolge la formazione di un autofago; La fusione dell&#39;autofaggo con il lisosoma, formando l&#39;autolysosoma; E il degrado del contenuto dell&#39;autolysosoma 2 . Il marcatore biologico cruciale utilizzato per identificare l&#39;autofagia nei sistemi di mammiferi è la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3) legata alla microtubula, che costituisce la membrana autofagosomica. Durante l&#39;autofagia, LC3-1 citosolico è coniugato alla fosfatidiletiletanolo per formare LC3-II; LC3-II è quindi incorporato nella membrana autofosfoma 3 . Un altro marcatore ampiamente utilizzato per il flusso autofagico è il sequestosoma 1 del recettore autofagico (SQSTM1, p62) che fisicamente liNks cargo autofagico alla membrana autofagica 4 , 5 . I metodi tradizionalmente utilizzati per misurare l&#39;autofagia sono blots occidentali e microscopia a fluorescenza 7 . Tuttavia, nessuno di questi metodi è considerato come &quot;standard d&#39;oro&quot; , 2 , 6 poiché ci sono sfide associate a entrambe queste tecniche. Le macchie occidentali danno solo una media perché usano un campione omogeneo, in modo che gli osservatori non riescano a vedere cosa succede nelle singole cellule. D&#39;altra parte, la microscopia a fluorescenza dà informazioni a livello di singola cellula, ma manca di capacità di trasmissione, rendendo difficile ottenere valutazioni oggettive e statisticamente rigorose. Negli ultimi anni la misurazione di LC3 e p62 mediante citometria a flusso di imaging multispectrale (MIFC, vedi tabella dei materiali ) sta guadagnando popuLeggerezza dovuta al suo potere quantitativo, alle capacità di trasmissione elevata, al potenziale di multiplexing e alla capacità di immagine di ogni cella. Uno dei metodi più utilizzati per misurare l&#39;autofagia utilizzando il MIFC, insieme al software di analisi companion (vedi tabella dei materiali ), è attraverso il conteggio a spot di LC3 puncta o autofagosomi 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Tuttavia, un aumento degli autofosomi non implica necessariamente un aumento dell&#39;autofagia, in quanto potrebbe anche rappresentare un blocco nel processo 2 . Il fatturato LC3-II è un parametro utile per misurare il flusso autofagico analizzando le cellule in presenza eAssenza di un inibitore della degradazione lisosomiale, come la clorochina. Il clorochina inibisce la fusione dell&#39;autofaggoma al lisosoma, consentendo così la quantitazione della formazione di autofaggo come misura del grado di autofagia arrestando il flusso autofagico prima che possa verificarsi il degrado lisosomico 18 . Inoltre, p62 è degradato principalmente da autofagia, e se la degradazione lisosomiale della autofagosoma e il suo contenuto è bloccato, un accumulo di p62 è previsto 17, 19. L&#39;autofagia è un processo multistep e la misurazione di LC3 o p62 da solo non fornisce un quadro completo di ciò che sta accadendo nelle cellule. Le pubblicazioni recenti hanno sottolineato la necessità di esaminare la formazione concorrente dell&#39;autolysosoma 2 , 17 , 20 , 21 . Il MIFC èunica in grado di misurare la formazione della autolysosome dal imaging del co-localizzazione del autofagosoma al lisosoma 15 - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Inoltre, è stata esplorata la co-localizzazione di p62 e LC3 utilizzando MIFC per misurare il flusso autofagico 5 . Nel software di analisi di riferimento, la &quot;funzionalità&quot; che misura la co-localizzazione è chiamata &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) ed è stata specificamente progettata per confrontare i piccoli dettagli luminosi di due immagini. BDS è il coefficiente di correlazione Pearson trasformato dal log con i punti luminosi localizzati con un raggio di 3 pixel o meno; In altre parole, il BDS calcola il grado di oConfronta pixel da due diversi canali fluorescenti. I punti luminosi sono correlati ( cioè, la stessa posizione spaziale) o non correlati ( vale a dire differenti posizioni spaziali). Pertanto, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l&#39;intervallo tra zero e infinito 26 , 27 . BDS da solo potrebbe non essere sufficiente; Rajan et al. Ha scoperto che l&#39;utilizzo di solo BDS potrebbe portare a risultati falsi positivi o falsi negativi 21 . BDS valuta la co-localizzazione di due marcatori di autofagia, ma non prende in considerazione il numero di autofosomi. Per tenere conto del numero di autofosomi, Rajan et al. Incluso il punteggio a punti della LC3 puncta 21 . Rajan et al. Ha proposto di utilizzare un diagramma di dispersione bivariato di punti spot LC3 contro BDS. Utilizzando questa trama bivariata, due popolazioni sono andateE in primo luogo identificato: uno con le cellule che hanno un alto livello di LC3 e uno con le cellule che hanno un basso livello di LC3 macchie. La popolazione a punti LC3 è stata ulteriormente classificata in due popolazioni: le cellule con bassa co-localizzazione ( ossia l&#39; accumulo di autofosomi) e le cellule con elevata co-localizzazione ( ossia l&#39; accumulo di autolysosomi). Questa trama bivariata permette di distinguere tra cellule con pochi autofosomi e cellule con un accumulo di autofosomi e / o autolysosomi 21 . Fino ad ora la co-localizzazione simultanea di LC3, p62 e LAMP1 (marker lizosomico) non era possibile utilizzando un singolo &quot;tipo di funzionalità&quot; nel software di analisi del companion MIFC (vedi tabella dei materiali ). Tuttavia, una nuova funzionalità, recentemente introdotta nella versione 6.1, si chiama Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 confronta le immagini del dettaglio luminoso da ciascuna delle tre immagini (in questo caso, LC3, p62 e LAMP1) e quantifica la co-localizzazione delle tre sonde ( es. LC3, p62 e LAMP1). La funzione BDC3 calcola il coefficiente di correlazione di Pearson modificato per estendersi a tre immagini. Poiché le macchie luminose nelle tre immagini sono correlate o non correlate, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l&#39;intervallo dinamico tra 0 e infinito. Attivando la funzione BDS con la funzione BDC3, il metodo di analisi presentato da Rajan et al. Ora possono incorporare i tre indicatori più utilizzati per misurare l&#39;autofagia in un unico sistema contemporaneamente. La capacità di co-localizzare questi tre marcatori di autofagia in un singolo dosaggio potrebbe portare a nuovi approfondimenti sull&#39;induzione e la regolazione dell&#39;autofagia. Il seguente protocollo descrive i passi per indurre l&#39;autofagia nelle cellule Jurkat; Etichettare le cellule con gli anticorpi LC3, p62 e LAMP1; Acquisire dati su un multispCitometro di flusso ectrale di imaging; E analizzare i dati per valutare il flusso autofagico.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &amp;micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&amp;nbsp; Concentration 2 mg/mL.&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&amp;nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&amp;nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&amp;nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&amp;nbsp; Potential cancer hazard.&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&amp;nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline 1X&amp;nbsp; Ca++MG++ free.&amp;nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate solution (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&amp;nbsp; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td></tr><tr><td>System Calibration Reagent - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Each tube holds ~10 mL.&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

L&#39;autofagia è un percorso catabolico in cui i componenti cellulari normali o disfunzionali che si accumulano durante la crescita e la differenziazione sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati. Durante l&#39;autofagia, la proteina LC3 citoplasmatica viene lipidizzata e reclutata alle membrane autofagosomali. L&#39;autofaggo quindi si fonde con il lisosoma per formare l&#39;autolysosoma, dove si verifica la rottura della vescicola di autofagosoma e il suo contenuto. La proteina associata con ubiquitina p62, che si lega a LC3, è anche usata per monitorare il flusso autofagico. Le cellule sottoposte a autofagia dovrebbero dimostrare la co-localizzazione di marcatori p62, LC3 e lisosomiali. La microscopia immunofluorescenza è stata usata per identificare visivamente LC3 puncta, p62 e / o lysosomi su base per cellula. Tuttavia, può essere difficile ottenere una valutazione oggettiva e statisticamente rigorosa. Per ovviare a questi problemi, è stata utilizzata citometria di flusso multispectrale di imaging e una caratteristica analitica che confronta la luminosità(LC3, p62 e lysosomal LAMP1) e quantifica la loro co-localizzazione in combinazione con il conteggio dei punti LC3 per misurare l&#39;autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Questo metodo di analisi utilizza molteplici funzionalità per assaggiare il flusso autofagico. Per comprendere appieno la trama bivariata finale, bisogna prima studiare le caratteristiche di analisi individuale. Il conteggio degli autofosomi è un modo logico per misurare l&#39;autofagia; Tuttavia, la dimensione / forma / luminosità di LC3 puncta può variare drasticamente tra le celle. La variazione può rendere difficile il conteggio manuale di autofagozomi o l&#39;utilizzo di una funzione spot-count nel software di analisi. Pertanto, nessuna funzione di conteggio dei punti sarà perfetta a causa di questa grande variabilità in autofosomi. Tuttavia, una buona funzione di conteggio dei punti funzionerà sulla maggior parte delle celle 26 . La figura 3 mostra esempi di maschera spot di LC3 puncta nelle celle Jurkat usando differenti maschere spot. La funzione di conteggio spot selezionata per questo set di dati è Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, il che significa che la funzione di conteggio spot conta i punti che il peMaschera AK individuata all&#39;interno del canale predefinito 11 maschera (M11) sul canale 11 (Ch11-LC3-AF647) con un rapporto di sfondo spot-to-cell 4 (Bright, 4). La Figura 4 mostra istogrammi di conteggio spot e immagini rappresentative per il conteggio spot medio per le cellule Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat etichettate con anti-LC3-AF647. I conteggi spot di Controllo e Starving non sono significativamente diversi; Con l&#39;aggiunta di clorochina, c&#39;è una grande differenza nella media del Control + Chloroquine rispetto alla Starved + Chloroquine. La prossima funzionalità da indagare è BDC3. BDC3 è una misura della co-localizzazione di tre marcatori / sonde, in questo caso, LC3, p62 e LAMP1. La Figura 5A - 5D mostra gli istogrammi BDC3 per le cellule di Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat etichettate con anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE e anti-LC3-AF647. C&#39;è uno spostamento tra la media del Controllo e la media Starved, così come il Control + Chloroquine media alla media di Starved + Chloroquine. Tuttavia, guardando le immagini delle cellule dai punteggi medi di BDC3 nella figura 5E - 5H , c&#39;è una maggiore differenza tra i campioni che gli istogrammi possono portare a credere. Questo perché BDC3 non prende in considerazione il numero di organi di autofagia che co-localizzano, con conseguente grande variabilità del numero di autofosomi per lo stesso punteggio BDC3. Nella maggior parte dei casi, vi sono sovrapposizioni tra tutte le tre sonde perché, anche a livelli basali, p62, LAMP1 e LC3 dovrebbero in una certa misura co-localizzare o risiedere in regioni simili nelle cellule. In contrasto, un esempio di tre sonde che non dovrebbero essere co-localizzate sono il colorante nucleare anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 e DAPI per il campione Starved + Chloroquine, mostrato in Figura 6. &lt;/ P&gt; Quando si combinano la funzione di conteggio dei punti e la funzione BDC3, è evidente la presenza di diverse sottopopolazioni che migliorano la capacità di distinguere tra i diversi campioni / condizioni. La figura 7 mostra la trama bivariata di conteggio spot di LC3 rispetto a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 per i quattro campioni: Controllo, Controllo + Chloroquine, Fame e Starved + Chloroquine. Il campione di Controllo è stato utilizzato per impostare la strategia di gating per tre popolazioni: Low Spots, High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3. I campioni di controllo hanno dimostrato che più del 98% delle cellule avevano 1 o meno punti. Il limite tra le High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3 è stato impostato su un punteggio BDC3 di 1 perché più del 91% del campione di controllo ha ottenuto un punteggio BDC3 inferiore a 1. Un riepilogo dei risultati dei plotter bivariati È mostrato nella tabella 1 . age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figura 1: Impostazione strumento MIFC. Uno screenshot delle impostazioni dello strumento MIFC utilizzato per questo esperimento descritto nel passaggio 8 del protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi Software Gating Strategy. Uno screenshot dello schema di analisi del software di analisi, descritto nel passaggio 9 del protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Maschera Spot LC3. Le immagini delle cellule Jurkat e le maschere utilizzate per creare la funzione di conteggio spot. Sono mostrati i picchi (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright 2) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5, 3, 1) e Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6, 2, 1). La maschera che ha funzionato meglio per tutte le celle mostrate era Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figura 4: istogrammi LC3 di conteggio dei punti. Utilizzando la funzione Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 e gli istogrammi di conteggio spot LC3-AF647 per controllo ( A , azzurro), Control + ChloroquinE ( B , blu), Fame ( C , rosa) e Starved + Chloroquine ( D , rosso). I conteggi spot medi per Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine sono rispettivamente 0,07, 1,13, 0,10 e 2,77. Sono mostrati i controlli di controllo (punti E , 0), controllo + clorochina ( F , 1 spot), Starved ( G , 0 spot), e Starved + Chloroquine ( H , 3 spot). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figura 5: istogrammi BDC3 di p62 / LAMP1 / LC3. Istogrammi BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 perR Controllo ( A , azzurro), Control + Chloroquine ( B , blu), Fame ( C , rosa) e Starved + Chloroquine ( D , rosso). Il punteggio medio BDC3 per Controllo, Controllo + Chloroquine, Fame e Starved + Chloroquine è rispettivamente di 0,57, 0,82, 0,74 e 0,98. BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (giallo); LC3-AF647 (rosso); E un composito delle immagini p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 di cellule rappresentative per il BDC3 medio sono mostrate per Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) e Starved + Chloroquine H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figura 6: istogrammi BDC3 di p62 / LC3 / DAPI per il campione Starved + Chloroquine. ( A ) L&#39;istogramma BDC3 p62 / LC3 / DAPI per il campione Starved + Chloroquine è mostrato. Il punteggio medio BDC3 è 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LC3-AF647 (rosso); DAPI (blu); E un composito delle immagini p62-AF488, LC3-AF647 e DAPI delle cellule rappresentative per il BDC3 medio è mostrato per il campione Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figura 7: Parti Bivariate di Count LC3 Spot Count nei confronti di BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parti bivariate di punti LC3 contro BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 per le cellule di controllo, controllo + clorochina, fame e starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (giallo); LC3-AF647 (rosso); E un composito delle immagini p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 provenienti da tre regioni ( cioè, punti bassi, alti punti / bassi BDC3 e High Spots / High BDC3) sono mostrati per il campione Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Cell Count </td><td> Bright Detail Colocalization 3 Medio </td><td> Punto di conteggio LC3 Mean </td><td> % Basso punto </td><td> % Alto punto / basso BDC3 </td><td> % Alto punto / alto BDC3 </td></tr><tr><td> Controllo </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0,07 </td><td> 98,2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> Control + Chloroquine </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Starved </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Starved + Chloroquine </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31,0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Sommario del conteggio di punti Jurkat LC3 contro BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l&#39;autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  MilliporeSigma.  Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto. 

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

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Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

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Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

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Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

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Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunologia e infezioni

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Biologia

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Flux-Based Assay for the Identification of Autophagy Modulators for Osteoarthritis

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify regulators of autophagy could be used for the identification of novel therapeutics. This article describes a cell-based imaging screening workflow developed to monitor autophagic flux using LC3 as a reporter of autophagic flux (mCherry-EGFP-LC3B) in human chondrocytes. Data acquisition is performed using an automated High Content Imaging Screening System microscope. An algorithm-based automated image analysis protocol was developed and validated to identify molecules activating autophagic flux. Critical steps, explanatory notes, and improvements over current autophagy monitoring protocols are reported. Physiologically relevant phenotypic screening approaches to target hallmarks of aging can facilitate more effective drug discovery strategies for age-related musculoskeletal diseases.

This paper details monitoring autophagy flux to identify new molecules by cell-based imaging screening.

Autophagy is a central mechanism to regulate homeostasis. Alterations of autophagy contribute to aging-related diseases. Phenotypic methods to identify ...